全 文 ：［收稿日期］ 20130730(012)
［基金项目］ 江西省教育厅基金项目(GJJ11544)
［第一作者］ 魏娟，硕士研究生，从事中药种质资源与品质评价研究，E-mail:247314073@ qq． com
［通讯作者］ * 曾金祥，副教授，博士，从事中药资源及中药生物传感研究，E-mail:zjinxiang@ 163． com
粗齿兔耳风提取物利尿活性及其机制
魏娟，曾金祥* ，毕莹，王晓云，罗光明
(江西中医药大学中药资源与民族药研究中心，南昌 330004)
［摘要］ 目的:研究粗齿兔耳风提取物对大鼠的利尿作用并探讨其机制。方法:将大鼠随机分为 5 组，每组 6 只，兔耳风
提取物高、中、低剂量(2. 5，10，20 g·kg －1)和呋塞米(10 mg·kg －1)灌胃给药。第 1 次给药后，收集大鼠 1，2，4，6，24 h 的尿液，
研究并比较各给药组对大鼠排尿量和尿中 Na +，K +，Cl －排泄量的影响。连续给药 8 d，取其肾脏研究各给药组对肾髓质水通
道蛋白(AQP)1，AQP2，AQP3 的 mＲNA表达影响。结果:与正常组比较，单次给药后粗齿兔耳风提取物在 4 h后能明显增加大
鼠的尿液量，24 h尿液中 Na +，K +，Cl －的浓度明显增加。每天给药 1 次，给药 8 d后与正常组比较，粗齿兔耳风提取物给药组
能显著下调大鼠肾髓质水通道蛋白 AQP2 的 mＲNA表达，对 AQP3 的 mＲNA表达也有一定的下调作用，对 AQP1 的 mＲNA表达
调节作用则无显著性差异。结论:粗齿兔耳风提取物具有利尿作用，促进 Na +，K +，Cl －的排泄和抑制水通道蛋白 AQP2，AQP3
mＲNA表达是其可能机制。
［关键词］ 粗齿兔耳风;利尿活性;水通道蛋白
［中图分类号］ Ｒ285. 5 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1005-9903(2014)07-0166-04
［doi］ 10． 13422 / j． cnki． syfix． 2014070166
Diuretic Activity and Mechanism of Ainsliaea grossedentata
WEI Juan，ZENG Jin-xiang* ，BI Ying，WANG Xiao-yun，LUO Guang-ming
(The Chinese Medicine Ｒesource and National Medicine Ｒesearch Center of Jiangxi Province，
Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanchang 330004，China)
［Abstract］ Objective:The aim of the present study was to evaluate the diuretic effect and explore its
mechanism of Ainsliaea grossedentata in water-loaded rats． Method:The rats were divided and given extractive of
A． grossedentata at three different dose (2. 5，10，20 g·kg －1)，and given furosemide (10 mg· kg －1)as
positive control group． After the first administration，the urine of rats was collected at 1，2，4，6，24 h to study
the effect of urine output and electrolyte concentration (Na +，K + and Cl －)and regulation of the relative mＲNA
expression of aquaporin-1 (AQP1)，aquaporin-2 (AQP2)and aquaporin-3 (AQP3)in water-loaded rats． Ｒesult:
Compared with normal group，after single dose of the extract of A． grossedentata，urine output was significantly
increased，which began at 4 h after the treatment． The extract increased urinary levels of Na +，K +，and Cl － at 24
h markedly． After administration of 8 days， the extract significantly reduced expression of AQP2 and lower
expression of AQP3 to some extent，but there was no significant difference in the expression of AQP1. Conclusion:
A． grossedentata has conspicuous diuretic activity，the possible mechanisms may restrain the relative mＲNA
expression of AQP1 and AQP2 as well as renal tubular reabsorption function．
［Key words］ Ainsliaea grossedentata，diuretic acivity，aquaporins
兔儿风属植物药用种类较多，具有多种药效，但 现代研究较多的为杏香兔耳风，其他种类的药用植
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第 20 卷第 7 期
2014 年 4 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 20，No． 7
Apr．，2014
物研究较少。粗齿兔耳风(Ainsliaea grossedentata
Franch．)是兔耳风属植物的一种，收载于《中华本
草》［1］，又名光棍草、灯台草、观音草，具有风热感
冒、热淋、小便不利之功效，在民间长期、广泛应用于
清热利尿。
粗齿兔耳风广泛分布于湖南、湖北、四川、重庆、
贵州、江西等地，在我国具有较为丰富的资源。粗齿
兔耳风虽然长期作为利尿中药材使用，但国内外至
今仍缺少其利尿方面的实验性研究，致使其利尿功
效及机制仍不明确。另一方面，利尿药物由于在高
血压、心力衰竭和水肿的治疗中占重要地位［2-4］，而
西药利尿剂在应用中极易出现电解质紊乱，特别是
易出现高血钠或低血钾从而导致严重后果［5］，而天
然利尿中草药因其疗效温和且不良反应较少，已成
为现代利尿药物的研究热点［6］。基于此，本文采用
大鼠经典水负荷模型，针对粗齿兔耳风提取物利尿
的功效进行现代药理学验证，并对其机制进行探讨。
1 材料
1. 1 仪器 大鼠代谢笼(广州市赛柏诺生物科技
有限公司) ，WFX-120A 原子吸收分光光度计(美国
Beckman-coulter 公司) ，高速冷冻离心机(美国
Beckman Allegra公司) ，BS224S 电子天平(北京赛
多利斯仪器系统有限公司) ，ＲE-52-05 旋转蒸发仪
(上海亚荣生化仪器厂) ，超低温冰箱(美国 Thermo
公司) ，DYY-5 稳压稳流电泳仪(北京市六一仪器
厂) ，MJ-PTC200 PCＲ 仪(美国 Bio-Ｒad 公司) ，SIM
凝胶成像系统(美国 SIM公司)。
1. 2 药物与试剂 粗齿兔耳风由江西中医药大学
曹岚老师采自四川，经张寿文教授鉴定为 Ainsliaea
grossedentata Franch．。呋塞米片(上海朝晖药业有
限公司，国药准字 H31021074) ，TＲNzol-A +总 ＲNA
提取试剂(批号 OSＲ-M610，Tiangen 公司) ，M-MLV
反转录酶(批号 M1701，购自 Promega公司) ，水通道
蛋白(AQP)1，AQP2，AQP3，内参还原磷酸甘油醛脱
氢酶(GAPDH)引物由上海捷瑞生物工程有限公司
合成，水为超纯水，其余试剂为分析纯。
1. 3 动物 SD 大鼠，雄性，体重(190 ± 10)g，SPF
级，合格证号 SCXK(湘)2011-0003，湖南斯莱克景
达实验动物有限公司，标准鼠笼饲养，光照周期 12 /
12 h，相对湿度 50% ～60%，环境温度 21 ～ 23 ℃。
2 方法
2. 1 药物制备 称取粗齿兔耳风干药材 480 g，用
95%乙醇浸泡过夜，分别用 4 倍量 95%，80%，65%
乙醇回流提取 1 次，每次提取时间 2 h，提取液过滤
后回收溶剂至干，提取物用 0. 9% NaCl 溶液混悬，分
别制成生药含量 800，400，100 g·L －1的给药溶液。阳
性对照药呋塞米，用 0. 9% NaCl 溶液配成 0. 4 g·L －1
的给药溶液。
2. 2 动物的筛选 取实验用大鼠数只，ig给予生理
盐水 25 mL·kg －1，代谢笼收集 2 h尿液，尿量达灌入
水量 40% 以上者可用于以下实验［7］。
2. 3 利尿实验 取预选试验中排尿功能合格的大鼠
30只，随机分为 5 组，每组 6 只，分别为正常组(给药
0. 9% NaCl溶液)、阳性药物组(给药 0. 4 g·L －1的呋
塞米，以下简称阳性组)、兔耳风提取物高剂量组
(兔高组，生药含量 800 g·L －1)、兔耳风提取物中剂
量组(兔中组，生药含量 400 g·L －1)和兔耳风提取
物低剂量组(兔低组，生药含量 100 g·L －1)。将大
鼠置于标准鼠笼适应 2 d，代谢笼中适应 3 d，实验前
禁食(不禁水)18 h，以减少粪便的干扰［8］。各组大
鼠按 25 mL·kg －1体重，用生理盐水灌胃，造成水负
荷模型，实验开始时先轻压动物下腹，排尽余尿。给
含受试药物的 0. 9%NaCl溶液 2 5 mL·kg －1，造成水
钠潴留状态，分别收集大鼠 1，2，4，6，24 h 的尿液，
测定尿液体积并将其冻存于 － 20 ℃冰箱中。连续
给药8 d，第 8 天给药 1 h 后处死大鼠，取肾，分离肾
浆膜后立即置于 － 80 ℃冰箱保存。
2. 4 尿中钾、钠、氯离子浓度的测定 分别取各组大
鼠的尿液，采用原子吸收分光光度计测定钠离子和钾
离子的浓度，采用银量法测定尿液中氯离子浓度。
2. 5 ＲT-PCＲ 法测定肾髓质水通道蛋白 mＲNA 表
达 取出冻存于 － 80 ℃冰箱中的大鼠肾脏样品，切
取 30 ～ 50 mg，按照试剂盒说明书提取其中的总
ＲNA，取总 ＲNA 1 μL，加 DEPC 水稀释后，在 260，
280 nm下测定吸光度(A) ，以 A260 /A280确定其纯度。
利用 1. 2% 琼脂糖凝胶电泳方法鉴定，在紫外灯下
观察总 ＲNA 完整性。
取 8 μL总 ＲNA，按照 Promaga反转录酶使用说
明书上操作步骤进行反转录，合成 cDNA。引物序
列和 PCＲ扩增反应按照文献［9］中所述进行，并略
有修改。引物序列:AQP1(5-ATTGCAGCGTCAT-
GTCTGAG-3，3-GAACTAGGGG CATCCAAAC-5) ;
AQP2(5-TTGCAGGAACCAGAC ACTTG-3，3-GCG-
GAGACGAGCACTTTTAC-5) ;AQP3(5-ACTCCAGT-
GTGGAGGTGGAC-3，3-GCCCCTAGTTGAGGATCA-
CA-5) ;GAPDH (5-GAGAAGATTTGGACCACC-3，
3-CATCACAA TGCCAGTGGTAC-5)。PCＲ 反应体
系总体积为25 μL。APQ1，APQ2，APQ3 引物和内参
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魏娟，等:粗齿兔耳风提取物利尿活性及机制研究
GAPDH引物扩增条件为 95 ℃预变性 2 min，94 ℃
变性 30 s，58 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 25 s，共 36 个
循环;72 ℃延伸 10 min。
PCＲ产物经 1. 2%琼脂糖凝胶电泳、溴化乙啶染
色后，在凝胶成像分析仪上分析。计算待测基因与
GAPDH的比值，从而得到待测基因的相对表达值。
2. 6 统计分析 实验数据以 珋x ± s 表示，均数比较
用单因素方差分析，所有统计学处理均由 SPSS 19. 0
软件统计完成，P ＜ 0. 05 为有统计学意义。
3 结果
3. 1 对 SD大鼠排尿量的影响 粗齿兔耳风提取
物对 SD大鼠的排尿量的影响见图 1。由图可知，在
1 ～ 2 h内粗齿兔耳风提取物高、中、低剂量组与正
常组大鼠尿量无明显差异，阳性药物组大鼠与正常
组比较具明显利尿效果(P ＜ 0. 05)。兔耳风各剂量
组在 4 ～ 6 h后可产生显著的利尿效应，24 h 内兔耳
风提取物各剂量组大鼠产生的尿量与正常组相比有
极显著性差异(P ＜ 0. 01)。
阳性组．呋塞米(10 mg·kg －1) ;兔低组．兔耳风 2. 5 g·kg －1组;
兔中组．兔耳风 10 g·kg －1组;兔高组．兔耳风 20 g·kg －1组;
与正常组比较1)P ＜ 0. 05，2)P ＜ 0. 01(表 1，图 4 同)
图 1 各组大鼠 24 h内尿量比较(珋x ± s，n = 6)
3. 2 对大鼠 24 h尿液中 Na +，K +，Cl －浓度的影响
各组大鼠 24 h 尿液中的离子浓度见表 1。由表 1
可以看出，阳性药物组大鼠尿液中的 Na +，Cl －浓度
与正常组相比有极显著性差异(P ＜ 0. 01) ，但对 K +
的影响并不显著。粗齿兔耳风各剂量组大鼠尿液中
的 Na +，K +，Cl －浓度与正常组相比较均有极显著差
异(P ＜ 0. 01)。兔高组大鼠尿液中 Na +，Cl －浓度较
兔中组、兔低组高，兔中组大鼠尿液中 K +浓度与兔
高组、兔低组相比相对最高。在粗齿兔耳风提取物
中，各剂量组大鼠尿液中离子浓度以 Cl －最高。由
以上结果表明，粗齿兔耳风的利尿活性可能与促进
Na +，K +，Cl －的排泄有关。
3. 3 各引物扩增产物大小 本实验采用 ＲT-PCＲ检
测肾髓质水通道蛋白 mＲNA 的表达(见图 2) ，
表 1 粗齿兔耳风提取物对大鼠尿液 Na +，K +和
Cl －浓度的影响(珋x ± s，n = 6) mmol·L －1
组别
剂量
/ g·kg －1
Na + K + Cl －
正常 0 88． 98 ± 5． 19 83． 14 ± 13． 75 125． 38 ± 29． 76
阳性 0． 01 108． 08 ± 4． 421) 93． 79 ± 6． 71 160． 74 ± 7． 541)
兔低 2． 5 123． 75 ± 2． 911)113． 25 ± 4． 961) 181． 35 ± 3． 261)
兔中 10 117． 3 ± 3． 731) 151． 83 ± 5． 691) 171． 05 ± 4． 061)
兔高 20 136． 75 ± 3． 581)138． 02 ± 3． 171) 217． 42 ± 5． 211)
注:与正常组组比较1)P ＜ 0. 01。
GAPDH为内参，DL2000为 DNA相对分子质量标记。
由图可知，本实验成功地扩增了水通道蛋白各基因，
因而能对水通道蛋白 AQP1，AQP2，AQP3 的调节作用
进行研究。
GAPDH． 299 bp;AQP1． 100 bp;AQP2． 174 bp;AQP3． 147 bp
图 2 水通道蛋白 ＲT-PCＲ产物电泳图
3. 4 各给药组对大鼠肾髓质水通道蛋白的表达影响
图3为大鼠给药后AQP1，AQP2，AQP3蛋白基因ＲT-
PCＲ产物典型电泳图。各给药组 SD 大鼠肾脏水通
道蛋白 AQP1，AQP2，AQP3 mＲNA的表达结果分析见
图 4。由图可知，兔耳风提取物对 AQP1，AQP2，AQP3
有不同的影响。与生理盐水组比较，兔低组低剂量组
对 AQP2 mＲNA 的表达有极显著的下调作用(P ＜
0. 01) ，对显著下调 AQP3 mＲNA 的表达(P ＜ 0. 05) ，
但对 AQP1的表达无明显影响;兔中组、兔高组对水通
道蛋白表达的影响与兔低组基本一致。综上所述，兔
耳风提取物能显著下调 SD 大鼠肾脏水通道蛋白
AQP2 mＲNA相对表达含量 (P ＜0. 05) ，且对 SD大鼠
肾脏水通道蛋白 AQP3 mＲNA的表达也有一定的下调
作用，但对 AQP1 mＲNA的表达无明显的调节作用。
4 讨论
粗齿兔耳风长期作为利尿中草药在民间广泛使
用，但其利尿功效与机制缺少现代药理学验证，因而
限制了其药用资源的现代化开发应用。本实验的研
究结果表明，粗齿兔耳风具有明显的利尿作用。其较
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中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
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1. 正常组;2. 呋塞米 10 mg·kg －1组;3. 兔耳风 2. 5 g·kg －1组;
4. 兔耳风 10 g·kg －1组;5. 兔耳风 20 g·kg －1组(图 4同) ;6. DL2000
图 3 典型 AQP1(A)，AQP2(B)，AQP3(C)ＲT-PCＲ产物电泳
图 4 粗齿兔耳风提取物对大鼠肾脏髓质水通道
蛋白 mＲNA 相对表达量的影响(珋x ± s，n =6)
短时间内利尿作用虽不如呋噻米迅速，但在较长的时
间内却同样具有较好的利尿效果。
现代药理学研究表明，利尿作用往往与体内钠、
钾、氯离子的排泄及水通道蛋白的调节作用密切相
关。本实验结果表明，粗齿兔耳风提取物能明显促进
SD大鼠钠、钾、氯的离子排泄，但呋噻米对钾离子的
排泄与生理盐水组相比不具明显的差异。这说明粗
齿兔耳风提取物利尿机制与呋噻米在一定程度上有
所相似性，但不完全相同，而与泽泻提取物利尿效果
类似［10］。
肾水通道蛋白分布在肾近曲小管、细段和集合
管，主要介导自由水跨生物膜转运，其中 AQP1，
AQP2，AQP3 参与水的重吸收和尿液浓缩
［11］。研究结
果表明粗齿兔耳风提取物可以通过调节水通道蛋白
AQP2 与 AQP3 的 mＲNA表达参与水的重吸收和尿液
浓缩进而产生利尿作用，但其利尿机制远较呋噻米复
杂，二者既有相似性，又有显著差异。这可能是由于
兔耳风提取物的本身含有多种化学成分，能够作用于
体内多种靶点，因而是多种化学成分共同作用的
结果。
本实验首次研究了粗齿兔耳风的利尿功效与机
制，粗齿兔耳风具有利尿作用，其利尿作用均匀而持
久，其利尿机制较为复杂，研究结果为粗齿兔耳风的
进一步开发与利尿药用提供了理论和实验基础，但其
利尿具体机制尚还有待进一步研究确证。
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［责任编辑 聂淑琴］
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魏娟，等:粗齿兔耳风提取物利尿活性及机制研究