全 文 ：20 0 9 年 1 1 月
第 46 卷 第 6 期
四川 大学学报 ( 自然科学版 )
J o u rn a l o fS ie h ua n Un iv e s r it y( Na t u ra lS e ie n e e E d it ion )
N v o
.
20 0 9
V
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46 N o
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6
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1 0 39 6 9 / 1
.
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0 49 0
一
6 7 5 6
.
20 0 9
.
0 6
.
0 5 6
水葫芦根厌氧发酵与沙角衣藻生长偶联研究
刘 萍 , 耿小娟 , 刘 翔 , 傅华龙 , 兰利琼
(四 川大学生命科学学院 , 成都 6 1 0 0 6 4)
摘 要 : 对水葫芦采用不 同浓度 的 N a 0 H 预处理 ,研 究其对水葫芦厌 氧发 酵产 气量的影 响 .
在培养基 中分别加入 乙酸钠 、 碳酸氢钠和发酵上清液培养沙角衣藻 ,讨论对沙角衣藻生长 的影
响 . 结果发现 , 2% 浓度的 N a O H 预处理对根发酵产气最为有利 ,根叶混合物 经预处理后可获
得 8 02 . 6 m L / 1 0 0 9 新鲜底物 的最佳产气量 ; 以 乙酸钠作培养基碳源 , 沙角衣藻生物量能得到
明显积 累 ,可从初始 的 0 . 4 X 10 “ 个 / m L 达到 10 d 后 的 2 . 84 X 1 06 个 / m L
关键词 : 水葫芦根 ; 厌氧发酵 ; 乙酸钠 ; 沙角衣藻
中图分类号 : Q 9 4 文献标识码 : A 文章编号 : 0 4 9 0 一 6 7 5 6 ( 2 0 0 9 ) 0 6一 8 7 7 一0 5
A n a e r o b i e f e r m e n t a t i o n o f E i c h h o r n i a e
r a s s i P e s S o lm s r o o t s a n d
b i o m a s s a e e u m u l a t i o n o f C h l a m y d o m o n a s s a j i a o L e w i n
L I U 尸 i n g , G E N G X i a 。 一 J u a n , F U H u “ 一 L o n g , L A N L i 一Q IQ n g
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C h e n g d u 6 1 0 0 6 4
,
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A b s t r a e t : E i c h h o r n i a c r a s s i P
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S o lm s w a s p r e t r e a t e d w i t h d i f f e r e n t e o n e e n t
r a t i o n o f N a O H t o s t u d y t h e
i n f l u e n
e e o f p r e t r e a t io n o n g a s p
r o d u e t i o n v o l u m e
.
C H
3
C O O N a
、
N a H C O
3 a n d s u p e r n
a t a n t o f
a n a e r o b i e
f
e r m e n r a t i o n o f E i
c h h o r n i a c ar s s i P
e s S o lm s l i q u o r w e r e s e p a r a t e l y a d d
e
d i n t o e u l t
u r e m e d i u m o f
C人za m夕d o m o n a s s a j i a 。 L e w i n t o s t u d y t h e e f f e e t o f e a r b o n s o u r e e o n t h e g r o w t h o f a l g a e . T h e Z% e o n -
e e n t r a t i o n w a s t h e b e s t p r e t r e a t io n e o n e e n t r a t i o n f o r g a s p
r o d u e t i o n
, a n d e a e h 1 0 0 9 f r e s h s u b s t r a t e o f
t h e m i x t u r e ( o f r o o t s a n d l e a v e s ) p r o d u e e d 8 0 2
.
6 m L b i o g a s
.
A n d C H
3
C O O N a o b v i o u s l y p r o m o t e d t h e
g r o w t h o f C h l a m 夕d o m o n a s : a j i a o L e w i n , t h e b i o m a s s v a r i e d f r o m t h e i n i t i a l 0
.
4 X I O` a l g a e p e r m i l l i li t e r
t o t h e f i n a l 2
.
8 4 X 1 0 6 a l g a e p e r m i l l i l i t e r
.
K e y w o r d s : r o o t s o f E i c h h o r 刀 i a c r a s 、 i P e s s o lm s
, a n a e r o b i e f e r m e n t a t i o n
, s o d i u m a e e t a t e
,
C h l a m夕d o -
m o n a s s a j i a o l e w i n
1 引 言
近年 ,环境污染导致的水体富营养化使水葫芦
这种外来生物在我国不少江河湖泊大面积季节性
爆发 ,这为环境和生态带来 了严重影响川 . 水葫芦
综合治理的重要措施 之一是将其作为沼气厌氧发
酵的生物质能原料 ,并且对发酵后的沼液还 田以提
高农作物的产量和效益 .
国内外已有不少关于利用水葫芦厌氧发酵的
研究 〔“ 一月 ,但是现阶段的研究忽略了水葫芦厌氧发
酵过程 中根的重要性及特殊性 : 水葫芦根的鲜重 占
到整株植株鲜重的 50 % 以上 , 而根 的产气效率却
相对较低 . 因此本文着重研究 了提 高根厌 氧发 酵
产气量的碱预处理方法 ; 同时 ,引人可转化难溶性
收稿日期 : 20 0 8一 1 2一 3 1
基金项 目 : 四川 省青年科技基金项 目 (0 7 Z Q o 26 一。。 7)
作者简 介 : 刘萍 ( 10 8 3一 ) ,女 , 四 川成都人 ,硕士 , 主要从事水葫芦资源化利用研究 . -E m ial : iP n g _ iL u6 15 @ ya h o . co m . cn
通讯作者 : 傅华 龙 . E一 m a i l : fh u a l o n g s @ y a h o o . e o m . c n
18 7 8 四川 大学学报 ( 自然科学版 ) 第 4 6 卷
磷的土壤有益藻 沙角衣藻 [8, 习 , 以 乙酸盐模拟水葫
芦发酵上清液中的挥发性脂肪酸等碳源 ,研究乙酸
盐及发酵上清液对沙角衣藻生长的影 响 . 为水葫
芦的综合治理和发酵沼液的利用提供依据 .
2 材料与方法
2
.
1 材 料
2
.
1
.
1 水葫芦的采集培养 在成都市金堂县郊区
采集水葫芦新鲜完整植株 ,植人 2 . 5 m x 2 . 5 m x
0
.
3 m 规格的人工池塘蓄养 ,经过一个月左右时间
培养 , 已迅速在人工池塘繁殖 ,覆盖水面 ,可作厌氧
发酵试验材料 .
2
.
1
.
2 厌氧发 酵接种物 厌氧发酵接种物取 自中
国科学院成都生物研究所沼气发酵课题组 ,为猪粪
富集物 , 经本实验室加人水葫芦作发酵底物驯化 、
富集所得菌群 .
2
.
1
.
3 藻 种 沙角衣藻 ( C h la m y d o m o n a : : a -
j a o L e w in ) 由美 国 加 州 大 学 海 洋 生 物 研 究 所
L e w in 教授赠送 , 经本实验室培养 .
2
.
1
.
4 沙角衣藻培养基配 方 N a H C O 。 0 . 5 9 / L
,
( N H
4
)
2
5 0
; 0
.
1 9 / L
,
F e C 1
3 0
.
0 1 9 / L
,
K C I
0
.
0 5 9 / L
,
M g SO
4 · 7 H
Z
O 0
.
1 5 9 / L
,
C a ( N O
3
)
2
·
4 H Z O 1
.
5 9 / L
,
K Z H P O
; 0
.
5 9 / L
,
A S
,
B 6
2
.
2 方 法
2
.
2
.
1 水葫芦鲜重 比测定 分别于夏秋季 (5 一 10
月 )与冬春季 ( n 一 4 月 ) , 取人工蓄养池内的新鲜
水葫芦植株 ,每次随机采样 30 株 ,清洗后于室温下
阴干至表面无水分 , 材料仍保持新鲜 , 电子天秤测
定其鲜重 , 计算各鲜重百分比 ,对结果取平均值 .
相关计算公式为 :
根鲜重百分 比一 根鲜重 ( g ) /整株鲜重 ( g ) X
1 0 0 %
叶鲜重百分 比 一 叶鲜重 ( g )/ 整株鲜重 ( g ) 又
10 0 %
根叶 比 一 根鲜重 / 叶鲜重
2
.
2
.
2 厌氧发 酵前的 N a O H 预处理 取新鲜 的
水葫芦根 4 0 9 , 清洗 , 室温 下阴干 , 剪切至 1 C m
长短 , 平均分为 4 组 , 浸泡于 。 % 、 2 % 、 5% 、 8% 浓
度 的 N a O H 溶液中 (其 中 o % 处理组为同等体积
的蒸馏水 ,作空 白对 照 ) , 25 ℃恒温 48 h 处理后 ,
以蒸馏水 置换各 浓度的 N a O H 溶液而终止碱处
理 ,再用蒸馏水反复冲洗 ,浸泡过夜 ,备用 .
取蒸馏水浸泡过夜后 的水葫芦根 , 搅拌机 (功
率 3 OO W ,转速 1 1 0 0 0一 2 2 0 0 0 r / m i n )破碎 3 m i n
至外观呈紫黑色匀浆状 , 以此 4 组匀浆 为发酵底
物 , 以考察预处理 N a 0 H 的不 同浓度对根发酵产
气的影响 .
另取新鲜的水葫芦全株 ,拆分 为根与 叶两部
分 , 此处 叶定义为叶片 、 气囊和根状茎的总称 . 以
叶 1 0 0 9 , 根 10 0 9 , 根 叶混 合 物 1 0 0 9 ( 体 积 比
1 : 1) 3 组材料分别按 照上述方法清洗 阴干 , 2%
N a O H 碱处理后破碎为匀浆 , 以此 3 组 匀浆为发
酵底物 ,测定相 同浓度 N a O H 预处理下的发酵产
气结果 .
水葫芦材料碱性预处理的效果 ,采用碱处理后
的还原糖含量评价 . 还原糖的测定 方法参照宁正
祥 [` 。〕的方法 , 用 3 , 5一二硝基水杨酸 ( D N S ) 比色法
测定 . 采用 T 6 型分光光度计 , 在波长 4 50 n m 处
测定 O D 值 ,绘制葡萄糖吸光度 的标准 曲线 . 每一
相同浓度取 3 个平行样 , 每个平行 样重复测定 3
次 ,结果取均值 .
样品制备 :取水葫芦材料 40 9 ,平均分为 4组 ,
分别用 1 0 0 m L O% 、 2% 、 5% 、 8写 浓度的 N a O H ,
在 25 ℃ 下处理 48 h ,取 50 m L 处理后上清液 ,用 1
m ol / L 的 H C I调 整 p H 值 至 中性 或偏碱 性 ( p H
7
. 。一 7 . 5 ) ,定容至 10 0 m L , 为待测样 品 . 其测定
方法与葡萄糖标准溶液测定方法一致 .
碱处理后还原糖含量 (胖g / m L ) 一 样 品测 定
葡萄糖含量 (拼g / m L ) 又样 品稀释倍数
2
.
2
.
3 厌氧发酵试验 取前各组匀浆为厌氧发酵
底物 , 各组分别接种 10 0 m L 驯化后 的发酵菌液 ,
装人 I L 发酵装置中 ,置于 35 ℃恒温水浴锅发酵 .
从实验第 Z d 开始 ,早 晚每间隔 12 h 各记 录产气
量一次 .
2
.
2
.
4 乙酸盐及发酵上清液对沙角衣藻生长的 影
响 取 由水 葫芦 厌 氧发 酵处 理后 的混 合物 , 经
4 0 0 0 r / m i n 离心 2 0 m i n , 取上清 ,分装于 5 m L 圆
底连盖塑料离心管 ,密封灭菌 , 待冷却备用 .
取处 于对数生 长期 的沙角 衣藻 , 3 0 0o r / m in
离心 s m in , 用无碳培养基洗涤 3 次 ( 无碳 培养基
为沙角衣藻原培养基成分中去除碳源 ,其余成分相
同 ) , 备用 ,
根据沙角衣藻原培养基配方 , 改变培养基碳
源 ,保持培养基其它成分不变 , 以考察沙角衣藻生
物量积累与培养基碳源成分的关系 .
实验设计方案见表 1 其中第 4 组中 N a H C O 3
和 C H 3 C O O N a 浓度分别为 。 . 25 9 / L , 其 余各组
N a H C O
。 或 C H 3 C O O N a 浓度均为 0 . 5 9 / L ; 培养
第 6期 刘萍等 : 水葫芦根及氧发酵与沙角衣藻生长偶联研究 8 7 9 1
液体 积 150 m L, 发 酵上清液 添加 比 例为体积 比
1 0 %
.
表 1 培养基碳源成分
T a b
.
1 C
a r b o n s o u r e e in e u l t u r e m e d iu m
添加成分
1
.
0 7 1 1 ; 相关系数 R Z = 0 . 9 9 6 8 , 具有 良好的相关
性 .
水葫芦材料经过 N a 0 H 预处理 , 用 D N S 比色
法测定所得 的 O D 4 5。值 以及根据葡萄糖标准 曲线
回归方程计算所得还原糖含量见表 3 .
编号
N a H C O 3 C H
3
C O O N
a
10 % 发酵液
1 ( C K )
表 3 还原糖含最测定结果
T a b
.
3 C
o n t e n t s o f
r e
d
u e in g s u g a r
N
a
O H 浓度
(% )
O D 值 还原糖含量
( 拜g / m L )
0
.
0 3 4 1 14
.
7 4
十+
+一
0
.
0 4 2 13 4
.
6 7
0
.
0 1 3 5 7 6 7
+
7 一 + 十 0
.
0 0 3 2 9 5 8
注 “ + ” : 添加 , “ 一 ” : 不添加
3
.
3 水葫芦发酵产气结果
3
.
3
.
1 不 同浓度处理下 的 产气 量 以 0% 、 2 % 、
5%
、
8 % 4 个浓度梯度的 N a O H 溶液处理水葫芦
根并使其发酵 15 d ,产气量变化如图 1 所示 .
076
尸乃4j’)
ǎ日口à啊丫恢工
于上述各组培养基中分别接种出于对数生长
期的沙角衣藻 15 m L , 培养条件 : 光照 1 5 0 0一 2 0 0 0
lx
,温度 25 ℃ , 光暗比 12 : 12 . 采用显微镜计数
法 ,用血球计数板 在接种后 的 O , 2 , 4 , 6 d , 8 , 10 d
计数 ,测定藻液的浓度 . 每一组处理的沙角衣藻设
定 15 个平行 , 每次测定时随机取 3 个样 ,每个样品
计数 3 次 ,最后取平均值作为该样品的计数结果 .
3 结果与分析
3
.
1 水葫芦鲜重 比测定结果
水葫芦在不 同季节鲜 重比的测定结果如表 2
所示 .
可以看出 ,根在水葫芦的鲜重中占有很大的比
重 ,尤其在夏秋季水葫芦生长旺盛 的时候 , 根占到
了 6 5% 以上 . 因此 , 根的厌氧发酵利用是水葫芦
发酵利用的关键 .
表 2 不同季节水葫芦鲜重 比
T a b
.
2 R
a t io o f w
e i g h t f r o m d i f f e r e n t p a r t s o f f r e s h E ie h
-
h o r n i a c r a s s i P
e s
S
o lm s v a r ie d w it h s e a s o n s
3 5 7 9 1 1 1 3 15
时 I司 ( d )
一仲一空白对照 , 十 2& -」 r s% -长 - 8%
图 1
Fi g
.
1 G
a s
不 同 N a O H 浓度 处理下 的 产气量
y ie ld u p o n d i f f e r e n t e o n e e n t r a t i o n s o f
根鲜重
(% )
6 5
.
9 1
叶鲜重
(% )
根叶比 N a O H P r e t r e a t m e n t生长季
(根 , 叶 )
夏秋季
冬春季 5 7 . 0 8
3 4
.
0 9
4 2
.
9 2
9 3 :
33 :
3
.
2 N a 0 H 预处理结果
葡萄糖的含量 与 0 D 4 5。呈线性 相关 , 用 D N S
比色法在波长 45 0 n m 处测定 O D 值 , 得到葡萄糖
的标准 曲线 , 其 线性 回归方 程为 Y 一 1 3 5 . g X 十
在空白对照组中 ,产气开始时间为所有处理组
中最晚 ,于第 s d 开始 ,第 10 d 出现产气高峰 , 日产
气量 29 m L . 总产气量为 71 m L ; 2 % N a O H 浓度
处理组 ,产气开始于第 4 d ,在第 s d 和第 10 d 日产
气量分别为 52 m L 和 62 m L ,第 12 d 产气量出现
小幅回升 ,第 15 d 之后此组 可能还会出现 下一个
产气高峰 . 该组总产气量为 29 9 m L ; 5% N a O H 浓
度处理组 ,产气开始 时间最早 ,在第 3 d 开始 , 第 5
1 8 8 0 四 川 大学学报 ( 自然科学版 ) 第 4 6卷
d 和第 s d 日产气量分别为 2 6m L 和 28 m L ,此组
总产气量为 1 5 6 . 5 m L 邝 写 N a O H 浓度处理组 ,
产气开始于第 s d , 在整个 15 d 的产气记 录周期
中 ,仅有一个产气 高峰 , 位于第 s d , 日产气 量 29
m L
,此组总产气量为 125 m .L
3
.
3
.
2 不 同部位的产气量 水葫芦的不同部位分
别采用 2% N a O H , 25 ℃ , 48 h 的条件预处理后发
酵 , 15 d 内的产气量变化如图 2 所示 .
14 0
1 2 0
1 0 ( )
8 ( )
6〔)
4
.
0
ǎ日口、令乙工xà彭团坎界袱
时间 (d )
图 3
Fi g
.
3 I n
不 同碳源 时沙角衣藻生长 的影响
f l u e n e e o f d if fe r e n t e a r b o n s o u r e e o n t h e
ǎ闷日à咧矿恢口
g r o w t h
o
f C h l
a
m 夕 d o m o n a s s a j ia o L e w in
- , 卜 . 根 一借一叶 曰叻尸 混合物
图 2 水葫芦的 不 同部位 的 产气量
F ig
.
2 G
a s y i e ld f
r o m d i f f e r e n t p a r t s o f E i c h h o rn i
a
c r a s s i P
e s
S
o
lm s a f t e r N a O H p r e t r e a t m e n t
1 0 6个 /m L , 7 倍于初始浓度 ; N a H C 0 3 组终浓度 为
0
.
8 X 10 6 个 / m L ; N a H C O 3 + C H 3 C O O N a 组终浓
度为 1 . 2 又 10 ` 个 / m L . 三 组藻细胞浓度都呈现 出
随时间递增的单方向变化 .
沙角衣藻在添加 10 % 发酵上清液的三组培养
基 中 , 藻细胞浓度变化趋势如图 4 所示 .
5
9d1)
月U
9间
汗JU目
ō`巴J3
98州`6lb43q白100
ǎ日匕、令。Olxà戴契思继叶组第 s d 和第 n d 日产气量分别为 72 m L
和 9 0 m L ; 混合物组第 s d 和第 12 d 的 日产气量分
别为 8 3 m L 和 1 2 m L ;根组出现产气高峰 的时间
更加滞后和集中 ,第 s d 和第 10 d 的日产气量分别
为 52 m L 和 62 m L . 混合物组在 3 组底物中具有
最大 总产 气 量 8 0 2 . 6 m L 和最 大 日产 气 量 12 2
m L
. 其发酵产气的总体趋 势与 叶组基本相似 , 受
根组发酵趋势的影响不大 .
3
.
4 碳源及发酵上清液对沙角衣藻生长的影响
沙角衣藻在不添加发酵上清液的 3 组碳源及
空 白碳源组中的藻细胞浓度 的变化过程如图 3 .
空白对照组 , 沙 角衣藻 从初始 0 . 4 K 10 6 个 /
m L 增长到第 4 d 的 0 . 4 8 x 10 6个 / m L ; 之后 , 藻细
胞浓度逐步减少 , 到第 10 d 时 , 藻 细胞个数降至
0
.
09 x l护个 / m L , 显微镜下观察到藻细胞 出现解
体 ,颜色从绿变黄 .
其 余 3 组 的 藻 细 胞 浓 度 变 化 如 下 :
C H
3
C O O N a 组 I O d 后 , 藻细胞个数达到 2 . 8 4 X
时间 (d)
目 空白 . m% 发酵上清液
日 10% 发酵上清液 + N aH C o 、 D I O% 发酵上清液 + C H o C O O N a
图 4 发酵上 清液对 沙角衣藻生长的影响
F ig
.
4 I n f l
u e n e e o f s u p e r n a t a n t o n t h e g r o w t h o f
C h l
a m 夕d o m o n a s s a j i a o L e w i n
10 % 发酵上清液组 , 开始阶段藻生长受到抑
制 ,藻细胞浓度持续下降 ,但是第 s d 开始 ,此组的
藻浓度开始高于空 白对 照组 ,第 10 d 的终浓度 为
第 6期 刘萍等 : 水葫芦根厌氧发 酵与沙角衣藻生 长偶联研究 1 8 8 1
0
.
2 5 X 1 06个 / m L 高于空 白对 照组 的 0. 09X 1 06
个 / m L ; 1 0%发酵上清液十 Na HC 03组 , 藻浓度先
升高后下降 ,第 4 d 藻细胞浓度达到 0 . 54 X 10 6个 /
m L
,之后 , 藻细胞 浓度 降低 , 第 10 d 的终 浓度 为
0
.
3 2 X 1 0 6个 / m L ; 1 0%发酵上清液 + C H 。 C O O N a
组 , 藻浓度呈逐步上升趋势 , 第 Z d 到第 4 d , 沙角
衣藻的生长最为迅速 . 第 6 d 到第 s d 生长速度减
慢 ,第 10 d 藻细胞终浓度为 。 . 93 又 1 0 6个 /m .L
对 藻 类 生 长 具 有 抑 制 作 用 的 水 葫 芦 化 感 物
质 l[ ` , `幻 . 因此 ,水葫芦发酵上清液对沙角衣藻 生长
的促进作用 的机理需要进 一步加 以研究 和证明 .
沙角衣藻是一种有益的土壤藻类 ,可以拮抗土壤中
重金属离子 ls[ 〕 ,若沙角衣藻能有效利用 水葫芦发
酵后的上清液 ,则处理后的上清液与土壤有益藻沙
角衣藻共同还田 ,这对生态农业的发展有很好的推
进作用 .
4 讨 论 参考文献 :
门l曰一l习10自厂Lesrì
4
.
1 水葫芦厌氧 发酵最佳 N a O H 预 处理 浓度 和
最佳发酵底物
厌氧发酵产气的第一个峰 出现时间的早晚与
还原糖含量密切相关 : 还原糖含量 : 5% N a 0 H >
2 % N
a
O H > 8% N a O H > 空白对照与产气开始
的先后顺序基本一致 . 5% N a O H 预处理 , 虽然发
酵产气开始的时间最早 , 但后续产气效果不及 2%
碱处理 . 因此 , 从水葫芦厌 氧发酵利用的角度出
发 ,我们认为采用 2% N a 0 H 预处理浓度 最为适
宜 .
以根 、 叶混合匀浆作底物是最佳 的发酵底物 ,
产气结果优于以根或叶单独作底物 , 这可能是因为
以混合匀浆作发酵底物时 ,叶匀浆提供足量的有机
质如还原糖 , 而根匀浆相对稀松的结构有利于厌氧
发酵产出气的逸出 ,底物 内部维持较好的正压 ,也
有利于缓解微生物发酵过程中产物的反馈抑制效
用 .
这与之前 的关于水葫芦厌氧发酵的结论有所
不同 . 虽然水葫芦根的产气效力较低 , 但是通过适
宜的预处理方式可以有效提高根的发酵产气结果 ,
并且以混合底物发酵也是提高水葫芦厌氧发酵产
气结果的有效途径 .
4
.
2 乙酸盐和发酵上清液对沙角衣藻生长的影响
在本实验中 , 乙酸钠为外加碳源的培养条件对
沙角衣藻生物量的积累最为有利 ,这个结果在无发
酵上清液添加组和有发酵上清液添加组都得到 了
证明 . 厌氧发酵后的上清液对沙角衣藻生长 的影
响的作用在生长后期优于空白对照组 .
原因可能在于 ,厌氧发酵后上清液中含有的以
乙酸为代表的挥发性脂肪酸可能与乙酸钠对沙角
衣藻的作用具有同样的促进作用 ,且沙角衣藻对水
葫芦发酵上清液利用的可能性在本实验中得 到了
初步证明 .
但发酵上清液成分复杂 ,其中可能含有据报道
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〔责任编辑 : 白林含〕