全 文 ：收稿日期:2008-11-13;　修订日期:2009-03-18
作者简介:刘志芳(1981-),女(汉族),山西大同人 ,现任四川大学生命科
学学院在读硕士研究生 ,主要从事药物分子与酶相互作用机制研究工作.
＊通讯作者简介:刘克武(1952-), 男(汉族),四川成都人 , 现任四川大学
生命科学学院副教授 ,学士学位 ,主要从事药物分子与蛋白质相互作用对
其结构的影响研究工作.
熊果酸和齐墩果酸对胰脂肪酶活性及构象的影响
刘志芳 ,田　萌 ,马跃文 ,李　政 ,李　黎 ,刘克武＊
(四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室 ,四川 成都　610064)
摘要:目的 研究熊果酸(UA)和齐墩果酸(OA)对胰脂肪酶(LPS)活性和构象的影响。方法 采用紫外光谱法 、荧光光谱
法以及圆二色谱法分析 UA和 OA作用后 LPS相应图谱的特征。结果 UA和 OA作用后 LPS的活性明显降低 , 紫外吸收
光谱发生改变。荧光淬灭结果显示 UA作用后 , LPS的荧光发生淬灭 ,且淬灭的机制为静态淬灭和动态淬灭组合的淬灭
机制 , 而 OA对 LPS荧光淬灭主要为静态淬灭;UA和 OA作用后 LPS的圆而色谱图谱发生改变。结论 UA和 OA都可以
抑制 LPS的活性 、影响 LPS的构象 , 且 UA对 LPS的构象影响及抑制作用更加显著。
关键词:熊果酸;　齐墩果酸;　胰脂肪酶;　紫外光谱;　荧光光谱;　圆二色谱
中图分类号:O657.3　　文献标识码:B　　文章编号:1008-0805(2009)10-2600-03
　　脂肪酶(lipase,简称 LPS)是一种特殊的酯键水解酶 , 广泛
存在于动物组织 、植物种子和微生物体中 , 它能催化天然底物油
脂水解 , 产生脂肪酸和甘油 [ 1] 。
熊果酸(ursolicacid, UA)和齐墩果酸(oleanolicacid, OA)
为同分异构体 , 均属于五环三萜类化合物 , 广泛存在于中草药中 ,
且具有多种生物活性 [ 2] 。 OA和 UA都具有一定的降脂作用 ,能
够有效地降低高脂血症小鼠的血脂 [ 3, 4] , 有望开发成新型降脂
药。但 OA和 UA降脂作用的强弱的比较及降脂作用机理尚未见
报道。本文采用紫外光谱 、荧光光谱和圆二色谱等方法 , 研究了
UA和 OA对 LPS活性及构象的影响 , 比较了 UA和 OA对 LPS抑
制作用的强弱 , 为探寻 OA和 UA降脂作用机理 ,将其开发为一种
双成分降脂新药提供理论参考。
1 　仪器与试剂
F-4500荧光光谱仪(日立), TU-1800紫外可见分光光度
计(北京普析通用仪器公司), JASCO-J-810圆二色谱仪(日本
JASCO公司)。齐墩果酸和熊果酸购自陕西森弗生物技术有限
公司 , 胰脂肪酶购自 Sigma公司;其余试剂均为国产分析纯。
2　方法
2.1 　UA, OA对 LPS活性的影响
2.1.1　 UA, OA对 LPS的抑制作用 酶活性测定采用铜皂法 [ 5] 。
2.1.2　 UA, OA对 LPS的抑制动力学研究 在酶的反应体系中
分别加入不同浓度的 UA和 OA,改变底物橄榄油的浓度 , 测定酶
促反应的初速度。以 Lineweaver-Burk双倒数法作图 , 并计算抑
制速度常数。
2.2　 UA, OA对 LPS构象的影响
2.2.1　不同浓度 UA、OA对 LPS的紫外吸收光谱和荧光光谱测
定 取 2ml浓度为 1×10-5 mol/L的 LPS溶液 , 分别加入不同微
量体积的 UA和 OA(1.0×10 -3 mol/L)溶液 ,使三萜类小分子与
LPS的终摩尔比分别为 0/1, 0.2/1, 0.4/1, 0.6/1, 0.8/1, 1/1, 3/
1, 5/1。混合均匀后 , 室温放置 10 min, 以相同浓度的小分子溶液
作空白 , 记录 200 ～ 300 nm的紫外吸收光谱。
以 295nm为激发波长 , 室温下测定 300 ～ 400 nm的荧光光
谱 , 溶液浓度及反应条件同上述。
2.2.2　 圆二色(CD)谱测定 样品池光程为 0.1 cm, 在室温下
测定波长范围 190 ～ 250 nm的 CD谱。 CD谱用平均残基摩尔椭
圆度表示 ,单位为 deg· cm2· mol-1 , 数据经 3次扫描取平均
值。得出 CD谱后 , 用该仪器附带的杨氏方法软件计算脂肪酶的
二级结构含量。 LPS浓度为 1 ×10-5 mol/L, 实验时三萜类小分
子与 LPS的终摩尔比为 0/1, 0.4/1, 3/1。
3　结果与讨论
3.1　 UA, OA对 LPS活性的影响 不同浓度的 UA, OA对 LPS活
力的影响结果见图 1。由图 1可以看出 , UA, OA对 LPS都有一定
的抑制作用 ,抑制作用随 UA, OA浓度的升高而增强。在相同浓
度下 , UA的抑制作用大于 OA。
图 1　熊果酸和齐墩果酸对胰脂肪酶活性的影响
3.2 　UA, OA对 LPS的抑制动力学 UA, OA对 LPS的抑制作用
如图 2。由图可知随着 UA, OA浓度的升高 , 酶的 Km值保持不
变 , 而 Vmax则随 UA, OA浓度的升高而不断降低。因此 UA、OA
对 LPS均属于非竞争性抑制。
采用 Dixon作图法 ,以 1/V对不同浓度的 UA, OA作图 , 可得
到 UA, OA的抑制常数 Ki。 UA, OA的 Ki分别为 0.6 mmol/L,
0.46 mmol/L,可见抑制作用 UA大于 OA。
图 2　熊果酸(A)和齐墩果酸(B)对胰脂肪酶的抑制作用
3.3　不同浓度 UA, OA对 LPS的紫外吸收差谱 大多数蛋白质
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分子在 280 nm附近有一个吸收峰 ,是由于色氨酸(Trp)和酪氨酸
(Tyr)等芳杂环对光的吸收;同时在 220 nm左右有一个由肽键的
C=O的 π -π跃迁引起的强吸收峰 , 与蛋白质的 α-螺旋含量
有关 [ 7] 。
用不同浓度的 UA, OA作用于 LPS的紫外吸收差谱如图 3。
可知 LPS在 270 nm和 220 nm附近出现最大吸收峰 , 且随 UA、
OA浓度的增加 LPS在 220 nm和 270 nm附近的吸收不断增大 ,
图 3A中最大吸收都有少许红移。在低浓度时 , 酶在 220 nm和
270nm附近的吸收随浓度的增加而急剧增加 ,当 UA与酶的比例
达到 1/1后 ,紫外吸收增幅减慢。因此可以认为 UA与 LPS的摩
尔比例为 1/1时 ,具有最大紫外吸收。图 3B中 OA作用后的 LPS
最大吸收峰发生红移 , 当 OA与酶的比例达到 3/1后 ,紫外吸收
增幅明显减慢。因此可以认为 OA与 LPS的摩尔比例为 3/1时 ,
具有最大紫外吸收。
从由不同浓度的 UA、OA作用后 LPS的紫外吸收差谱可见 ,
LPS270nm和 280nm附近的吸收主要是由于肽键 C=O基的 π -
π*跃迁所引起 ,与蛋白质的 α-螺旋含量有关 [ 6] 。当 UA、OA浓
度较低时 , 这些小分子与 LPS的结合有利于酶分子间和分子内
的团聚作用 , 使包围在 LPS分子内部的色氨酸和酪氨酸残基的
芳杂环疏水基团裸露出来 ,改变了芳香族氨基酸残基在空间结构
中所处的微环境使蛋白质分子的构象发生改变 , α螺旋含量减
少;当小分子浓度进一步升高时 , UA处理后的 LPS分子发生蛋
白质肽链伸展现象 , 使酶分子中疏水作用略有增强 , 吸收峰略增
加且略有红移 [ 7] , 因此在紫外差谱中酶的最大吸收增加明显减
缓 , 并产生红移。而 OA没有红移现象 ,表明 UA与酶的结合对酶
构象的影响较 OA大。
图 3　不同浓度熊果酸(A)和齐墩果酸(B)处理后胰脂肪酶的紫外吸收差谱
3.4　不同浓度 UA, OA对 LPS的荧光光谱的影响 蛋白质中芳
香氨基酸的荧光特性可用来推测蛋白质的溶液构象 ,提供有关蛋
白质生色基团的结构及所处微观环境的信息。 蛋白质分子中色
氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)具有荧光性质 , 此蛋
白质内源荧光可作为探针检测蛋白质构象变化。 295 nm波长光
激发时 , 蛋白质分子中的 Trp残基受到激发 , 所产生荧光的强度
和位置与这些残基所处的微环境密切相关 [ 8] 。
由图 4可知 , 295 nm激发时荧光光谱的最大发射波长是 340
nm, 随着 UA、OA浓度的不断增加 , 荧光强度明显减弱 , 出现典
型的荧光猝灭现象 , 表明其与酶结合后引起蛋白质的构象变得疏
松 , 局部构象发生变化 ,变化后的结构不利于酶的催化 ,故酶活力
逐渐降低 [ 9] 。而在图 4A中 , 随着 UA浓度的增加 , 发射峰位红
移 , 说明 LPS中发生荧光淬灭的 Trp和 Tyr残基周围的疏水性有
所增加。同时出现了裂峰 , 原来 341 nm处的单峰逐渐裂分为二
重峰 , 其中一峰峰值蓝移至 325 nm,另一峰峰值红移至 360 nm。
蓝移峰最可能是 LPS中 Tyr残基受 UA诱导而终止与 Trp残基间
的共振能量转移 , 分裂出自身的荧光发射峰;红移峰应归属于
Trp残基 [ 10, 11] ,表明原来疏水环境的 Trp残基逐渐暴露在极性环
境中 , 使蛋白质的构象变得疏松 , 酶催化活力降低 [ 10] 。
图 4　不同浓度间熊果酸(A)和齐墩果酸(B)处胰脂肪酶后的荧光光谱
3.5　 UA, OA对 LPS荧光淬灭的机理 若将 UA, OA对 LPS荧光
的淬灭归因于分子碰撞引起的动态淬灭 , 按照 Stern-Volmer
方程 [ 12]:
F0 /F=1+Kqτ0[ Q] =1+Ksv[ Q] 　　　　　　(1)
式中:F0为无淬灭剂时 LPS的荧光强度 , F为有淬灭剂时
LPS的荧光强度 , Kq为分子淬灭速率常数 , τ0为淬灭剂不存在时
物质的荧光寿命 , Ksv为动态淬灭常数 , [ Q]为淬灭剂浓度。当温
度为 20℃时 ,求出 Ksv(UA)=17.19×104(mol· L)-1(图 5)Ksv
(OA)= 10.62 ×104(mol· L)-1。生物大分子的荧光平均寿命
约为 10-8 s, 因而可以求得 Kq(UA)=17.19×1012(mol· L)-1
s-1。 Kq(OA)=10.62 ×1012(mol· L)-1s-1 37 ℃时 , 求出 Kq
(UA)=17.02×1012(mol· L)-1s-1 Kq(OA)=10.35×1012(mol
· L)-1s-1。远大于各类淬灭剂对生物大分子的最大扩散常数
2.0×1010(mol· L)-1s-1 , 表明 UA、OA对 LPS的荧光淬灭并不
是由于分子扩散和动态碰撞引起的动态淬灭 , 而可能是静态淬
灭。但从图 5可以看出当 [ Q] >1.0×10 -5 mol· L-1时 , UA的
Stern-Volmer曲线开始偏向 Y轴 , 说明存在一定的动态淬灭效
应。因此当淬灭剂 UA浓度较低时以静态淬灭为主 , 随着淬灭
剂浓度增大 , 动态淬灭逐渐体现。因此 , 静态淬灭和动态淬灭是
导致 UA对 LPS荧光淬灭的两大原因 ,而 OA对 LPS荧光淬灭主
要归因于静态淬灭。
图 5　熊果酸 、齐墩果酸对胰脂肪酶荧光淬灭的 Stern-Volmer曲线(λex=295nm)
表 1　不同温度下药物与 LPS结合常数 KA和结合位点数 n
T(K) UAKA(×104L· mol-1) n
OA
KA(×104 L· mol-1) n
293 2.58 0.905 9 2.78 0.884 0
310 1.18 0.865 8 1.59 0.864 6
3.6 　结合常数和结合位点数的计算 设 UA、OA与 LPS之间形
成 n个结合位点的复合物 , 则结合常数 Ka和 n值可从式(2)计
算得到 [ 13]
lg[ (F0-F)/F] =lgKA+nlg[ Q] (2)
不同温度下求得的 KA值和 n值列于表 1, 从表 1可以看出 ,
UA、OA与 LPS之间都只有一个结合位点 , 具有强的相互作用。
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随着温度升高 , 产物的稳定性降低 , 静态淬灭常数 KA减小 , 进一
步推断淬灭过程为形成化合物所引起的静态淬灭。
3.7　不同浓度 UA、OA作用后 LPS的圆二色谱 蛋白质的 CD光
谱 178 ～ 250 nm为远紫外区 CD光谱 , 可以反映肽键的圆二色
性。在蛋白质或多肽的规则二级结构中 ,肽键是高度有规律排列
的 , 排列的方向性决定了肽键能级跃迁的分裂情况。因此具有
不同二级结构的蛋白质或多肽所产生 CD谱带的位置 、吸收的强
弱都不相同 [ 14] 。
图 6为不同三萜类药物浓度下 LPS溶液的 CD光谱。其中 1
曲线(LPS空白)显示了典型 LPS的结构 , 分别在 206 nm和 220
nm处出现负峰 ,在 191 nm处出现正峰 , 随着药物的加入 , LPS的
CD光谱的负峰强度逐渐降低 , 且计算得到在 UA, OA最大浓度
作用下 α螺旋含量分别减少了 3.51%和 2.86%, 说明药物分子
与 LPS结合后引起其微构像的变化 , 使 LPS肽链伸展 , 改变了
LPS的二级结构 , 导致 α螺旋结构的减少 [ 14, 15] 。从图 6和 α螺
旋含量变化可以得出相同浓度下 UA比 OA对酶二级结构影响
更加显著 , 在紫外光谱和荧光光谱基础上证实了 UA对 LPS构象
的影响比 OA显著。
[ UAorOA]:[ LPS] from1to3:0/1, 0.4/1, 3 /1
图 6　LPS的圆二色谱
以上实验结果可以看出 , UA和 OA都可通过非竞争性抑制
作用抑制了 LPS的活性;UA和 OA作用后 LPS的活性明显降低 ,
紫外吸收光谱发生改变 , 荧光光谱发生淬灭;UA, OA都改变了
LPS的二级结构和 Trp、Tyr残基所处的微环境 , 抑制了 LPS的活
性 , 从而抑制了外源脂肪的吸收 [ 16, 17] , 其中 , 与 OA相比 , UA对
LPS的构象影响及抑制作用更加显著。
UA, OA均表现出较强的抑制 LPS的活性 , 因此这两种物质
有望开发为新型的双成分的降脂新药 ,同时省却了同分异构体复
杂的分离纯化工序 , 可以大大地降低原料成本。
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