全 文 ：ga ting bo th comm on ca ro tid a rte rie s and ce reb ra l ischem ia - repe rfusion in ra tw ere used to exp lo re the ce rebra l capillary perm eab ility and the
content o f superox ide d ism utasse(SOD), ma londiadehyde (MDA) in b lood se rum . In te rnal caro tid blood flow o f dog anesthetized w as mea s-
ured by electrom agne tic flowme ter to expiore the ce rebra l b lood flow and ce rebra l vascular re sistance. Resu lts:G inkgo lides injection at do se
o f 1. 5mg /kg could significan tly pro long the surv ival time and gasp duration, inhibited ce rebra l cap illa ry pe rm eability. A t dose o f 3. 0m g /kg
inc reased the content of SOD, reduced the content ofMDA in b lood se rum. A t dose o f 0. 75mg /kg significan tly increased the ce rebra l blood
flow and reduced the cerebral vascular resistance. Conc lu sion:G inkgolides in jec tion has improved effects on expe rim ental cereb ra l ischem ia
and ce rebra l b lood flow vo lum e.
　　K ey words　 ginkgo lides;cerebral ischem ia;ce rebra l cap illa ry pe rmeability;superoxide dism utasse (SOD);cerebral blood flow
土槿皮总萜抑制新生血管形成作用研究
代　勇 , 赵　因 1 , 徐世军 ,沈映君
(成都中医药大学 ,成都　 610075;1成都益因科技发展有限公司 , 成都　610041)
　　摘　要　目的:研究土槿皮总萜对于新生血管形成的抑制作用。方法:利用鸡胚绒毛尿囊膜(Chick cho rioa llantano ic mem-
brane, CAM)和 U14移植性小鼠宫颈癌模型。结果:土槿皮总萜在 CAM实验中 0. 4375 ～ 7mg生药 /m l 5个剂量组均显示出抗新生血
管形成活性 , 其中 0. 875mg原生药 /m l活性最强;在 U14荷瘤小鼠实验中 ,土槿皮总萜 0. 8、 1. 6、 3. 2g /m l均能明显降低肿瘤组织中
的微血管密度(MVD)。结论:土槿皮总萜对新生血管的形成明显抑制效果。
　　关键词　土槿皮总萜;新生血管形成;U14宫颈癌;鸡胚;微血管密度
　　新生血管形成是肿瘤生长 、发展的重要前提条件之一 , 以
血管形成各个环节为靶点 ,通过抑制血管形成来治疗血管形成
性疾病已经成为一个新的途径。 我们通过前期对 16种相关中
药的筛选试验 , 选择出作用最为明显的土槿皮对于血管形成抑
制作用的进行研究。土槿皮是松科植物金钱松 Pseudo la rix
kaem pferi Gord. 的根皮 , 含有土槿皮二萜类 、三萜类 、三萜内酯
以及甾醇类等有效成分 , 其中代表成分为土槿皮甲酸 、乙酸
(Pseudolaric ac id A、B)。现代研究表明土槿皮有抗真菌 、抗生
育 、抗肿瘤作用 [ 1] 。我们研究发现中药土槿皮总萜在鸡胚试验
中具有抑制新生血管形成作用 , 在 U14荷瘤小鼠试验中 , 土槿
皮总萜能够明显降低肿瘤组织中的微血管密度 (MVD)。现将
研究结果报告如下。
1　材料与方法
1. 1　试验药物　土槿皮总萜 , 由成都益因科技开发有限公司
提供 , 批号:050518,每克药粉相当于原生药材 330g;反应停片 ,
由江苏省常州市制药厂提供 ,批号:050413;康莱特注射液 ,浙江
康莱特药业有限公司 , 批号:0501271 - 2;雷公藤多苷片 , 由湖南
协力药业有限公司生产 , 批号:20040503;环磷酰胺粉针 , 由江苏
恒瑞医药股份有限公司生产 ,批号:050622。
1. 2　动物　新鲜非免疫罗曼鸡鸡胚 , 7 ～ 8日龄 ,由西南民族大
学生命科学与技术学院提供;KM 小鼠 , 体重 20 ～ 24g, 全♀, 一
级 , 由成都中医药大学实验动物中心 , 动物合格证:SCXK(川)
2004 -11;小鼠宫颈癌 U14株由成都中医药大学病理教研室提
供。
1. 3　试剂　 DAB显色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公
司 、小鼠抗 KDR单克隆抗体 ( IgG l)购自美国 S igm a公司 、二抗
及其它相应试剂购自北京中山生物技术有限公司。
1. 4　仪器 　 O lym pus 体视显微镜;O lym pus数码照相机 、
B io2000计算机医学图象处理分析系统。
1. 5　方法
1. 5. 1　土槿皮总萜抑制鸡胚尿囊膜上微血管形成　鸡胚消毒
后在气室上蛋壳上开 2×3cm的窗口 ,小心揭去内壳膜 , 把不同
浓度的土槿皮总萜(7、3. 5、 1. 75、 0. 875、 0. 4375m g原生药 /m l
五个浓度)、反应停 (1. 75m g /m l)、康莱特 (1. 75m g /m l)和雷公
藤多苷(1. 75m g /m l)200μl浸入预先制备并消毒 0. 2×0. 2×0.
2cm 左右的明胶海绵内 ,无菌条件下接种到鸡胚绒毛尿囊膜上 ,
4天后开始观察接种的明胶海绵周围血管生长情况 , 每日定时
观察 1次 , 详细记录 , 数码相机拍照留存 [ 2] 。 在植入含药明胶
海绵周围如果出现苍白的无血管区域 , 可判断该药物具有抑制
新生血管形成的作用 ,苍白无血管区的大小可以反映药物抑制
新生血管形成作用的强弱。
1. 5. 2　土槿皮总萜对移植性小鼠宫颈癌 U14新生血管形成的
抑制作用　300只小鼠按体重分层随机分为 10组 , 即空白组 、
模型组 、环磷酰胺粉针组 、康莱特组 、反应停组 、土槿皮总萜高 、
中 、低剂量组 、土槿皮总萜预防 ig组 、土槿皮总萜预防 ip组 , 动
物适应性喂养 3天后 , 右腋下消毒 , 将预先复苏的 U14肿瘤细
胞悬液(1×107细胞 /m l)按 0. 2m l /只皮下接种造模 , 预防组造
模前 3天开始给药 , 其余各组瘤株接种后第 2天开始给药 , 除环
磷酰胺粉针组 、康莱特组和预防 ip组腹腔注射给药外 , 其余各
组均为 ig给药 ,给药第 14天末次给药后 3小时随机取 15只处
死 ,分离肿瘤 , 10%中性福尔马林液固定 ,常规制片 , 备用。至实
验第 21天处死全部动物 ,同法制备标本。肿瘤组织石蜡切片常
规脱蜡 ,水化。切片进行 KDR免疫组织化学染色 , 计算肿瘤微
血管密度。MVD判断标准:KDR标记微血管 ,计算肿瘤内着色
29中药药理与临床 2007;23(4)DOI牶牨牥牣牨牫牬牨牪牤j牣cnki牣zyy l牣牪牥牥牱牣牥牬牣牥牨牭
的毛细血管和微小血管 ,按照 Weidner[ 3]的评判标准 , 凡呈现棕
色单个内皮细胞或内皮细胞簇均作为 1个血管计 , 但肌层较厚
及管腔面积大于 8个红细胞直径的血管不计数。 计数方法 ,首
先用 10×10低倍镜头扫视整张切片 ,确定微血管最密集的 3个
视野(新生血管热点区), 然后在较高倍数下(10×20)视野范围
内计数所有染色的微血管 ,取 10个视野计数结果的总数为该切
片的微血管数。
2　结果
2. 1　土槿皮总萜抑制鸡胚尿囊膜上微血管形成　正常尿囊膜
大血管充盈良好 , 色鲜红 , 可见明显的 2、3级分枝 , 在接种部位
可见放射性向接种中心趋向的微血管形成(如图 1)。土槿皮总
萜各浓度均表现出较强的抑制新生血管形成的作用 , 其中 0.
875和 0. 4375mg /m l的无血管区为最显著 (如图 2), 反应停和
康莱特接种部位也出现比较明显的无血管区(如图 3), 雷公藤
多苷片和阴性对照组鸡胚接种部位周围没有出现苍白的无血
管区。
图 1　生理盐水组鸡胚尿囊膜血管区(×10);　图 2　反应停组鸡胚尿囊膜无血
管区(×10);　图 3　土槿皮总萜 3. 5mg /m l组鸡胚尿囊膜无血管区 (×10)
2. 2　土槿皮总萜对移植性小鼠宫颈癌 U14新生血管形成的抑
制作用　结果见表 1。
　　表 1　造模后 14天 、 21天对小鼠宫颈癌 U14模型肿瘤组织 MVD
的影响 (–x±s)(条 /10HP)
组别 剂量(g /kg)
14天
小鼠(只 ) MVD
21天
小鼠(只) MVD
模型对照 15 131±12 11 132±18
环磷酰胺 0. 02 15 126±14 8 113±17*
康莱特 0. 25 15 104±7* 13 93±22**
反应停 0. 04 15 84±16** 11 77±9**
土槿皮总萜 3. 2 15 110±17* 12 102±13*
土槿皮总萜 1. 6 15 106±12* 14 104±19*
土槿皮总萜 0. 8g 15 79±14** 15 83±9**
土槿皮总萜预防 ig 1. 6 15 106±15* 12 104±12*
土槿皮总萜预防 ip 1. 6 15 106±17* 15 106±20*
　　与模型组比较 *P<0. 05, ** P<0. 01
　　从表 1可以看出 , 造模后 14天和 21天 , 肿瘤组织内微血管
密度土槿皮总萜组与模型组比较均具有显著统计学意义 , 提示
土槿皮总萜可以降低肿瘤组织内的微血管密度。土槿皮总萜
口服给药和腹腔注射给药表现类似的作用。
3　讨论
　　100多年前人们就已发现肿瘤组织较正常组织富含血管 ,
但人们对于肿瘤是否由由新生血管提供营养存在争议 , 大多数
人认为这种血管反应只是一种炎症反应 ,并非肿瘤生长所必需。
1971年 , Folkm an最早提出肿瘤生长是血管依赖性的 [ 5] 。 8年
后随着毛细血管内皮细胞培养技术的建立以及现代药物的研
究 ,这一观点为越来越多的证据所支持 , 并使这一领域成为肿瘤
研究的热点及肿瘤治疗的新策略 [ 6, 7] 。新生血管形成在正负调
节因子的作用下进行 ,当刺激因子的作用占主导地位而抑制因
子的作用占次要地位时 ,微血管密度增加。 研究人员在对多种
恶性肿瘤研究中发现 ,MVD越高 , 临床预后越差 , 因为正常组织
被肿瘤取代后 ,肿瘤需要诱导形成新血管以满足自身的血氧需
要 ,也就是说 , 血管形成愈丰富肿瘤生长旺盛 [ 7, 8] 。 由于肿瘤的
血管形成对肿瘤生长 、浸润 、转移整个反复连锁过程中明显依赖
影响 ,因此阻断肿瘤血管形成的环节 , 尤其是抑制血管内皮细胞
的生长以达到控制肿瘤的生存 , 成为肿瘤血管靶向治疗的重要
内容。
鸡胚绒毛尿囊膜 (chorioa llan to icm em brane CAM )模型是用
于研究促进和抑制新生血管形成的一个经典的模型。这个模型
有快速 、高效 、经济的特点 ,较之其它体外实验 , 如血管内皮细胞
培养 、血管环培养等方法更为直观 , 故广泛用于血管活性物质的
筛选 [ 2] 。移植性动物实体瘤也广泛用于针对新生血管形成的
研究之中 [ 3 ～ 5] 。我们使用 CAM模型对土槿皮总萜的抗血管生
成活性的研究反复进行了多次 , 最终确定了实验的具体剂量。
本次实验中鸡胚给药剂量从 7mg /m l至 0. 4375m g /m l均表现出
一定的抗新生血管形成活性 , 但活性最强的浓度为 0. 875mg /
m l。在 U14荷瘤模型中药物对 MVDDE影响也有类似趋势的结
果出现。这个特别的量效关系和 Fo lkm an在最近的论著中描述
的双相剂量 -反应曲线 (B iphasic Dose - response Curve)类
似 [ 4, 6] , 这个特点对临床中使用其它血管新生抑制物是一个重
要的提示 ,即高药物浓度不一定具有高效的药理作用。这种剂
量 -反应的非常规线性关系对于解释在抗肿瘤中药的研究过
程中频繁出现的剂量和疗效不同步的现象值得进一步的研究。
在荷瘤小鼠实验中发现 ,小鼠造模 14天后各组动物数目完
整 ,但 21天时除土槿皮总萜低剂量组与注射组外其余各组均有
动物死亡 ,其中以环磷酰胺组动物死亡数目最多 , 动物处死后发
现肝肾组织均有不同程度损害 , 这说明化疗药物具有较强的毒
性。其余各组动物死亡不等 ,其中模型组相对较少 , 估计与长期
灌胃损伤以及肿瘤后期生长过快有关。动物死亡情况对统计学
处理影响不大。实验结果显示土槿皮总萜能有效抑制实验性小
鼠宫颈癌新生血管形成的作用 , 从而降低肿瘤组织内肿瘤组织
内微血管密度 ,这种作用有可能对恶性肿瘤的生长和转移产生
明显的影响。我们将对土槿皮总萜的抗肿瘤作用 、抗新生血管
形成机理等进行进一步的研究。
参考文献
1　宋永峰 ,陈虹 ,李灵芝.土槿皮研究进展.天津药学 , 2001;13(6)∶ 9～
11
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6　Fo lkm an J, Ka lluri R. Can cerw ithout disease. N atu re, 2004;427∶787
桂枝挥发油对 LPS致大鼠急性肺损伤模型核因子 κB信号通路的影响
徐世军 , 沈映君* , 解宇环 , 金沈锐
(成都中医药大学 , 成都　 610075)
　　摘　要　目的:探讨桂枝挥发油对核因子 κB信号通路的影响。方法:制作 LPS诱导的大鼠急性肺损伤模型 , 通过桂枝挥发
油治疗后 , 采用 ELISA法检测肺组织细胞核蛋白 NF -κB P65含量和肺组织溶浆中磷酸化 IκB -α、 IL -1β 的含量。结果:正常大鼠
肺组织中 NF -κB P65、磷酸化 IκB -α和 IL -1β 仅有微量表达 , LPS尾静脉注射后 6h各其表达显著增高 , 桂枝挥发油高 、中 、低剂
量组 NF -κB P65、磷酸化 IκB -α和 IL -1β 的含量均较模型组显著降低。结论:桂枝挥发油对急性肺损伤时高度活化的核因子 κB
信号通路有显著的抑制或拮抗作用 ,提示核因子 κB信号通路是桂枝挥发油抗炎作用的主要靶点之一。
　　关键词　桂枝挥发油;急性肺损伤;核因子 κB信号通路
　　我们前期研究表明桂枝挥发油 ( the Vo latile o il of Ram ulus
Cinnam om i, VORC)对急性 、慢性和免疫损伤性炎症均有显著的
拮抗作用 , 其作用与抑制花生四烯酸代谢等有关 [ 1] 。 NF -κB
是细胞内一个极其重要的转录因子 , 参与免疫应答 、淋巴细胞
分化和生长调控等生物效应 , 能调节多种炎症介质和免疫基因
的表达 , 特别是与机体防御反应有关的即早基因的表达调控 ,
NF -κB活化后进入细胞核 ,导致与炎症免疫有关的基因表达 ,
是炎症反应的中枢环节 [ 2 , 3] 。为探讨 VORC的抗炎作用机制 ,
我们研究观察了 VORC对大鼠急性肺损伤模型核因子 κB信号
通路的影响。
1　材料与方法
1. 1　试验药物　桂枝购自成都同仁堂连锁大药房 , 经成都中
医药大学生药学王光志博士鉴定为中药桂枝 (Ramu lus C innam-
om i)的干燥嫩枝;醋酸地塞米松注射液 , 西南药业股份有限公
司产品 , 批号:66040099。
1. 2　动物　健康 SD大鼠 60只 , 体重 (180±20)g, 全♂, SPF
级 , 由成都中医药大学药实验动物中心提供 , 实验动物合格证
号为:SCXK(川)2004 -12。
1. 3　试剂 　大肠杆菌内毒素(LPS , E. Co li, O111:B4), S igm a
公司产品 , 临用前用注射用生理盐水配成 0. 1m g /m l备用;NF -
κB p65 、 IκB -α和 IL -1β 检测试剂盒 ,均为上海康成生物工程
有限公司产品 , 批号分别为 200504、 2005204和 200506。
1. 4　仪器　Mu ltiskan MK3酶标仪 , Therm o公司产品;Biofuge
stra tus台式高速冷冻离心机 , 德国 Heraeus公司产品;JY96 - II
超声波细胞粉碎机 , 宁波新芝科器研究所产品。
1. 5　方法
1. 5. 1　 VORC的制备 、鉴定　VORC按 2005版《中华人民共和
国药典》(一部)附录 X挥发油测定项中乙法提取 , 棕色瓶密
闭 、4℃冰箱保存备用;提取得挥发油后精密量取 1m l, 置于
100m l容量瓶中 ,加无水乙醇稀释至刻度 , 摇匀 , 作为待测样溶
液 ,送中国科学院成都分院化学所进行 GC M/ S分析。气质联用
系统条件:HP - INNOW aX毛细管柱(0. 2mm ×30mm);载气:氦
气 ,分流比(脉冲不分流)40∶1,流量:0. 7 ～ 1. 0m l /m in, 柱温:起
始 60℃保持 10m in后以 20℃ /m in升温至 120℃保持 5m in, 后以
10℃ /m in升温至 160℃保持 10m in, 后以 10℃ /m in升温至
240℃;检测质荷比范围 20 ～ 450, 离子源温度 230℃, 倍增电压
1500eV)直接进样。
1. 5. 2　VORC对 LPS致急性肺损伤大鼠 NF -κB通路的影响
　大鼠称重随机分为 6组 , 在试验条件下适应性喂养一天后开
始给药或等容生理盐水 ,连续 ig 5天 , 地塞米松组于正式试验前
ip注射地塞米松 5m g /kg。末次给药 1h后尾静脉注射 LPS 1mg /
kg或生理盐水 , 6小时后处死 , 无菌条件下取肺 , 用无菌滤纸吸
干净肺脏表面的血液后锡箔纸包裹 ,编号 , - 70℃低温冰箱保存
备用。
　　精确称取肺组织 100mg, 按照 NF -κB p65 ELISA检测试剂
盒提供的提取试剂提取细胞核蛋白 , 按照试剂盒说明测定蛋白
含量后 ,然后按照 ELISA检测试剂盒说明书测定 NF -κB p65,
最后以每个样品蛋白含量进行校正 , 计算出每毫升中 NF -κB
p65的含量;精确称取肺组织 100g,按照 IκB -αELISA检测试剂
盒提供的提取试剂提取总蛋白 , 按照试剂盒说明测定蛋白含量
后 ,然后按照 ELISA检测试剂盒说明书测定磷酸化的 IκB -α,
最后以每个样品蛋白含量进行校正 , 计算出每毫升中磷酸化的
31中药药理与临床 2007;23(4)
* 通讯作者