全 文 ：　　辽宁大学学报
　　　自然科学版
第 34卷　第 1期　2007年
JOURNAL OF LIAONINGUNIVERSITY
　　　　　Natural Sciences Edition
　　　　　　Vol.34　No.1　2007
山荷叶的组织培养及无性系建立的研究
张恒庆 ,孙　毅
(辽宁师范大学 生命科学学院 , 辽宁 大连 116029)
摘　要:研究了山荷叶叶柄愈伤组织的诱导 、分化 、试管苗生根 、移栽所需要的条件 , 并建立起山荷叶的无
性系.结果表明:MS+ La(NO3)3·6H2O 1.2mg L+BA 0.5 mg L+NAA 1.5 mg L是山荷叶叶柄愈伤组织诱导
的理想培养基;MS+La(NO3)3·6H2O 1.2 mg L+BA 0.5 mg L+IAA 0.2 mg L是山荷叶愈伤组织分化的理想
培养基;1 3MS+IAA 0.5 mg L是生根培养的理想培养基;以炉灰渣为试管苗的移栽扦插基质 , 移栽成活率
为 91%;试管苗在原产地生长正常.
关键词:山荷叶;愈伤组织;无性系.
中图分类号:Q949.763.3　　文献标识码:A　　文章编号:1000-5846(2007)01-0057-04
　　山荷叶(Astilbodies tabularis (Hemsl.)Engles)
又称大叶子 、大脖梗子 、佛爷伞 ,属于虎耳草科大
叶子属多年生草本植物[ 1] ,辽宁 、吉林有分布 ,主
要生长于山谷林下 、沟旁 ,生长环境要求低温寡
照 、土壤肥沃.山荷叶的根茎中含有鞣质 、淀粉等 ,
可以制造铐胶和淀粉;此外 ,山荷叶还有收涩 、固
肠作用 ,对腹泻等疾病有一定疗效.由于山荷叶需
要在较为特殊的环境中生长 ,并且在自然条件下
不易形成种子 ,因此 ,分布区内的山荷叶的数量越
来越少 ,已经成为辽宁地区的濒危植物[ 2] .为此 ,
对山荷叶进行组织培养及无性系建立的研究有重
要意义.
1　材料与方法
1.1　材料
旺盛的山荷叶嫩叶柄(从庄河市步云山采
集).
1.2　方法
将山荷叶的嫩叶柄剪成 3 ～ 4 cm 的柄段 ,放
到 500 mL 的广口瓶中 , 流水冲洗 30 min 后 ,用
0.05%安利洗涤液振荡洗涤 10 min ,移至超净工
作台上 ,再用无菌水洗涤 1 次 ,倒入 70%乙醇灭
菌约 10 s ,迅速用无菌水洗涤 2次 , 0.05%HgCl2
溶液振荡灭菌 10 min ,最后用无菌水洗涤 6次 ,将
无菌叶柄切成 0.2 ～ 0.4 cm 的柄段 ,接种到相应
的固体培养基上 ,进行观察培养.
培养基以 MS 和 1 3MS 为基本培养基 ,附加
不同浓度的细胞分裂素和生长素.以 MS 为基本
培养基时 ,加蔗糖 30 g L;以 1 3MS为基本培养基
时 , 加 蔗 糖 10 g L.培 养 基 胨 力 强 度 为
180 g cm2[ 3] ,pH5.6 ～ 5.8 ,培养温度 14 ～ 15 ℃,光
照 12 h d ,光照度 1 000 ～ 1 200 lx.
2　结果与分析
2.1　叶柄愈伤组织诱导培养
将无菌嫩叶的叶柄接种到以 MS为基本培养
基 ,附加 La(NO3)3·6H2O 1.2 mg L 及不同种类不
同浓度植物激素的培养基上 ,进行愈伤组织诱导
培养.接种 50 d后分析统计结果.
由表1可知 ,在不加任何激素和只加浓度分
作者简介:张恒庆(1962-),男 ,辽宁大连人 ,博士后 ,辽宁师范大学教授,从事植物学研究.　收稿日期:2006-09-07
表 1　植物激素对嫩叶的叶柄愈伤组织诱导的影响
培养基
编号
浓度 (mg L)
BA NAA 2 , 4-D 接种数量 愈伤组织诱导数 诱导率 % 长势
0 0 0 0 80 0 0
1 0.5 0 0 80 0 0
2 1 0 0 80 0 0
3 1.5 0 0 80 0 0
4 2.0 0 0 80 0 0
5 0.5 1.5 0 80 67 83.75 +++
6 0.5 0 1.5 80 72 90 ++
7 1 1.5 0 80 59 73.75 ++
8 1 0 1.5 80 53 66.25 ++
9 1.5 1.5 0 80 37 46.25 ++
10 1.5 0 1.5 80 56 70 ++
11 2.0 1.5 0 80 42 52.25 +
12 2.0 0 1.5 80 43 53.75 +
注:+++为长势好;++为长势较好:+为长势一般
别为 0.5 mg L 、1 mg L 、1.5 mg L 和 2 mg L 的 BA
培养基上 ,山荷叶嫩叶的叶柄不能诱导形成愈伤
组织.而在含上述浓度 BA 培养基上 ,再分别加入
1.5 mg L 的 NAA或 1.5 mg L 2 , 4-D的培养基
上 ,都能诱导山荷叶嫩叶的叶柄形成愈伤组织 ,愈
伤组织的诱导率为 46.25%～ 90%.单纯从愈伤组
织的诱导率看 ,BA浓度为 0.5 mg L ,2.4-D浓度
为1.5 mg L的 6号培养基上最高 ,但若从愈伤组
织的长势及外部性状上看 , 在 BA 浓度为
0.5 mg L ,NAA浓度为 1.5 mg L 的 5号培养基上
为最好.在这一培养基上诱导的愈伤组织不仅颜
色嫩绿 ,而且呈均匀的颗粒状(见图 1).
图 1　诱导的颗粒状愈伤组织
统计表明 ,一段长约 0.3 ～ 0.4 cm 的嫩叶柄 ,
经过 50 d的培养 , 可以形成 84 ～ 216个直径为
0.1 cm左右的绿色的愈伤组织颗粒.这样的愈伤
组织为具有分化能力的愈伤组织[ 4] .对在 5号培
养基上诱导的愈伤组织 ,进行继代增殖培养 ,连续
继代 13代 ,所形成的愈伤组织不仅外观上保持不
变.并且每继代增殖培养一代(40 d),每一个颗粒
基本可以形成 94 ～ 166个一致的颗粒.这说明MS
+La(NO3)3·6H2O 1.2 mg L+BA 0.5 mg L+NAA
1.5mg L是诱导山荷叶嫩叶的叶柄形成具有分化
能力愈伤组织的理想培养基.
2.2　愈伤组织的分化培养
取5号培养基上绿色颗粒状愈伤组织 ,接种
到附加不同浓度 BA 、IAA 、NAA的MS+La(NO3)3·
6H2O 1.2 mg L 培养基上 ,进行愈伤组织分化培
养 ,第 24 d可见分化出绿色的芽点 ,第 60 d可见
形成大量的丛生不定芽.
由表 2可知 ,在 5 号培养基上诱导出的愈伤
组织 ,在只含有 BA和同时含有 BA 和NAA 的MS
+La(NO3)3·6H2O 1.2 mg L的培养基上愈伤组织
不能分化 ,而在含有 0.5 mg L BA和0.2 mg L IAA
的MS+La(NO3)3·6H2O 1.2 mg L 培养基上 ,愈伤
组织颗粒分化率达 92%.结果表明 ,在该培养基
上 ,不仅分化率高 ,而且分化的丛生不定芽长势较
好(见图 2),这表明 MS+La(NO3)3·6H2O 1.2 mg
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L+BA 0.5mg L+IAA 0.2mg L的 22号培养基是 山荷叶愈伤组织分化的理想培养基.
表 2　不同浓度的激素对愈伤组织分化的影响
培养基
编号
浓度 (mg L)
BA NAA IAA
接种颗
粒数量
分化不
定芽数 分化率 % 长势
0 0 0 0 100 0 0
13 0.1 0 0 100 0 0
14 0.5 0 0 100 0 0
15 1 0 0 100 0 0
16 1.5 0 0 100 0 0
17 0.1 0.2 0 100 0 0
18 0.5 0.2 0 100 0 0
19 1 0.2 0 100 0 0
20 1.5 0.2 0 100 0 0
21 0.1 0 0.2 100 68 68 ++
22 0.5 0 0.2 100 92 92 ++
23 1 0 0.2 100 80 80 +++
24 1.5 0 0.2 100 36 36 +
注:+++为长势好;++为长势较好:+为长势一般
图 2　愈伤组织分化苗
2.3　不定芽生根培养
取22号培养基上的丛生不定芽 ,接种到以
MS或 1 3MS 为基本培养基 ,附加不同浓度 IAA 的
生根培养基中进行生根培养.30 d后 ,以 1 3MS 为
基本培养基的生根效果好于 MS.在 1 3MS+IAA
0.5 mg L 的培养基上不仅平均生根数为 7.4条
株 ,生根率达 96%,而且植株生长旺盛 ,生长速度
快.结果表明 1 3MS+IAA 0.5 mg L 这一培养基是
山荷叶不定芽生根培养的理想培养基.
2.4　试管苗移栽及长势
将生根试管苗培养瓶的瓶塞打开 ,放在光照
约2 000 lx 左右的条件下炼苗3 ～ 4 d后取出 ,用清
水洗去基部的培养基 ,移栽到园土 、黄土 、河沙和
炉灰渣四种不同基质的花盆中 , 25 d时统计分析
发现:以炉灰渣为基质 ,移栽的成活率为 91%,并
且长势旺盛(见图 3).
图 3　移栽成活苗
将生长旺盛的盆栽山荷叶试管苗于 5 月中
旬 ,移栽到试验材料的原产地庄河步云山野生山
荷叶正常生长的林下 ,当年植株长势旺盛 ,叶片比
自然生长的植株小三分之一左右 ,株高矮约二分
之一.对根系进行观察表明 ,试管苗正常生长 3个
59　　　　　第 1 期　　　　　　　张恒庆 , 等:山荷叶的组织培养及无性系建立的研究
月后 ,根系发达 ,相当于地上部的 2倍.第二年观
察证明 ,试管苗与野生植株生长一致 ,难以区别.
3　讨论
虽然目前已多有虎耳草科植物组织培养的报
道[ 5 ～ 8] ,但迄今未见大叶子属植物组织培养及无性
系建立的报道.
以山荷叶的嫩叶柄为材料 ,进行了组织培养
研究 ,成功地诱导了愈伤组织 ,建立起山荷叶的无
性系 ,不仅可以提供在较低温度下能够越冬 、长势
整齐的山荷叶种苗 ,而且为山荷叶的种质保存 、防
止或延缓这种濒危植物的灭绝提供可行的技术途
径.由此还能证明 ,山荷叶非分生组织和细胞也具
有全能性.
山荷叶嫩叶柄诱导的颗粒状愈伤组织 ,在继
代培养中一个颗粒 40 d 可以形成 94 ～ 166个颗
粒 ,并且分化率达 92%.这说明通过这种人工方
法 ,山荷叶每年可以繁殖出大量无性系后代 ,从而
可以满足保存种质和生产上对大量种苗需求 ,还
可以把这种愈伤组织作为转基因研究材料 ,对山
荷叶进行基因工程的研究.
把山荷叶生长旺盛盆栽的试管苗移栽到原产
地进行栽培 ,试管苗与野生植株生长一致.说明通
过组织培养的方法建立起山荷叶无性系能够保持
种质遗传特性.而在栽培的初期植株长得较小 ,这
是由于在进行试管苗的培养中 ,由于空间极其狭
小 ,生长环境特殊 , 导致移栽初期试管苗生长不
良 ,植株瘦小引起的;但在试验中 ,栽培后期的山
荷叶试管苗出现了根系非常发达的现象.这可能
与以下原因有关:一是用于研究的材料是选择长
势最旺盛的植株 ,材料本身就具有促进根系非常
发达的遗传性;二是在生根培养过程中 ,培养基中
加入了 IAA , IAA的后效作用也促进了试管苗根系
的生长.
参 考 文 献 :
[ 1] 　中国科学院植物研究所.中国高等植物图鉴(第二
册)[ M] .北京:科学出版社.1972.
[ 2] 　李书心.辽宁植物志[ M] .沈阳:辽宁科学技术出版
社.1991.
[ 3] 　姜长阳.植物组织培养中琼脂用量的商榷[ J] .植物
生理学通讯.1992 ,(2):155.
[ 4] 　安利佳 , 姜长阳.植物组织培养导论[ M] .大连:辽宁
师范大学出版社.1993.
[ 5] 　史定胜.野生大花溲疏植物组织培养和快速繁殖
[ J] .植物生理学通讯 , 2006 , (1):68.
[ 6] 　戴小英.虎耳草及其组织培养技术[ J] .江西林业科
技 , 2004 ,(6):13-15.
[ 7] 　贾瑞冬.梅花草的组织培养和快速繁殖[ J] .植物生
理学通讯 , 2005 ,(6):798.
[ 8] 　李树丽 , 石文山.欧洲绣球的组织培养和快速繁殖
[ J] .植物生理学通讯 , 2005 , (4):498.
Establishment of Regeneration Clones Tissue and
Culls of Astilbodies Tabularis(Hemsl.)Engles
ZHANG Heng-qing , SUN Yi
(Biology Scientific College , Liaoning Normal University , Dalian 116029 , China)
Abstract:　The conditions for induction differentiation , radication , transplantation of the callus of Astilbodies
tabularis(Hemsl).Engles were studied and its regenerative clone was established.The best medium for callus in-
duction is MS+La(NO3)3·6H2O 1.2 mg L+BA 0.5 mg L+NAA 1.5 mg L.The high differentiation frequency
was obtained in MS+La(NO3)3·6H2O 1.2 mg L+BA 0.5 mg L+IAA 0.2mg L and 1 3 MS+IAA 0.5 mg L is
the suitable culture medium for radication.With cinder used as medium , a survival ration of 91%for graft was ob-
served.The test tube plantlet grew naturally in original producting area.
Key words:　Astilbodies tabularis(Hemsl.)Engles;callus;clone.
(责任编辑　李　超)
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