全 文 ：Tab 5 Results of analysis of variance
方差来源 离均差平方和 自由度 方差 F值 显著性
A 2． 3 × 10 －2 2 0． 012 10． 835 *
B 1． 6 × 10 －2 2 0． 008 7． 309
C 2． 0 × 10 －3 2 0． 001 0． 938
D 2． 0 × 10 －3 2 0． 001
注:F0． 05(2，2)= 19． 00;F0． 1(2，2)= 9． 00
方差分析结果表明，A 因素对黏附片的黏附力
和释放度具有显著性影响，结合直观分析，A3 ＞ A2
＞ A1，故选择 A3。在保证贴片黏附和释放性能的前
提下，应尽量提高药片的载药量，故选择 B2，C 选择
最低水平 C1，综合考虑确定最佳工艺为 A3B2C1，即
CP934P-HPC(1∶ 2)，载药量 20%，乳糖加入量 4%，
压制成 50 mg。
2． 6 验证试验 按照上述最佳工艺，取适量总黄
酮加入填充剂乳糖、生物黏附剂卡波姆和羟丙基纤
维素，混匀后，过 80 目筛。将上述物料放入冲模压
片，再均匀加入乙基纤维素，压制成直径为 6 mm，质
量 50 mg 的药片。重复试验 3 批，测定体外黏附力
和释放度。结果黏附力分别为86． 86，84． 95，87． 50
g·cm －2;体外释放度分别为68． 9%，69． 5%，71． 2%，
表明该工艺制备的贴片黏附力和替外释放度重复性
较好。
3 讨论
乳糖作为可溶性填充剂，在片剂中可作为水溶
性孔道调整整个体系的释药速度，处方中 CP934p
和 HPC联合使用，黏附力最强，可以有效地将药片
黏附于口腔部位，但当乳糖含量增加时，黏附材料与
口腔接触面上的单位面积的功能基团数量减少，因
此，黏附力会有一定程度的降低。
本研究优选的成型工艺可产生较好的黏附作
用，保护层则可起到赋形作用，并保护创面，同时还
可阻断外界因素对溃疡面的刺激，减轻患者痛苦。
该剂型使药物仅向内侧释放，减轻了药物不适口味，
增大药物浓度梯度，使药物缓慢释放吸收，则可达到
长效目的，发挥最佳治疗作用。
参考文献:
［1］ 中国药典．一部［S］． 2010:333-334．
［2］ 陈晓兰，杜守颖，陆洋，等． 丹皮酚体外粘膜渗透性及影响因素
的考察［J］． 中国中药杂志，2009，34(24):3207-3209．
［3］ 陆洋，杜守颖，姚宗玲，等． 栀子提取物黏膜渗透影响因素研究
［J］． 中国中药杂志，2009，34(3):272-274．
［4］ 段晓颖，高卫芳，张辉，等．愈溃生物黏附贴膜体外释放与离体
黏膜的渗透作用［J］． 中国医院药学杂志，2011，31(13):
1081-1083．
［5］ 李华凌． 尼索地平口腔黏附片的研制与家兔体内药动学的研
究［D］． 济南:山东大学硕士学位论文，2006．
［6］ Singh S，Jain S，Muthu MS，et al． Preparation and Evaluation of
Buccal Bioadhesive Films Containing Clotrimazole． AAPS Pharm-
SciTech． 2008，9(2):660-667．
［7］ 高朝霞，蒋学华，张川川，等． 体外黏附力的测定及在生物黏附
制剂处方筛选的试用［J］． 中国医药工业杂志，2006，37(9):
606-608．
［8］ 朱盛山，刘艳，张志鹏，等． 缓控释制剂体外释放度的研究进展
［J］． 时珍国医国药，2011，22(3):701-703．
［9］ 李晓燕，冯中，霍务贞，等．止咳平喘缓释片体外释放度的研究
［J］．中国中药杂志，2009，34(10):1216-1219．
［10］ 乔艳丽． 苯扎贝特缓释片的研究［D］． 天津:天津大学药物科
学与技术学院，2012． 23-25．
［11］ Singh S，Soni R，Rawat M K，et al． In vitro and in vivo evaluation of
buccal bioadhesive films containing salbutamol sulphate［J］． Chem
Pharm Bull(Tokyo)，2010，58(3):307-3011．
［12］ 段晓颖，闫艳仓，平佳宜，等． 中药口腔生物黏附制剂的研究进
展［J］． 中国药事，2011，25(5):503-506．
［13］ 李丁，王健，侯惠民． 口腔黏膜给药系统研究进展［J］． 中国医
药工业杂志，2009，40(4):303-307．
［14］ 盛丰． 生物粘附给药系统研究概述［J］． 中国医学工程，
2010，18(2):180-181．
［15］ 戴亦晖，王小虹，戴晓东． 口腔黏膜黏附制剂的研究应用［J］．
临床军医杂志，2008，36(3):448-450．
［16］ 陈磊，周亚球． 乙基纤维素在缓控释药物制剂中的应用［J］．
安徽医药，2008，12(1):8-9．
［收稿日期］2014-08-18
［作者简介］范茜茜，女，研究生，电话:027-68890103，E-mail:857784894@ qq． com ［通讯作者］许汉林，男，教授，研究方向:中药新制剂、新剂
型及新技术的研究，电话:027-68890103，E-mail:Xhl4201@ sina． com
高效液相色谱法测定川续断中熊果酸、齐墩果酸、马钱苷和川续断皂苷
Ⅵ的含量
范茜茜，葛庆，彭翠香，许汉林 (湖北中医药大学药学院，湖北 武汉 430065)
［摘要］ 目的:利用高效液相色谱法( HPLC) 建立川续断中熊果酸、齐墩果酸、马钱苷和川续断皂苷Ⅵ4 种指标成分的含量测
定方法。方法:( 1) 测定熊果酸、齐墩果酸色谱条件为:色谱柱: Agilent ZORBAX SB-C18 ( 4． 6 mm × 250 mm，5 μm) ;流动相:甲
醇-0． 2%醋酸铵水溶液( 86∶ 14) ;流速: 0． 9 ml·min －1 ;柱温: 25 ℃ ;检测波长: 210 nm。( 2) 测定马钱苷、川续断皂苷Ⅵ色谱条
件为:色谱柱: Agilent ZORBAX SB-C18 ( 4． 6 mm × 250 mm，5 μm) ;流动相: 0 ～ 8 min 乙腈-水( 15∶ 85) ，8 ～ 10 min 乙腈-水( 25∶
75) ，10 ～ 28 min乙腈-水( 30∶ 70) ;流速: 0． 8 ml·min －1 ;柱温: 25 ℃ ;分别在 240 nm、210 nm的波长条件下检测马钱苷和川续断
·539·中国医院药学杂志 2015 年 5 月第 35 卷第 10 期 Chin Hosp Pharm J，May 2015，Vol 35，No． 10
皂苷Ⅵ。结果:( 1) 熊果酸在5． 20 ～ 520 μg·ml －1范围内线性关系良好，r = 0． 999 7;平均回收率为96． 4%，RSD为0． 96% ;齐墩
果酸在5． 64 ～ 564 μg·ml －1范围内线性关系良好，r = 0． 999 8;平均回收率为97． 7%，RSD 为1． 66%。( 2) 马钱苷在6． 04 ～ 604
μg·ml －1范围内线性关系良好，r = 0． 999 9;平均回收率为99． 4%，RSD为1． 35%，川续断皂苷Ⅵ 6． 28 ～ 628 μg·ml －1范围内线
性关系良好，r = 1． 000;平均回收率为97． 7%，RSD为0． 90%。结论:该方法简单、准确可行，结果稳定可靠，可为川续断的质量
控制提供科学依据。
［关键词］ 熊果酸;齐墩果酸;马钱苷;川续断皂苷Ⅵ;续断;高效液相色谱法
［中图分类号］R284 ［文献标识码］A ［文章编号］1001-5213(2015)10-0935-04 DOI:10． 13286 / j． cnki． chinhosppharmacyj． 2015． 10． 18
Contents of ursolic acid，oleanolic acid，loganin and akebia saponin D in Dipsacus asper de-
termined by HPLC
FAN Xi-xi，GE Qing，PENG Cui-xiang，XU Han-lin (Faculty of Pharmacy，Hubei University of Chinese Medicine，Hubei
Wuhan 430065，China)
ABSTRACT:OBJECTIVE To establish the method to measure contents of ursolic acid，oleanolic acid，loganin and akebia saponin
D in Dipsacus asper by high performance liquid chromatography (HPLC)． METHODS Chromatographic conditions for content deter-
mination of ursolic acid and oleanolic acid:column:Agilent ZORBAX SB-C18(4． 6 mm × 250 mm，5 μm);mobile phase:methanol-
2% ammonium acetate aqueous solution (86∶ 14);flow velocity:0． 9 ml·min －1;column temperature:25 ℃;detection wavelength:
210 nm． Chromatographic conditions for content determination of loganin and akebia saponin D:column:Agilent ZORBAX SB-C18
(4． 6 mm × 250 mm，5 μm);mobile phase:0 － 8 min acetonitrile-water (15∶ 85)，8 － 10 min acetonitrile-water (25∶ 75)，10 － 28
min acetonitrile-water (30∶ 70);flow velocity:0． 8 ml·min －1;column temperature:25 ℃;detection wavelength:240 nm and 210
nm． RESULTS Good linearity within the range of 5． 20 － 520 μg·ml －1 for ursolic acid，5． 64 － 564 μg·ml －1 for oleanolic acid，6． 04
－ 604 μg·ml －1 for loganin and 6． 28 － 628 μg·ml －1 for akebia saponin D． The average recovery of them were 96． 4%，97． 6%，
99． 4% and 97． 7%，respectively． CONCLUSION The method is simple，accurate and feasible． The results are stable and relia-
ble． And can provide a scientific basis for quality control of Dipsacus asper．
KEY WORDS:ursolic acid;oleanolic acid;loganin;akebia saponin D;Dipsacus asper;HPLC
川续断(Dipsacus asper Wall． ex Henry)为川续
断科植物川续断的干燥根，《神农本草经》中首次记
载，具有补肝肾、强筋骨、续折伤、止崩漏之功效［1］，
临床上主要用于治疗腰膝酸软，风湿痹痛、崩漏、跌
打损伤［2］、先兆性及习惯性流产［3］等。川续断主要
含三萜及其苷类化合物，如川续断皂苷Ⅵ、微量齐墩
果酸和熊果酸［4］，环烯醚萜类化合物马钱苷等［5-6］，
以及其他一些生物碱、酚酸、挥发油类化合物［7-8］。
为了进一步研究和制定川续断药材质量标准奠定基
础，本试验通过建立高效液相色谱法来测定川续断
药材中熊果酸，齐墩果酸，马钱苷及川续断皂苷Ⅵ的
含量。
1 仪器与试药
1． 1 仪器 Aglient 1260 高效液相色谱仪(美国安
捷伦公司);DAD 紫外检测器;Aglient OpenLAB 色
谱工作站;BP211D分析天平(十万分之一，德国 Sar-
torius公司);BP121S电子分析天平(万分之一，德国
Sartorius公司):SK2200H 型超声波清洗仪(上海科
导超声仪器有限公司)。
1． 2 试药 川续断皂苷Ⅵ对照品(含量≥91． 3%，
批号 111685-201305)、熊果酸对照品(供含量测定
用、批号 110742-201220)、齐墩果酸对照品(供含量
测定用，110709-201206)均为中国食品药品检定研
究院;马钱苷对照品(20140516，含量≥98%，上海金
穗生物科技有限公司);甲醇、乙腈(TEDIA 色谱
纯);水为纯净水;续断药材(采购自湖北鹤峰县，经
我院生药教研室张秀桥教授鉴定为川续断科植物川
续断 Dipsacus asperoides Wall． ex Henry的干燥根，符
合中国药典 2010 年版一部药材项下有关规定)。
2 方法与结果
2． 1 色谱条件
2． 1． 1 熊果酸、齐墩果酸色谱条件 色谱柱:Agi-
lent ZORBAX SB-C18(4． 6 mm × 250 mm，5 μm);流
动相:甲醇-0． 2%醋酸铵水溶液(86∶ 14);流速:0． 9
ml·min －1;柱温:25 ℃;检测波长:210 nm，所测组分
在 23 min内出完。HPLC色谱图见图 1。
2． 1． 2 马钱苷、川续断皂苷Ⅵ色谱条件 色谱柱:
Agilent ZORBAX SB-C18(4． 6 mm × 250 mm，5 μm);
流动相:乙腈-水梯度洗脱:0 ～ 8 min(15∶ 85)，8 ～ 10
min(25 ∶ 75)，10 ～ 28 min(30 ∶ 70);流速:0． 8 ml·
min －1;柱温:25 ℃;双波长通道检测:分别在 240
nm、210 nm的波长条件下检测马钱苷和川续断皂苷
·639· 中国医院药学杂志 2015 年 5 月第 35 卷第 10 期 Chin Hosp Pharm J，May 2015，Vol 35，No． 10
Ⅵ，所测组分在 30 min 内出完。HPLC 色谱图见图
2。
A．对照品;B．供试品;1-齐墩果酸(Rt = 20． 555 min);2-熊果酸(Rt =
21． 632 min)
A． reference substance;B． sample;1-oleanolic acid (Rt = 20． 555
min);2-ursolic acid (Rt = 21． 632 min)
图 1 高效液相色谱图
Fig 1 HPLC chromatogram
C．对照品;D．供试品;1-马钱苷(Rt = 8． 278 min);2-川续断皂苷Ⅵ
(Rt = 25． 931 min)
C． reference substance;D． sample;1-loganin (Rt = 8． 278 min);2-akebia
saponin D (Rt = 25． 931 min)
图 2 高效液相色谱图
Fig 2 HPLC chromatogram
2． 2 溶液制备
2． 2． 1 对照品溶液 精密称取对照品熊果酸2． 60
mg、齐墩果酸2． 82 mg、马钱苷3． 02 mg、川续断皂苷
Ⅵ 3． 14 mg分别置于 5 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀
释至刻度，摇匀，配制成质量浓度分别为 520 μg·
ml －1、564 μg·ml －1、604 μg·ml －1、628 μg·ml －1的对
照品溶液，精密吸取上述 4 种对照品溶液各0． 1、
0． 4、1． 0、2． 0 ml 分别置于 10 ml 量瓶中，加甲醇溶
解并稀释至刻度线，摇匀，备用。
2． 2． 2 供试品溶液 取续断药材粉末(过 4 号筛)
5 g，精密称定，置于索氏提取器中，以石油醚回流
(30 ～ 60 ℃)2 h，弃去石油醚部位，再以乙醚回流提
取 5 h，水浴加热挥干乙醚，残渣以甲醇定容至 25
ml，经0． 45 μm 孔径微孔滤膜过滤，作为测定熊果
酸、齐墩果酸的供试品溶液。另取续断药材粉末
(过 4 号筛)0． 5g，精密称定，置于具塞三角锥形瓶
中，加入 25 ml甲醇，密塞，称重，超声(功率 250 W，
频率 53 kHz)处理 30 min后，放冷，甲醇补足减失重
量，摇匀，过滤，续滤液再经0． 45 μm 孔径微孔滤膜
过滤，作为测定马钱苷、川续断皂苷Ⅵ的供试品溶
液。
2． 3 精密度试验 取配好的已知浓度对照品溶
液，分别重复进样 5 次，进样量 20 μl，测定峰面积，
测得 RSD ＜2%。
2． 4 标准曲线及线性范围试验 取“2． 2． 1”项下
配好的一系列不同质量浓度的对照品溶液，进样量
20 μl，以峰面积积分值为纵坐标，对照品浓度为横
坐标绘制标准曲线，计算回归方程得:齐墩果酸 Y =
12． 686X － 63． 075，r = 0． 999 8;熊果酸 Y = 12． 786X
－ 76． 12，r = 0． 999 7;马钱苷 Y = 30． 633X + 46． 28，r
= 0． 999 9;川续断皂苷ⅥY = 6． 333X － 4． 8704，r =
1． 000。
齐墩果酸、熊果酸、马钱苷、川续断皂苷Ⅵ分别在
5． 64 ～ 564 μg·ml －1、5． 2 ～ 520 μg·ml －1、6． 04 ～ 604
μg·ml －1、6． 28 ～628 μg·ml －1范围内线性关系良好。
2． 5 稳定性试验 按照“2． 2． 2”项下方法分别制
备齐墩果酸、熊果酸供试品溶液和马钱苷、川续断皂
苷Ⅵ供试品溶液，分别于 0、4、8、12、24 h 进样，进样
量 20 μl，分别测定峰面积。测得 RSD 分别为 1．
59%、1． 07%、1． 53%、0． 39%。表明样品中齐墩果
酸、熊果酸、马钱苷及川续断皂苷Ⅵ均在 24 h 内稳
定。
2． 6 重复性试验 按照“2． 2． 2”项下方法分别制
备 5 份供试品溶液，按照“2． 1”项下的色谱条件测
定，结果熊果酸、齐墩果酸、马钱苷及川续断皂苷Ⅵ
含量 RSD 分别为1． 37%、1． 01%、1． 56%、1． 57%，
表明方法重复性好。
2． 7 加样回收试验 分别取已知含量的样品各 6
份，精密称定，分别按 1∶ 0． 8，1∶ 1，1∶ 1． 2的比例加入
熊果酸、齐墩果酸、马钱苷及川续断皂苷Ⅵ对照品，
按“2． 2． 2”项下的供试品制备方法制备，测定含量，
计算得熊果酸、齐墩果酸、马钱苷及川续断皂苷Ⅵ加
样回收率分别为96． 4%，97． 6%，99． 4%，97． 7%，
RSD分别为0． 96%，1． 66%，1． 35%，0． 90%。表明
回收率好，方法可行。
2． 8 样品含量测定 按“2． 2． 2”项下方法处理样
品，并按“2． 1”项下的色谱条件测定 3 批次样品中
熊果酸、齐墩果酸、马钱苷及川续断皂苷Ⅵ的含量。
测得 4 种成分的平均含量分别为0． 204 mg·g －1，
0． 070 mg·g －1，0． 985 mg·g －1，18． 113 mg·g －1。结果
·739·中国医院药学杂志 2015 年 5 月第 35 卷第 10 期 Chin Hosp Pharm J，May 2015，Vol 35，No． 10
见表 1。
表 1 样品含量测定结果(mg·g －1)
Tab 1 Results of content determination for samples (mg·g －1)
批号
成分
熊果酸 齐墩果酸 马钱苷 川续断皂苷Ⅵ
120915 0． 203 0． 070 0． 992 17． 925
130904 0． 204 0． 069 0． 968 18． 223
140822 0． 205 0． 072 0． 995 18． 191
3 讨论
3． 1 供试品溶液的制备 川续断中上述 4 种化学
成分的极性大小依次为:马钱苷 ＞川续断皂苷Ⅵ ＞
齐墩果酸 ＞熊果酸，且前两种极性远大于后两种，其
中马钱苷在水中极易溶解，1 g 川续断皂苷Ⅵ熔于
87 ml 水、3 ml 沸水，极性较马钱苷弱，两者几乎不
溶于石油醚、乙醚、丙酮和氯仿;齐墩果酸和熊果酸
能溶于苯、氯仿、乙醚，不溶于水和石油醚。本实验
在选择提取方法时，曾采用甲醇超声提取，试着用一
种制备方法将续断中这 4 个成分一并提取出来，但
是提取效果并不理想。齐墩果酸和熊果酸的峰面积
非常低，甚至没有。原因可能是药材中齐墩果酸和
熊果酸的含量太低，供试品制备过程中对稀释倍数
有限制，且甲醇超提的选择性较差，所得溶液中其他
杂质成分较多，稀释倍数若太小，供试品溶液颜色
深、黏度较大，不适于进 HPLC，并对测定齐墩果酸
及熊果酸的干扰大。所以本实验采用 2 种制样方
法，分别针对性地制备 4 种成分。通过参考中国药
典 2010 年版，马钱苷和川续断皂苷Ⅵ的提取溶剂选
择甲醇。因齐墩果酸和熊果酸不溶于石油醚，易溶
于乙醚，故选择乙醚为提取溶剂，且在供试品溶剂的
制备中先以石油醚回流 2 h，以便消除脂溶性成分的
干扰，再以乙醚回流提取，结果表明提取效果较理
想。
3． 2 吸收波长的选择 通过参考中国药典以及本
实验所用安捷伦高效液相色谱仪 DAD 检测器在
190 ～ 400 nm波长范围内的扫描，综合考虑基线平
稳，信噪比相对较高等因素，确定马钱苷吸收波长为
240 nm［9］，川续断皂苷Ⅵ吸收波长为 210 nm［10］，齐
墩果酸及熊果酸吸收波长为 210 nm［11］。
3． 3 齐墩果酸及熊果酸的分离 齐墩果酸和熊果
酸是 2 种五环三萜类化合物，结构和极性都极为相
似，文献报道的分析测定方法较多，如薄层扫描法，
通常测定的量为两者总和，重复性较差;气相色谱法
因需衍生化使操作复杂;毛细管电泳法虽有操作优
势但仪器价格昂贵;而 HPLC法因其操作简便、灵敏
度、精密度及重复性好的特点，目前已成为测定齐墩
果酸及熊果酸含量的主要方法［12］。本实验采用
HPLC 分离并测定两者含量，为了达到较理想的分
离度和较好的峰形，流动相中选用了低浓度的磷酸、
甲酸、冰醋酸缓冲盐，其中冰醋酸对改善拖尾效果较
好，但两成分的分离度差;为了改变峰形，提高分离
度，当改用 0． 2%的醋酸铵缓冲盐后，峰形变瘦高，
分离度也得到较好改善，计算得分离度达到2． 6，方
法稳定可行。实验中为了改善有机铵存在产生的末
端吸收带来的干扰，可以通过增加色谱柱的平衡时
间，适当增加供试品溶液的浓度得以解决。
参考文献:
［1］ 王岩，周莉玲，李锐． 川续断的研究进展［J］． 时珍国医国药，
2002，13(4):233-234．
［2］ 卿茂盛，陈小砖，邹志鹏． 续断对大鼠骨质疏松性骨折愈合影
响的生物力学验研究［J］．中国医学物理学杂志，2002，19(3):
159-160．
［3］ Zhao YM，Shi YP． Phytochemicals and biological activities of dip-
sacus species［J］． Chem Biod，2011，8(3):414-430．
［4］ 高秀芝，马鲁豫，金艳霞，等．川续断化学成分及药理作用研究
进展［J］．亚太传统医药，2010，6(7):142-146．
［5］ 朱奇，冯泳泉，叶水利．高效液相色谱法测定五鹤续断药材中
齐墩果酸的含量［J］．医药导报，2010，29(9):1218-1219．
［6］ 金小平，刘静幽，马丹，等．五鹤续断中熊果酸的含量测定［J］．
医药导报，2010，29(11):1481-1483．
［7］ 武芸，丁莉，张弛．五鹤续断中总生物碱的质量分数分析［J］．
湖北民族学院学报(自然科学版)，2006，(2):199-201．
［8］ Hung TM，Na M，Thuong PT，et al． Antioxidant activity of caffeoyl
quinic acid derivatives from the roots of Dipsacus asper Wall［J］． J
Ethnopharmacol，2006，108(2):188-192．
［9］ 姜慧祯，林娜．至宝三鞭丸中马钱苷的含量测定［J］．西北药学
杂志，2011，26(1):31-33．
［10］ 彭键．高效液相色谱法测定跌打丸中川续断皂苷Ⅵ的含量
［J］．中南药学，2012，10(1):25-28．
［11］ 张桥，沈娟，柳于介，等．高效液相色谱法测定中药凌霄花中麦
角甾苷、齐墩果酸和熊果酸含量［J］． 中国中药杂志，2011，36
(8):1043-1045．
［12］ 黄浩，邹盛勤． RP-HPLC法测定提宗龙胆和线叶龙胆部位中不
同齐墩果酸和熊果酸含量［J］． 药物分析杂志，2013，33(7):
1239-1242．
［收稿日期］2014-11-20
·839· 中国医院药学杂志 2015 年 5 月第 35 卷第 10 期 Chin Hosp Pharm J，May 2015，Vol 35，No． 10