全 文 ：南京农业大学学报 2014，37(6) :59－65 http:/ /nauxb． njau． edu． cn
Journal of Nanjing Agricultural University doi:10． 7685 / j． issn． 1000－2030． 2014． 06． 009
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收稿日期:2014－05－03
基金项目:国家自然科学基金项目(41271271) ;国家公益性行业(农业)科研专项(201103004)
作者简介:张楠，博士，讲师。* 通信作者:黄启为，教授，研究方向为植物氮素营养与有机肥料，E-mail:qwhuang@ njau． edu． cn。
张楠，吴凯，沈怡斐，等． 根际益生菌解淀粉芽孢杆菌 SQＲ9 在香蕉根表的定殖行为研究［J］． 南京农业大学学报，2014，37(6) :59－65
根际益生菌解淀粉芽孢杆菌 SQＲ9
在香蕉根表的定殖行为研究
张楠，吴凯，沈怡斐，张瑞福，沈其荣，黄启为*
(南京农业大学资源与环境科学学院 /国家有机类肥料工程研究中心，江苏 南京 210095)
摘要:在水培和土培条件下利用激光共聚焦扫描显微镜(confocal laser scanning microscopy，CLSM)和扫描电子显微镜(scan-
ning electron microscopy，SEM)研究绿色荧光蛋白(green fluorescence protein，GFP)标记的解淀粉芽孢杆菌 SQＲ9(SQＲ9-gfp)
菌株在香蕉根表的定殖情况。结果表明:在接种后 2 ～ 8 d，SQＲ9-gfp可在香蕉根表有效定殖并形成微菌落，定殖主要发生
在主根的分生区和伸长区、侧根、主根与侧根的交界处以及根毛区，而附着于根尖的细菌数量很少。2 种系统下 SQＲ9-gfp
的定殖表型相似，表明水培等限制系统可在短期内模拟真实的土培条件。对 SQＲ9-gfp的定量计数结果表明:接种 4 d后其
在香蕉根表的密度保持在 105 ～ 106 CFU·g－1，以及在根际土中密度为 106 ～ 107 CFU·g－1，接种 15 d 后细菌密度略有下降。
结论:SQＲ9 能在香蕉根表有效定殖并在根际保持一定浓度，可为进一步利用该 PGPＲ菌株防控香蕉枯萎病提供理论基础。
关键词:植物根际益生菌;解淀粉芽孢杆菌 SQＲ9;香蕉枯萎病;绿色荧光蛋白;定殖
中图分类号:S154． 3 文献标志码:A 文章编号:1000－2030(2014)06－0059－07
Investigation of the colonization patterns of plant growth-promoting
rhizobacteria Bacillus amyloliquefaciens SQＲ9 on banana roots
ZHANG Nan，WU Kai，SHEN Yifei，ZHANG Ｒuifu，SHEN Qirong，HUANG Qiwei*
(College of Ｒesources and Environmental Sciences /National Engineering Ｒesearch Center for
Organic-based Fertilizers，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China)
Abstract:Efficient colonization of plant growth-promoting rhizobacteria(PGPＲ)on plant roots is crucial for the exertion of the growth
promotion and biocontrol effects． This study was performed to investigate the colonization patterns of Bacillus amyloliquefaciens SQＲ9
on banana roots to understand its application prospect on plant growth and biological control． The colonization patterns of
B. amyloliquefaciens SQＲ9 tagged by green fluorescence protein(GFP)on banana roots was investigated in hydroponic and natural
soil system by confocal laser scanning microscopy(CLSM)and scanning electron microscopy(SEM)． The results showed that SQＲ9
carrying gfp(SQＲ9-gfp)could effectively colonize on banana roots and formed micro-colonies at 2 to 4 days of inoculation． The colo-
nization of bacterial cells mainly occurred on the differentiation and elongation zones of the main roots，the lateral roots，junctions
between roots and the root hairs，while few labeled bacterial cells were detected to attach along the root tips． In addition，similar col-
onization patterns of SQＲ9-gfp were obtained under both systems suggested that the hydroponic system could represent the natural
soil system in a short time． The quantitative analysis revealed that at 4 days after inoculation，the population of SQＲ9-gfp was main-
tained at about 105 －106 CFU·g－1 roots，and 106 －107 CFU·g－1 soil，respectively;While the abundance of SQＲ9 slightly decreased at
15 days post inoculation． Conclusions:SQＲ9 could effectively colonize on banana roots and reach the appropriate population，which
could provide the theoretical basis for the practical application of SQＲ9 for suppression of banana wilt．
Keywords:plant growth-promoting rhizobacteria(PGPＲ) ;Bacillus amyloliquefaciens SQＲ9;fusarium wilt of banana;green fluores-
cence protein(GFP) ;colonization
植物根际益生菌(plant growth-promoting rhizobacteria，PGPＲ)是一类能在植物根际存活定殖，并具有
促进植物生长或防控病害能力的一类有益微生物［1］。在其基础上开发的生物肥料等产品已在农业生产
中广泛应用。PGPＲ 菌株在植物根际的存活和定殖是其充分发挥促生和防病作用的基础和前提，也是拮
抗土传病原菌的重要机制之一［2－3］。很多研究都发现 PGPＲ菌株在根际的定殖情况与其促生和生防效果
密切相关［4－6］。因此，研究并揭示 PGPＲ菌株在植物根表及根际的分布定殖规律是阐明其具体功能作用
南 京 农 业 大 学 学 报 第 37 卷
机制并提高作用效果的基础，这对指导如何制定科学有效的功能菌施用方法有重要意义。
直观有效的跟踪技术是研究土壤微生物原位分布规律的重要工具。近年来，报告基因技术的兴起和
发展为研究目标土壤微生物的定殖规律及其与寄主间的互作创造了有利条件［7］。分离自维多利亚发光
多管水母(Aequorea victoria)的绿色荧光蛋白(green fluorescence protein，GFP)是近年来应用最为广泛的标
记分子之一［8］。GFP 蛋白具有标记基因小(约 700 bp)、无毒无害、结构稳定、灵敏度高，激发荧光不需要
外源底物和能源，在多种生物细胞中均可表达应用等优点［9］。自 1994 年第 1 次报道其应用以来，很多学
者利用 GFP 研究目标菌株在环境样品、植株根际及其内部等的原位分布定殖规律［10－13］。
解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)SQＲ9 是一株分离自黄瓜根际的 PGPＲ 菌株，其在黄瓜根
表能有效定殖，并在盆栽和大田试验中有效防控黄瓜枯萎病和促进植株生长，其与腐熟堆肥制成的生物有
机肥已在农业生产中得到广泛应用［12］。香蕉是我国重要的经济作物，但由尖孢镰刀菌古巴专化型
(Fusarium oxysporum f. sp. cubense，FOC)引起的香蕉枯萎病严重影响香蕉生产［14］。前期试验发现 SQＲ9 在
对峙试验中能有效抑制 FOC的生长，为了明确 SQＲ9 能否在香蕉根际存活和定殖，从而开发相关的生物
有机肥产品用于枯萎病防控，本研究拟在水培和土培条件下利用激光共聚焦扫描显微镜和电子扫描显微
镜观察 GFP 标记的 SQＲ9 在香蕉根际的定殖特征和分布规律，以期为其进一步的应用提供理论依据。
1 材料与方法
1． 1 试验材料
1． 1． 1 供试土壤 巴西香蕉(Musa AAA Cavendish cv． Brazil，低抗香蕉枯萎病品种)组培苗，由海南万钟
实业有限公司提供。在 28 ℃光照培养箱中培养至 3 ～ 4 片真叶完全展开后待用。
1． 1． 2 供试土壤 试验所用土壤为红壤，采自江苏省宜兴山地，其理化性质如下:有机质含量为 7． 3
g·kg－1，速效氮(N)为 79． 0 mg·kg－1，速效磷(P)为 31． 0 mg·kg－1，速效钾(K)为 40． 0 mg·kg－1，pH 5． 4。
1． 1． 3 供试菌株 解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)SQＲ9(保藏于中国普通微生物菌种保藏管
理中心，CGMCC菌株编号 5808) ，筛选自黄瓜根际，具有良好的拮抗多种病原真菌的能力和根际定殖
能力。
携带含在 HpaⅡ启动子控制下表达 GFP 的大肠杆菌－芽孢杆菌多拷贝穿梭质粒 pHAPⅡ(GenBank 登
录号 HM151400)的 SQＲ9 菌株，记为 SQＲ9-gfp。该菌株在荧光显微镜下能发出明亮的绿色荧光，其生长
速度和代谢特性与野生型基本相同，质粒传代稳定性好［12］。
1． 1． 4 培养基、抗生素与主要试剂 LB培养基(1 L) :蛋白胨 10 g、酵母粉 5 g、NaCl 10 g、琼脂 25 g，pH
7． 0。培养 SQＲ9-gfp时添加终质量浓度为 20 μg·mL－1的卡那霉素(北京鼎国生物技术有限责任公司)。
霍格兰(Hoagland)营养液(1 L) :Ca(NO3)2·4H2O 945 mg、KNO3 506 mg、NH4NO3 80 mg、KH2PO4 136
mg、MgSO4 493 mg、铁盐溶液 2． 5 mL，pH 6． 0。
铁盐溶液(1 L) :FeSO4·7H2O 5． 56 g、EDTA-Na2 7． 46 g，pH 5． 5。
M8 缓冲液(1 L) :Na2HPO4 3． 12 g、KH2PO4 2． 99 g、NaCl 5． 84 g。
1． 2 试验方法
1． 2． 1 SQＲ9-gfp菌悬液的制备及香蕉幼苗接种 将过夜活化的 SQＲ9-gfp 种子液按照 1%(体积分数)
的接种量接种于含 20 μg·mL－1卡那霉素的 LB培养液中培养至 D600 值达到 4． 0 左右(约 16 h，菌体密度约
为 109 CFU·mL－1)。离心收集菌体，用 M8 缓冲液洗涤菌体 2 次，最后将其悬浮于 10 倍初始培养体积的
M8 缓冲液中。将洗净的香蕉苗根部浸泡在菌悬液中，28 ℃静置 30 min，随后用干净的吸水纸吸干根表的
剩余水分。对照中将香蕉苗根部浸泡在 M8 缓冲液中。接种后，水培处理的香蕉苗置于盛有 200 mL 1 /2
Hoagland的组织培养瓶中培养;土培处理中，香蕉苗置于盛满试验用土的一次性塑料杯中培养(装土质量
为 300 g) ，每杯 1 株，适量灌溉 1 /2 Hoagland营养液。水培和土培条件每个处理分别种植 50 株苗，培养温
度为 28 ℃，光照时间为 16 h。
1． 2． 2 SQＲ9-gfp在香蕉根系定殖部位的观察 在水培处理中，香蕉根系样品在接种后 2 d 进行观察，土
培处理的根系样品分别在接种后 2、4 和 8 d进行观察。取样时，将香蕉幼苗从基质中轻轻取出，每个时间
点采集 3 棵幼苗，小心地用无菌水冲去表面附着的土壤(土培处理) ，用干净的吸水纸吸干根系表面的残
留水分。随后用干净的手术刀将根系切成长度为 1 cm左右的小段，将其置于载玻片上，在激光共聚焦扫
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第 6 期 张楠，等:根际益生菌解淀粉芽孢杆菌 SQＲ9 在香蕉根表的定殖行为研究
描显微镜(Leica Model TCS SP2，Heidelberg，Germany)下倒置观察。激发光波长为 488 nm，收集信号范围
为 500 ～ 600 nm。利用 Leica confocal software(v 2． 61)软件分析图像。另取部分根系样品切成长度为 0． 2
cm左右的小段，用扫描电子显微镜(XL－30 ESEM，Philips，Netherlands)观察。
1． 2． 3 香蕉根际及根表 SQＲ9-gfp的定量计数 在土培处理中，分别在接种后 2、4、6、8 和 15 d 时，对接
种 SQＲ9-gfp的香蕉苗进行取样，检测其在香蕉根际和根表的定殖数量，每处理在每个取样点重复 3 次。
根际样品的采集和处理:将香蕉幼苗从土壤中小心拔出，轻轻抖落根系上的土体土，用无菌水洗下附
着在根系上的根际土壤，将制得的土壤悬液梯度稀释后涂布于含有 20 μg·mL－1卡那霉素的 LB 培养基上，
37 ℃培养至 24 h，待菌落长出以后在荧光体视镜(Olympus MVX10)下计算发光菌落数。
根系样品的采集和处理:将香蕉根系经流水轻轻冲洗后，吸干表面水分，将根剪成长度为 1 cm左右的
小段，称质量，在无菌研钵中加无菌水研碎，按每克根加 9 mL 无菌水的比例放入预先装有玻璃珠的试管
中，再将试管放置在涡旋仪上以最大转速涡旋 10 min，悬浮液梯度稀释后涂布计数。
1． 3 数据分析
试验数据采用 Microsoft ExcelTM 统计软件进行数据统计和绘图。
2 结果与分析
2． 1 水培条件下 SQＲ9-gfp在香蕉根表的定殖情况
从图 1－A中可以看出，未接种 SQＲ9-gfp的香蕉根表没有观察到发出绿色荧光的细菌，而在接种处理
中，发出明亮绿色荧光的 SQＲ9-gfp菌体细胞能够明显地与根表背景区分开(图 1－B)。激光共聚焦扫描显
微镜(confocal laser scanning microcopy，CLSM)照片显示 SQＲ9-gfp 主要定殖在香蕉根系的分生区和伸长
区，并形成微菌落(microcolony，图 1－B) ，而根尖部分只有极少量细菌附着(红色箭头处，图 1－C)。
图 1 水培条件下 SQＲ9-gfp在香蕉根表的定殖情况(接种后 2 d)
Fig． 1 Colonization patterns of Bacillus amyloliquefaciens SQＲ9-gfp cells on the banana roots
in hydroponic system(2 days post inoculation)
A． 对照，未接种 SQＲ9-gfp的香蕉根表;B． SQＲ9-gfp在香蕉根系的分生区和伸长区大量定殖;C． 香蕉根尖只有极少量 SQＲ9-gfp定殖。
A． Control banana roots without the inoculation of SQＲ9-gfp;B． The efficient colonization of SQＲ9-gfp on themeristematic zones and elonga-
tion zones of banana roots;C． A few number of single cells are found at the root tip．
2． 2 土培条件下 SQＲ9-gfp在香蕉根表的定殖情况
CLSM图片表明接种 2 d后，SQＲ9-gfp的定殖情况与水培条件下类似，均是优先定殖于根部的分生区
和伸长区，并且细胞聚集形成类似微菌落和生物膜的结构(图 2－B)。根尖定殖的细胞数量很少，特别是
根冠区基本没有细菌定殖(图 2－C)。SQＲ9-gfp在次生根(图 2－D)、根系交界处(图 2－E)和根毛区(图 2－F)
也都有明显的定殖，对照的香蕉根表则观察不到发出绿色荧光的细菌(图 2－A)。
接种 4 和 8 d后，SQＲ9-gfp的定殖表型与初期基本相同，即主要在根分生区和伸长区形成多细胞聚集
体，不过细菌密度略有下降(图 3－A和 3－C)。同时，香蕉根系的纵向切片表明 SQＲ9-gfp 不能进入香蕉根
系内部成为内生菌(图 3－B)。
另外，我们还对接种 4 d后的香蕉根系样品取样，并进行扫描电子显微镜(scanning electron microscopy，
SEM)观察。结果表明:SQＲ9 可在香蕉根表聚集并形成微菌落，定殖主要分布在分生区和伸长区根表的
凹陷处(图 4)。
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南 京 农 业 大 学 学 报 第 37 卷
图 2 土培条件下 SQＲ9-gfp在香蕉根表的定殖情况(接种后 2 d)
Fig． 2 Colonization patterns of SQＲ9-gfp cells on the banana roots
in soil system(2 days post inoculation)
A． 对照;B． SQＲ9-gfp定殖于香蕉根系的分生区和伸长区;C． 香蕉根尖只有少量 SQＲ9-gfp 定殖;D． 次生
根;E． 根系交界处;F． 根毛区
A． Control;B． Colonization of SQＲ9-gfp on themeristematic zones and elongation zones of banana roots;C． A few
number of single cells are found at the root tip;D． Lateral roots;E． Junctions between roots;F． Ｒoot hairs
图 3 土培条件下 SQＲ9-gfp在香蕉根表的定殖情况(接种后 4 和 8 d)
Fig． 3 Colonization patterns of SQＲ9-gfp cells on the banana roots in soil system
(4 and 8 days post inoculation，respectively)
A． 接种后 4 d SQＲ9-gfp在香蕉根表的定殖;B． 接种后 4 d，香蕉根系纵切切片;C． 接种后 8 d，SQＲ9-gfp
在香蕉根表的定殖。
A． Colonization of SQＲ9-gfp on banana roots at 4 days post inoculation;B． Length cutting of banana roots at 4
days post inoculation;C． Colonization of SQＲ9-gfp on banana roots at 8 days post inoculation．
2． 3 土培条件下香蕉根际及根表 SQＲ9-gfp的定量计数
在浸根接种后，SQＲ9-gfp在香蕉根表的密度超过了 107 CFU·g－1(图 5)。接种后 2 d，根表的拮抗菌密
度下降到 107 CFU·g－1以下，此时根际土壤中拮抗菌的数量大约为 106 CFU·g－1。接种后 4 d，根表的拮抗
菌数量进一步下降至 105 ～ 106 CFU·g－1，而根际土壤中的拮抗菌密度则达到峰值，约为 107 CFU·g－1。随
后，SQＲ9-gfp的数量基本保持稳定，在根表约为 105 ～ 106 CFU·g－1，在根际土壤中约为 107 CFU·g－1。接种
后 15 d，SQＲ9-gfp在根表的密度下降至 105 CFU·g－1以下，而在根际土壤中的密度变化不大，略低于 107
CFU·g－1。
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第 6 期 张楠，等:根际益生菌解淀粉芽孢杆菌 SQＲ9 在香蕉根表的定殖行为研究
图 4 土培条件下 SQＲ9 在香蕉根表的定殖情况(接种后 4 d)
Fig． 4 Colonization patterns of SQＲ9 cells on the banana roots in soil system(4 days post inoculation)
A． 对照;B、C、D． SQＲ9 在香蕉根表的定殖。A． Control;B，C，D． Colonization of SQＲ9 on banana roots．
图 5 SQＲ9-gfp在香蕉根表和根际的定殖动态
Fig． 5 Population dynamics of SQＲ9-gfp colonized in
the rhizosphere soil and on the banana roots
3 讨论
解淀粉芽孢杆菌 SQＲ9 能有效防控黄瓜枯萎病
及促进植株生长，并在平板对峙试验中表现出良好
的拮抗 FOC的能力，但其产品能否在实际生产中防
控香蕉枯萎病，与其在香蕉根际的存活和定殖能力
紧密相关［2，4］。本研究原位观察了 GFP 标记的
SQＲ9 在香蕉根际的定殖规律和分布特征，以期为开
发和应用广谱型生防肥料提供理论依据。
本试验利用激光共聚焦扫描显微镜和电子扫描
显微镜分别对水培和土培条件下接种 SQＲ9-gfp 的
香蕉幼苗根部进行观察，发现 2 种系统下 SQＲ9-gfp
均能在植株根表成功定殖，其细胞聚集形成微菌落，
部分区域能形成类似生物膜的结构。菌株的定殖主要发生在主根分生区和伸长区;另外，侧根、根系交界
处和根毛区也都有大量细菌定殖，而根尖部分附着的细菌数量很少，这与 SQＲ9 在黄瓜根表的定殖表型，
以及前人许多关于 PGPＲ菌株根际定殖行为的研究，包括一株分离自香蕉根际并已在盆栽试验中被证明
能有效防控香蕉枯萎病的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)N11 的观察结果是相似的［4－5，11－12，15］。另外，一些
土传的植物病原菌通常是从宿主根部的伤口或在初生根和次生根的交界处开始入侵的，而生防菌对这些
根际重要生态位点的占领可以有效防止病原菌对植物根系的侵袭［3，10］。
不同的根际细菌往往在宿主上表现出不同的定殖行为［9－12，15－16］，而同一种细菌在不同植物的根表有
时也会表现出不同的分布［11］。一般来说，根系分泌物被认为是影响根际微生物行为和分布的重要因
素［17－18］，其中的各种组分由根尖到基部的方向上呈现不同的浓度分布［19］。于是，偏好根系分泌物中不同
组分的细菌就可能呈现出不同的趋化和定殖行为［20］。Timmusk 等［10］和 Ｒen 等［21］研究发现，喜好根尖浓
度较高的糖分和外渗胶水状物质的多黏类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)优先定殖于宿主植物的根尖
部位并形成生物膜。一些假单胞菌(Pseudomonas sp．)也表现出类似的定殖行为［9］。总体来看，大部分的
Bacillus spp. 则呈现弥散型分布于根伸长区和成熟区［5，11－12］，其具体机制及根系分泌物中起主要作用的趋
化因子还有待进一步研究［22－23］。
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南 京 农 业 大 学 学 报 第 37 卷
有报道指出一些芽孢杆菌可以进入宿主植物体内形成内生菌［24］，本实验室的研究也发现 SQＲ9 可进
入黄瓜的根部及茎部［12］。不过，本研究中的香蕉根系纵向切片镜检未发现 SQＲ9-gfp，说明其在香蕉上不
是内生菌株。同一菌株在不同的宿主上可能会表现出不同的定殖行为，由于 SQＲ9 分离自黄瓜根际，相比
于香蕉，其与宿主可能在长期的共同进化中形成了更紧密的关系［18］。
本研究的另一个目的是比较 SQＲ9-gfp在不同系统下的定殖行为。从结果上看，短期内其在简单系统
(水培)中表现出来的定殖表型与在土培系统中还是比较接近的，这说明一些水培处理在短期内可以一定
程度地模拟真实的土培环境。不过，水培的厌氧环境是影响好氧微生物活动的不可忽视的因素［25］，长期
的水培试验势必需要供氧系统或者振荡培养。
本研究中，对 SQＲ9-gfp的动态定量检测的结果表明它们在香蕉根表的密度大约为 105 ～ 106 CFU·g－1，
在根际中的密度大约为 106 ～ 107 CFU·g－1，这些结果与前人的报道基本吻合，也基本达到了发挥拮抗作用
的浓度［10，12，15］。根际中拮抗菌的密度要比根表高出约 1 个数量级，推测生防菌可能主要分布在距离作物
根系较近的根际土中。在本试验后期，我们发现 SQＲ9-gfp 的密度有所下降，这种现象也曾被研究［15，26］报
道，可能是其与土著微生物的竞争以及质粒的丢失有关，这也是造成直接施入土壤的生防菌不能充分发挥
作用的原因。后期研究将集中在有机载体(如有机肥)对拮抗菌根际定殖的影响及相关机制等方面。
本研究通过原位试验证明解淀粉芽孢杆菌 SQＲ9 能有效在香蕉根际定殖，定殖主要发生在主根分生
区和伸长区、侧根、根系交界处和根毛区，根际和根表的 SQＲ9 浓度能达到发挥生防作用的浓度。这些结
果表明 SQＲ9 有防控香蕉枯萎病的的潜力，未来将通过一系列盆栽和田间试验明确 SQＲ9 防控香蕉枯萎病
的实际效果，通过结合有机肥施用等方式优化生防效果并与相关研究［27］进行比较。另外，在上述系统中
研究植物－病原菌－生防菌三者之间的互作关系对于进一步了解拮抗菌株的定殖特征和生防机制具有重
要意义，也能为生物有机肥的科学运用和推广提供理论依据［28］。
南京农业大学资源与环境科学学院 Waseem Ｒaza副教授修改本文的英文摘要，谨致谢意。
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责任编辑:刘怡辰
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