全 文 ：藤梨根乙酸乙酯提取物促凋亡作用的实验研究
田　林▲　刁路民△　国宏莉▲　张　丽▲
武汉大学基础医学院病理学教研室 (武汉 430070)
　摘　要　目的: 探讨藤梨根乙酸乙酯提取物对肿瘤细胞的促凋亡作用。方法: M TT比色法检测藤
梨根乙酸乙酯提取物在不同浓度及不同时间对人食管癌 Eca-109细胞生长作用 , TUNEL
法检测其对癌细胞生长的诱导凋亡效应。结果:藤梨根乙酸乙酯提取物对人食管癌 Eca-
109细胞的生长抑制作用随着药物浓度的升高和作用时间的延长而增强。 提取物对瘤细
胞有明显的凋亡效应。 结论: 藤梨根乙酸乙酯提取物通过促凋亡作用能有效抑制人食管
癌 Eca-109细胞的生长。
　主题词　抗肿瘤 (中药 ) /药理学　猕猴桃科 /药理学　食管肿瘤　细胞凋亡
　【中图分类号】　 R969. 4　【文献标识码】　 A　【文章编号】　 1000-7369( 2010) 10-1424-03
　　 细胞凋亡是由基因编码控制的一种细胞的程序性死亡 ,
是机体维持正常生理活动所必需的。本课题观察藤梨根对培养
的人食管癌 Eca-109细胞生长的作用 ,以探讨藤梨根对人食管
癌细胞的作用机制。
1　材料与方法　 1. 1　材料　 人食管癌细胞 Eca-109细
胞株购于上海市中科院细胞库 , RPMI-1640培养基购于武汉天
源生物技术有限公司 ,为 Gibco公司产品 (货号 31800-022) ;超
级新生牛血清为杭州四季青生物工程有限公司产品 (批号
050126) ;四甲基偶氢唑蓝 ( M TT )购于武汉天源生物技术有限
公司 ,为 Duchefa分装 (货号 BS0880) ; TUNEL试剂盒 ( 编号
ZK-8005) 购于北京中杉生物技术有限公司。
1. 2　细胞培养　细胞在含 10%小牛血清的 RPMI1640培
养液中 , 37℃、 5% CO2条件下培养 , 24h换液一次。
1. 3　药物制备　将藤梨根 1kg粉碎成粗粉 ,烘干备用。取
藤梨根 500g,加入 3000m L乙酸乙酯中浸泡 12h;回流提取 1h ,
过滤 ;药渣再加 2000mL乙酸乙酯回流提取 1h;合并两次滤液 ,
减压回收乙酸乙酯至稠膏状 ,真空干燥 ;干燥品加蒸馏水
500m L ,旋转加热溶解 ,制成饱和水溶液 ;灭菌 ;原液 ( 500mL ,
1g /mL , pH= 3. 8) 。 将原液稀释成 1μg /m L、 10μg /m L、 100μg /
m L三个药物浓度 ;过滤 ;灭菌 ;分装 ,置 4℃冰箱备用。
1. 4　 M T T法　将贴壁细胞用 0. 25%的胰蛋白酶消化后
计数 ,调整细胞浓度为 4× 104 /m L,接种于 96孔板 ,待 24h细
胞贴壁后加入藤梨根乙酸乙酯提取物药液。实验组分别加入终
浓度为 1μg /m L、 10μg /m L、 100μg /m L3个药物浓度的药液 ,对
照组加入等体积溶剂的培养液 ,每组 l2复孔 ,分别于加药后第
1、 2、 3d测定各孔的吸光度值 ( A值 )。 测定前每孔加 5mg /m L
的 M T T 20μL,温育 4h ,弃上清液 ,加入二甲基亚砜 ( DMSO )
150μL /孔。 同时振荡至结晶完全溶解 ,用酶联免疫检测仪在
490nm波长下测定 A490值。用各组的平均 A值计算细胞生长抑
制率。
生长抑制率= 对照组 A490-实验组 A490对照组 A490 × 100%
△通讯作者
▲湖北医药学院附属人民医院 (十堰 442000)
1. 5　 TUN EL法检测凋亡细胞　将浓度为 4× 104 /mL的
Eca-109细胞接种于经多聚赖氨酸包被的清净盖玻片上 ,用
RPM I1640培养基于 37℃、 5% CO2条件下在 24孔板中培养
24h后取出盖玻片 , PBS冲洗 3次。 0. 1% Triton-100破膜、 4%
多聚甲醛固定 , H2O2阻断。 用 TDT法将生物素标记的 d-UTP
在末端转移酶的作用下 ,标记到 DN A的 5 端缺口上 ,再用亲
和素标记的 HRP与之结合 ,然后加入底物 DAB显色 ,苏木素
复染 ,从而使凋亡细胞核呈现棕褐色 ,未凋亡细胞核呈蓝色。在
光学显微镜下随机计数 5个高倍视野约 1000个细胞中的凋亡
细胞数 , 计算凋亡细胞所占比例。
2　结　果　 2. 1　 M TT法检测生长抑制率　 结果表明
藤梨根乙酸乙酯提取物对人食管癌 Eca-109细胞的生长抑制
作用随着药物浓度的升高和作用时间的延长而增强。 用 1μg /
m L的乙酸乙酯提取物作用 24h ,细胞生长抑制率为 15. 9% ;当
延长至 72h时 ,抑制率上升至 39. 8% ;而 100μg /m L的药物作
用 72 h时 ,可使 77. 5%以上的细胞生长受到抑制 (见图 1)。
图 1　藤梨根乙酸乙酯提取物对 Eca-109细胞的生长抑制作用
2. 2　 TUNEL法检测细胞凋亡　 当用 1μg /m L藤梨根乙
酸乙酯提取物处理 Eca-109细胞 24h时 ,可检测到形态尚未发
生改变的早期凋亡细胞 ;当药物作用时间延长至 72 h时 ,可见
凋亡细胞变圆 ,体积明显缩小 ,核染色质浓缩 ,变成新月形 ,此
1424 陕西中医 2010年第 31卷第 10期
为晚期凋亡细胞 ,随时间的推移 ,凋亡细胞比例逐渐增加 ;而对 照组 ,未见有明显凋亡现象 (见图 2-3)。
图 2　 a　 b
a.藤梨根提取物作用于 Eca-109细胞 72h后 ,对照组未见明显凋亡现象。
b.藤梨根提取物作用于 Eca-109细胞 72h后 , TUN EL法检测见凋亡细胞核呈现棕褐色 ,未凋亡细胞核呈蓝色。
图 3　 TUN EL法检测凋亡细胞比例
(藤梨根乙酸乙酯提取物组 )
　　 3　讨　论　 藤梨根又称阳桃根 ,为植物猕猴桃科藤梨 (软
枣猕猴桃 ) Actinidia a rguta ( Sieb. teZucc. ) Planch.或猕猴桃 A.
chinensis Planch.的根。 目前 ,关于藤梨根的研究已有报道 ,其
对消化系统肿瘤有抗肿瘤作用 ,可用于消化系统肿瘤的治疗 [5] ,
但其抗肿瘤作用机制还不清楚。
本研究结果证实: 藤梨根乙酸乙酯提取物三个药物浓度
1μg /m L、 10μg /m L、 100μg /m L作用于 Eca-109细胞 24h、 48h、
72h后 ,显示出明显的凋亡特征。 TUNEL法检测可见不同时期
的凋亡细胞 ; M T T法也发现随药物浓度升高和作用时间的延
长 ,其抑制率明显升高。因此我们推测 ,诱导肿瘤细胞凋亡可能
是藤梨根抗肿瘤作用的机制之一。
研究表明 ,藤梨根对多种肿瘤细胞生长均有抑制作用。 薛
瑞 [6]等将体外培养的人胃腺癌 SGC-7901细胞接种于 BALB /
C-nu /nu裸鼠的皮下 ,建立人胃癌移植瘤模型 ,观察藤梨根提取
物对裸鼠 SGC-7901移植瘤的抑瘤作用 ,认为其作用机制之一
可能是提高机体的免疫功能。 杨维泓 [7]等观察了复方藤梨根制
剂 ( FFI LG)对荷人肺巨细胞癌 ( PG) 裸鼠移植瘤的生长和瘤体
组织 Cx43表达的影响 ,认为其抗肿瘤作用与其调节 Cx43表达
水平有关 ,通过上调肿瘤细胞 Cx43基因的表达 ,恢复肿瘤细胞
的 GJIC功能 ,从而调控肿瘤细胞的增殖分化和代谢等功能。孙
雪飞 [8 ]等观察藤梨根乙酸乙酯提取物 ( RAE)对肺癌 A549细胞
凋亡的影响 ,可明显诱导肺癌 A549细胞凋亡 ,其机制可能与降
低其 Bcl-2蛋白和 mRNA表达、上调 Bax蛋白和 mRNA表达、
升高细胞内 Ca2+ 浓度有关。
近几年来 ,国内外在研究癌变机制时对细胞间隙连接通讯
与癌变的关系也进行了大量的研究 ,发现多数肿瘤细胞无此功
能 ,其间隙连接少或无 ,而邻近的正常组织或良性肿瘤的间隙
连接正常 ,少数肿瘤细胞有脆弱的连接通讯 ,但很容易受到破
坏 ,其间隙连接数量很少 ,藤梨根可以通过上调细胞间隙连接
通讯功能来抑制某些肿瘤细胞如高转移性人肺癌细胞的生
长 [9 ]。
细胞凋亡是细胞外界环境因素与细胞自身综合作用的结
果 ,凋亡基因精确调控凋亡过程。 目前认为至少有三条通路参
与凋亡的发生即线粒体通路、死亡受体通路和内质网通路 ,各
条通路间又有串话 ( cro ss talking ) ,共同促进细胞凋亡。三条凋
亡通路最终都激活 caspase,但 caspa se基因敲除实验表明细胞
存在凋亡的代偿通路 [10 ]。细胞凋亡的发生非单个因素单个因子
事件 ,其中任何一个环节都能影响凋亡的发生 ;而藤梨根对肿
瘤细胞的作用机制是多途径多靶点的。本实验观察到藤梨根对
肿瘤细胞有凋亡效应 ,但其到底通过凋亡通路中其一或其它未
知通路还不可而知 ,故我们目前对其抗肿瘤作用的机制只是一
种推测 ,有待进一步实验证实。
参考文献
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(收稿 2010-05-28;修回 2010-06-30)
针刺、电热针和激光照射方法对穴区温度的影响
马惠敏　张　栋△　宋晓晶　李顺月　中国中医科学院针灸研究所 (北京 100700)
　摘　要　目的:了解不同刺激方法作用于穴位后产生温度效应的差异 ,为经穴的基础研究和针灸临
床治疗提供实验依据。方法: 采用红外热像方法观察针刺、电热针、激光照射刺激曲池穴
后 ,分析比较曲池及大肠经上相邻的三个穴位的温度变化情况。 结果:①不同方法刺激曲
池穴 ,引起曲池穴升温效应由强到弱依次为电热针> 激光照射> 针刺。②电热针、激光照
射曲池穴均能使温溜、手三里、肘 穴区温度升高 ;而针刺对曲池、温溜、手三里穴均为降
温效应 ,对肘 穴为升温效应。结论:大肠经上的不同穴位接受不同刺激后出现的反应有
所差异 ,其中电热针的升温效果明显高于其他刺激法。
　主题词　针刺感应　穴 ,曲池 /针灸效应　电热针　电磁波谱治疗仪　@穴位 ,温度
　【中图分类号】　 R245. 81　【文献标识码】　 A　【文章编号】　 1000-7369( 2010) 10-1426-03
　　 现代针灸保健和临床治疗中 ,许多新兴技术与传统中医
理论结合形成如电针、电热针、穴位激光等刺激方法 ,疗效显
著。 研究表明针刺可以改变穴区温度 [1] ,不同针刺手法影响穴
区温度的趋势也存在差异 [2]。为比较不同刺激方法的穴位温度
效应关系 ,本实验采用红外热像技术观察了针刺、电热针和激
光在大肠经上四个穴位分别施刺激后产生的温度变化 ,报道如
下。
1　资料与方法　 1. 1　实验仪器　 使用 V ARIOSCAN
3021-ST型红外热像仪 (德国 InfraTec公司产 )进行体表热像
图采集观察 ,温度分辨率为 0. 03℃ ,空间分辨角为 1. 5mrad,图
像分辨率为 360× 240, IRBIS2. 2热像图处理程序进行热像图
的存储、数据提取及图像处理。
1. 2　受试对象　 健康受试者 12例 (女 4例 ,男 8例 ) ,年
龄范围在 25～ 42岁之间 ,平均年龄为 28. 5岁。
1. 3　实验分组及针刺、电热针和激光照射方法　 实验分
为针刺 ,电热针和激光照射和自然对照 4组 ,刺激穴位为曲池
穴。
针刺方法: 40× 0. 25mm毫针刺入穴位 1cm后 ,平补平泻 ,
得气后留针 10min。电热针方法: 用 DRZ-1型电热针治疗仪 (北
京华针圣科技发展有限公司 ) ,调节频率 2次 /sec, 电压 6V进
△通讯作者
行刺激穴位。强度以病人耐受为度 ,时间 10min。激光穴位照射
方法:利用激光针灸仪 (浙江平阳激光仪器厂 ) ,距离穴位 0.
5cm照射 ,时间 10min。以上三组 ,每隔 5min记录一次 ,共记录
7次至 30min结束。
1. 4　检测过程　 受试者暴露左臂的被观察部位 ,在检测
环境下静坐 20 min,适应室温 ,安定情绪 ,并待呼吸 (约 20次 /
min)、心率 (约 70～ 90次 /min)平稳、无出汗状态下开始检测。
检测开始时 ,受试者左臂距红外热像机镜头 1. 2 m处 ,用红外
热像仪记录自然状态 25min内上肢热像图 ,此外分别进行电热
针、激光、普通针刺三种方法对曲池穴的刺激治疗 ,并记录此过
程前后上肢红外热像图。
1. 5　检测环境　在室温 25℃左右 ,相对湿度在 35～ 68%
范围内完成。检测是在无阳光直射、无红外辐射存在、室内外通
风隔绝的检查室内进行。
1. 6　热像图分析的方法和部位　 采集上肢热像图 ,分析
自然状态的温度分布特点。采集针刺、电热针、激光照射曲池穴
过程中的上肢红外热像图。 提取大肠经上的曲池、温溜、手三
里、肘 四个穴区的温度值 ,做出自然对照和针刺、电热针、激
光照射前后各穴位的温度变化 /时间曲线图 ,对不同刺激后穴
区温度变化数值进行统计学比较。
2　结果　 2. 1　自然波动下不同穴位的温度变化　 在自
然状态下 ,上肢温度分布较均匀 ,各穴区温度值较接近。在自然
1426 陕西中医 2010年第 31卷第 10期