全 文 ：云南松松塔中莽草酸的提取工艺研究
张志琴1，2，刘光明1，杨永寿1，肖培云1* (1．大理学院药学院，云南大理 671000;2．楚雄医药高等专科学校，云南楚雄 675005)
摘要 ［目的］优选云南松松塔中莽草酸的最佳提取工艺。［方法］在单因素试验的基础上，采用 L9(3
4)正交试验优化云南松松塔中莽
草酸的提取工艺。［结果］最佳提取工艺为:浓度80%甲醇为提取剂，料液比为1∶ 40(g /ml)，超声提取2次，每次20 min。［结论］优化后
的提取工艺简单、稳定、提取率高。
关键词 云南松(Pinus yunnanensis Franch);松塔(PINECONE);莽草酸;正交试验
中图分类号 S567 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611(2011)30 －18512 －02
Extraction Technology of Shikimic Acid from the Pine Cone of Pinus yunnanensis Franch
ZHANG Zhi-qin et al (College of Pharmacy，Dali University，Dali，Yunnan 671000)
Abstract ［Objective］The aim was to select the optimal extraction technology for the shikimic acid from the pine cone of Pinus yunnanensis
Franch． ［Method］On the basis of single factor test，the extraction technology of shikimic acid from the pinecones of P． yunnanensis was optimized
by L9(3
4)orthogonal test． ［Result］The optimum extraction technology was as follows:80% methanol as solvent，1∶ 40 solid － liquid ratio，ultra-
sonic extraction for 2 times，and 20 minutes for each time． ［Conclusion］This optimized process is simple，stable and efficient．
Key words Pinus yunnanensis Franch;Pine cone;Shikimic acid;Orthogonal test
基金项目 国家自然科学基金资助项目(30860365)。
作者简介 张志琴(1979 － ) ，女，白族，云南大理人，在读硕士，讲师，从
事中药材及其制剂质量研究，E-mail:cxyzzzq@ 163． com。*
通讯作者，副教授，硕士生导师，E-mail:xpy990120 @ 126．
com。
收稿日期 2011-07-11
莽草酸(Shikimic acid)是高等植物和微生物中莽草酸途
径的中间产物［1 －2］。莽草酸具有镇痛、抗血栓、抗炎和抗HIV
的效用［3 －4］，并且，目前在临床上该化合物是用于合成治疗
H5Nl亚型高致病性禽流感唯一有效的药物“达菲”的关键中
间体［5］，这使得莽草酸具有极大的开发价值。目前，莽草酸
主要是从八角茴香或莽草(野生八角)的成熟果实中提取出
来的，资源十分有限，而莽草酸的人工合成由于反应条件苛
刻、成本高而难以满足市场需求，因此有必要筛选廉价的莽
草酸提取原料。
松塔(PINECONE)系松科(Pinaceae)松属(Pinus)植物
的球果，又名松果。其植物来源有华山松、云南松、红松、油
松、思茅松等，而分布在云南的云南松(Pinus yunnanensis
Franch)资源十分丰富，其松塔主要被农民当作燃料烧掉。
已有报道证实云南松松塔中含有莽草酸［6］，因此笔者选择松
塔为试材对云南松松塔中莽草酸的提取工艺进行了研究，以
期为莽草酸的来源提供新的途径。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 研究对象。云南松松塔(PINECONE) ，2010 年 9 月
采自云南省大理地区。粉碎，过 80 目筛，保存于阴暗处，
备用。
1． 1． 2 主要仪器。Agilent 1200 型高效液相色谱仪，购自于
美国 Agilent公司;TU-1901 双光束紫外可见分光光度计，购
自于北京普析通用仪器有限责任公司;AL204-IC电子分析天
平，购自于梅特勒 －托利多仪器有限公司;SB5200DT型超声
波清洗机，购自于宁波新芝生物科技股份有限公司;DZKW －
4电子恒温水浴锅，购自于上海科析试验仪器厂。
1． 1． 3 主要试剂。莽草酸对照品，购自于成都曼斯特生物
科技有限公司(批号 A0112) ;流动相用甲醇，为色谱纯，购自
于 Fisher公司;其余均为国产分析纯。
1． 2 方法
1． 2． 1 对照品溶液的配制。取莽草酸对照品 10 mg，精密称
定，置 10 ml量瓶中，加流动相浓度为 100%甲醇溶解并稀释
至刻度，摇匀，使成为 1． 012 mg /ml的对照品储备液。
1． 2． 2 供试品溶液的制备。称取松塔粉末 0． 5 g置于 50 ml
圆底烧瓶中，在不同条件下(甲醇浓度、料液比、提取时间、提
取次数)50 ℃超声提取，提取液用离心法分离沉淀，上清液
合并并定容置 50 ml容量瓶中，用 0． 45 μm滤膜过滤，备用。
1． 2． 3 色谱条件。Phenomenex Gemini-NX C18 110A(4． 6 mm
×250 mm，5 μm)色谱柱;浓度为 100%甲醇 －浓度 1%磷酸
水溶液(15∶ 85，V /V)为流动相;流速 1 ml /min;柱温 30 ℃;检
测波长 215 nm，进样量 10 μl。理论塔板数按莽草酸峰计不
低于 5 000。
1． 2． 4 标准曲线的绘制。分别精密量取对照品储备液 0． 1，
0． 4，0． 8，1． 2，1． 6，2． 0 ml 置 10 ml 量瓶中，用流动相溶液稀
释至刻度，得梯度浓度的对照品溶液。分别精密吸取上述对
照品溶液 10 μl注入高效液相色谱仪中，测定其峰面积。以
莽草酸进样浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归计
算，得回归方程 Y =3 043． 7X +117． 6，R =0． 999 7。测定结果
显示，莽草酸在 10． 12 ～202． 4 μg /ml范围内线性关系良好。
1． 2． 4 单因素试验。
1． 2． 4． 1 甲醇浓度的选择。在提取时间为 30 min，提取次
数为 1 次，料液比为 1 ∶ 40(g /ml)的条件下，分别用浓度
40%、50%、60%、70%、80%、90%甲醇常温超声提取，考察不
同甲醇浓度对莽草酸提取率的影响。
1． 2． 4． 2 料液比的选择。在提取时间为 30 min，提取次数
为 1次，甲醇浓度为 80%条件下，分别按料液比为 1 ∶ 10、
1∶ 20、1∶ 30、1∶ 40、1∶ 50、1∶ 60(g /ml)常温超声提取，考察不同
料液比对莽草酸提取率的影响。
1． 2． 4． 3 提取时间的选择。在料液比为 1∶ 40(g /ml) ，提取
次数为 1次的条件下，用浓度 80%的甲醇常温分别超声提取
15、30、45、60、75、90 min，考察不同提取时间对莽草酸提取率
的影响。
责任编辑 石金友 责任校对 况玲玲安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2011，39(30):18512 － 18513，18515
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2011.30.029
1． 2． 4． 4 提取温度的选择。在提取时间为 30 min，料液比
为 1∶ 40(g /ml)的条件下，用浓度 80%甲醇在分别 30、45、60、
70 ℃各提取 1 次，考察不同提取温度对莽草酸提取率的
影响。
1． 2． 5 正交试验设计。在单因素试验的基础上，选择甲醇
浓度(A)、料液比(B)、提取时间(C)、提取次数(D)为考察因
素，以莽草酸得率为考察指标，进行 L9(3
4)正交试验(表 1)。
表 1 因素水平设计
Table 1 Design of factors and levels
水平
Level
因素 Factor
甲醇浓度 A
Volume fraction of
methanol∥%
料液比 B
Solid-liquid
ratio∥g /ml
提取时间
Extraction
time C∥min
提取次数 D
Extraction
times∥次
1 60 1∶ 20 20 3
2 70 1∶ 30 30 2
3 80 1∶ 40 40 1
2 结果与分析
2． 1 单因素试验
2． 1． 1 甲醇浓度的选择。由图 1 可知，莽草酸得率随着甲
醇浓度的增加先增大后减小，当甲醇浓度为 80%时，莽草酸
的提取率最高，之后浓度增加提取率反而降低。因此甲醇浓
度选择 80%时最适宜。
2． 1． 2 料液比的选择。由图 2 可知，莽草酸的得率随着料
液比的增加而增加，但当料液比为1∶ 40(g /ml)之后增幅已不
明显，从节约试剂角度出发，选择料液比为 1∶ 40(g /ml)。
2． 1． 3 提取时间选择。由图 3 可知，莽草酸得率随提取时
间的增加而增大，但 30 min后得率已基本趋于平稳，因此选
择提取时间为 30 min。
图 1 甲醇浓度对莽草酸提取率的影响
Fig． 1 Effects of methanol concentration on the extraction rate
of shikimic acid
图 2 料液比对莽草酸提取率的影响
Fig． 2 Effects of solid-liquid ratio on the extraction rate of
shikimic acid
图 3 提取时间对莽草酸提取率的影响
Fig． 3 Effects of extraction time on the extraction rate of
shikimic acid
图 4 提取温度对莽草酸提取率的影响
Fig． 4 Effects of extraction temperature on the extraction rate
of shikimic acid
2． 1． 4 提取温度的选择。由图 4 可知，莽草酸得率随温度
升高先升高后降低，45 ～ 60 ℃时增幅最大，故综合考虑选择
提取温度为 50 ℃。
2． 2 正交试验 由表 2 可知，各因素对松塔中莽草酸提取
率的影响顺序为 D ＞ B ＞ A ＞ C，即提取次数 ＞料液比 ＞甲醇
浓度 ＞提取时间，据测定结果 D1 和 D2 的 K值差异不大，从
省时节能、降低成本的角度出发，优选出最佳提取工艺为
A3B3C1D2，即用浓度 80%甲醇，料液比为 1∶ 40(g /ml) ，超声
提取 2次，每次 20 min。
表 2 L9(3
4)试验安排和结果
Table 2 Result and design of L9(3
4)orthogonal test
序号
No A B C D
莽草酸含量
Content of shi-
kimic acid∥mg /g
1 1 1 1 1 6． 34
2 1 2 2 2 6． 24
3 1 3 3 3 5． 36
4 2 1 2 3 4． 61
5 2 2 3 1 6． 26
6 2 3 1 2 6． 82
7 3 1 3 2 6． 52
8 3 2 1 3 5． 71
9 3 3 2 1 7． 34
k1 5． 98 5． 82 6． 29 6． 65
k2 5． 89 6． 06 6． 06 6． 52
k3 6． 52 6． 50 6． 04 5． 22
R 0． 63 0． 68 0． 24 1． 42
2． 3 验证试验 精密称取云南松松塔 0． 500 g，按最终确定
(下转第 18515页)
3158139 卷 30 期 张志琴等 云南松松塔中莽草酸的提取工艺研究
书方差分析，将 A作为误差，B 对试验结果影响有显著性差异
(P ＜0． 05) ，而 C、D 无显著性影响。综合分析表明，党参多
糖含量最佳提取工艺是 A2B1C1D3。
表 1 水提法正交设计
Table 1 Orthogonal design water formulation
水平
Level
因素 Factor
A浸提
温度
Extraction
temperature∥℃
B浸提
时间
Extraction
time∥h
C料液比
Solio
liquid ratio
g /ml
D 次数
Extraction
times
1 70 2 1∶30 1
2 75 3 1∶40 2
3 80 4 1∶50 3
表 2 多糖含量测定结果及分析
Table 2 Determination results and analysis for polysaccharide content
试验号
No．
因素和水平 Factors and levels
A B C D
总多糖含量
Content of pol-
ysacchandes∥%
1 1 1 1 1 18． 86
2 1 2 2 2 15． 22
3 1 3 3 3 21． 51
4 2 1 2 3 20． 85
5 2 2 3 1 15． 57
6 2 3 1 2 21． 73
7 3 1 3 2 18． 40
8 3 2 1 3 19． 46
9 3 3 2 1 20． 17
k1 18． 530 19． 370 20． 017 18． 200
k2 19． 383 16． 750 18． 747 18． 450
k3 19． 343 21． 137 18． 493 20． 607
R 0． 853 4． 387 1． 524 2． 407
2． 2 方法学考察
2． 2． 1 精密度试验。按照以上方法，对供试液进行连续的 5
次测量，进行精密度试验，RSD为 0． 32%，表明精密度良好。
2． 2． 2 稳定性试验。取供试液，每 30 min测量 1 次，连续测
定 3 h，进行稳定性试验，RSD为 2． 35%，表明在 3 h内稳定。
3 结论与讨论
(1)试验采用的是苯酚硫酸法测定多糖的含量，与蒽酮
硫酸法比较，具有价格便宜、简单的优点。
(2)试验通过正交试验优选出了党参多糖的最佳提取工
艺，而且党参多糖的含量在 20%左右，具有很高的开发价值，
为党参的质量评价标准以及新资源的开发利用提供了一定
的理论依据，并为开发出其潜在的临床和药用价值提供
依据。
参考文献
［1］赵云生，李占林，田洪岭，等．党参种质资源生态多样性研究［J］．中国
农学通报，2007，23(11):361.
［2］刘恩荔，秦雪梅．党参研究进展［J］．山西医科大学学报，2002，33(6):
567 －569.
［3］朱恩圆，贺庆，王峥涛，等．党参化学成分研究［J］．中国药科大学学报，
2001，32(2):94 －95.
［4］杨静，苏强，刘恩荔，等．不同产地党参苍术内酯Ⅲ和党参炔苷含量测定
［J］．山西医科大学学报，2010，41(8):698 －699.
［5］咸丰，李发胜．苯酚 －硫酸法测定党参多糖含量［J］．沈阳部队医药，
2006，19(3):176 －177.
［6］宋艺君，郭涛．党参多糖提取纯化工艺的研究［J］．现代中医药，2010，30
(3):77 －79.
［7］REN B，KANG J H，WU H L，et al． Effect of different concentrations of
pesticide － imidacloprid on the main secondary metabolites of fruit and pol-
ysaccharide of Chinese wolfberry［J］． Agricultural Science ＆ Technology，
2010，11(8):28 －31．
［8］牛华星，李迎梅，尹旭升，等．植物多糖生物活性的研究及其在畜牧业
中的应用［J］．畜牧与饲料科学，2009，30(9):165 －166．
［9］SUN J，YIN G Y，CHEN L Y． Extraction of pumpkin polysaccharide by
complex enzyme method and its antioxidant research［J］． Agricultural Sci-
ence ＆ Technology，2010，11(5):34 －37．
［10］吴旋，白东清，杨广，等．灵芝多糖对黄颡鱼免疫细胞活性的影响［J］．
华北农学报，2011(3):195 －198．
［11］CHENG F Y，LI C G，LIU Y W，et al． Optimization and testing for PCR
system of rice by orthogonal design［J］． Agricultural Science ＆ Technolo-
gy，2010，11(2):61 －64．
［12］胡涛，周凌云，卜登攀，等．脂多糖诱导奶牛细胞因子及其他相关物质
变化研究进展［J］．华北农学报，2010(S2):
檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪
144 －148．
(上接第 18513页)
的提取工艺条件提取，重复 5 次，测得莽草酸的平均含量为
7． 24 mg /g，RSD值为 0． 96%，表明该工艺条件合理、稳定。
3 结论与讨论
活性成分莽草酸既溶于醇又溶于水，经预试验结果表
明，采用甲醇超声提取莽草酸的量高于用水和乙醇超声提取
及用水煎煮提取，故试验选择甲醇作为溶媒进行超声提取。
对莽草酸对照品溶液进行全波长(190 ～ 400 nm)扫描，
其最大吸收波长为 210 nm，在相同色谱条件下对 210、215、
217、220 nm几个波长处进行考察，结果显示在 215 nm波长
处基线平稳且峰形较好，故选择 215 nm作为检测波长。
天然植物的药用成分大多为细胞内产物，提取时需要将
细胞破碎。利用超声波产生的强烈震动、高的加速度和强烈
的空化效应等特殊作用，可以破坏药材的细胞壁，使溶媒渗
透到药材细胞中，以便使药材中的化学成分溶于溶媒中［7］。
笔者采用甲醇超声提取，具有效率高、节能省时的优点。
参考文献
［1］HERRMANN K M． The Shikimate Pathway:Early Steps in the biosynthesis
of aromatic compounds［J］． Plant Cell，1995，7(7):907 －919．
［2］PITTARD J，WALLACE B J． Gene controlling the uptake of shikimic acid
by Escherichia coli［J］． J Bacteriol，1966，92(4):1070 －1075．
［3］马怡，孙建宁，徐秋萍，等．莽草酸对血小板聚集和凝血的抑制作用
［J］．药学学报，2000，35(1):1．
［4］方玉珍，宋杰云，岑燕飞，等．毒八角酸的镇痛作用研究［J］．贵阳中医
学院学报，1989(1):59．
［5］KRAMER M，BONGAERTS J，BOVENBERG R，et al． Metabolic engineer-
ing for microbial production of shikimic acid［J］． Metab Eng，2003，5(4):
277 －283．
［6］夏从龙，周浓，刘光明，等．云南松中莽草酸含量的高效液相色谱法测
定［J］．时珍国医国药，2010，21(7):1607 －1608．
［7］项昭保，霍丹群，任绍光，等． 超声波在中草药化学成分提取中的应用
［J］．自然杂志，2001，23(5):289．
［8］XIE Y J，CHEN X P，LI Z R，et al． Extraction and content determination of
shikimic acid in Pinus elliottii Engelm［J］． Agricultural Science ＆ Tech-
nology，2010，11(3):151 －155．
［9］李志勇，李鸿雁，孙启忠，等．正交设计优化扁蓿豆 ISSR反应体系的研
究［J］．华北农学报，2010(6):97 －103．
［10］CHENG F Y，LI C G，LIU Y W，et al． Optimization and testing for PCR
system of rice by orthogonal design［J］． Agricultural Science ＆ Technolo-
gy，2010，11(2):61 －64．
［11］刘梦培，傅大立，李芳东，等．华仁杏 ISSR －PCR反应体系的正交优化
分析［J］．华北农学报，2011(2):128 －132．
［12］王学贵，姚建明，张洋，等．草甘膦与百草枯及其混剂对三叶草生理生
化的影响［J］．西南农业学报，2010(2):379 －382．
5158139 卷 30 期 李 达等 党参多糖水提法工艺研究