全 文 ：收稿日期:2007-10-16
作者简介:孙华(1977-), 女(汉族),天津人 , 博士研究生 , E-mail:sunhua-6201@hotmail.com;方唯硕(1967-), 男
(汉族), 北京人 ,研究员 , 博士生导师 ,从事抗肿瘤药物的研究 , Tel:(010)63165229 , E-mail:wfang@imm.
ac.cn。
文章编号:1005-0108(2008)01-0011-05
3-氧代齐墩果酸氨基酸偶联物的合成 、
水溶性的测定及抗肿瘤活性研究
孙 华1 , 2 ,胡 春2 ,方唯硕1
(1.中国医学科学院 北京协和药物研究所 ,北京 100050;2.沈阳药科大学 制药工程学院 ,辽宁 沈阳 110016)
摘　要:目的 设计合成 3-氧代齐墩果酸氨基酸偶联物 , 并测试其水溶性和体外抗肿瘤活性。方法 利用 HPLC
法测定具有代表性结构的偶联物的水溶性 ,并采用 MTT 法测试这些偶联物对 KB 和 KB/V 两种癌细胞的抑
制活性。结果 共合成 9 个新化合物 ,其结构经核磁共振氢谱和质谱确证。结论 被测试的 6 个偶联物的水溶
性与 3-氧代齐墩果酸相比有不同程度的改善 ,水溶性大小顺序是 5e>5g>5c>5d>5a>5b和 3-氧代齐墩果
酸。初步体外抗肿瘤活性结果表明 ,水溶性较高的偶联物(5e , 5g , 5c)仍保持抗肿瘤活性。
关键词:合成;抗肿瘤活性;3-氧代齐墩果酸;偶联物;水溶性
中图分类号:R914　　　文献标志码:A
Synthesis ,water solubility and antitumor activity of amino
acid conjugates of 3-oxooleanolic acid
SUN Hua1, 2 ,HU Chun2 , FANG Wei-shuo1
(1.Inst itute of Materia Medica , Chinese Academy of Medical Sciences ,Bei jing 100050 , China;
2.School of Pharmaceutical Engineering ,Shenyang Pharmaceutical University , Shenyang 110016 , China)
Abstract:Aim To design and synthesize a series of amino acid conjugates of 3-oxooleanolic acid , and to de-
termine their w ater solubili ty and antitumor activi ties in vi tro.Methods Water solubility of representative
synthesized conjugates were determined w ith HPLC.Their antitumor activi ties were evaluated using KB and
KB/V cells by M TT .Results Nine new compounds were obtained and characterized by 1H-NMR spect ra
and ESI-MS.Conclusion Water solubility of six conjugates show ed various deg rees improvement than 3-ox-
ooleanolic acid.The order of water solubility is 5e>5g>5c>5d>5a>5b and 3-oxooleanolic acid.Prelimi-
nary antitumor bioassay showed that conjugates bearing higher w ater solubility retained antitumor activity.
Key words:synthesis;anti tumor activi ty;3-oxooleanolic acid;conjugates;water solubility
　　齐墩果酸(oleanolic acid , 1)是从女贞子等植
物中分离得到的五环三萜类化合物 ,具有多种药
理活性[ 1] 。齐墩果酸经氧化得到的 3-氧代齐墩
果酸(2)的抗肿瘤活性明显提高 ,对 KB(人口腔
鳞癌细胞)具有较高的选择性 ,并且对正常细胞毒
性较小[ 2] ,但是 , 3-氧代齐墩果酸水溶性差 ,因而
影响其生物利用度。文献[ 3]报道 ,三萜化合物白
桦脂酸连接上一系列氨基酸后可提高其水溶性 ,
并保持其细胞毒活性。因此 ,本文作者以提高 3-
氧代齐墩果酸水溶性为目的 ,设计并合成了 9个
未见文献报道的 3-氧代齐墩果酸氨基酸偶联物 ,
并测试了部分偶联物的水溶性以及对 KB和 KB/
V(抗长春新碱的人口腔鳞癌细胞)的抑制活性 。
齐墩果酸经琼斯试剂氧化得到 3-氧代齐墩
第 18 卷　第 1 期
2008 年2月　总 81期
中 国 药 物 化 学 杂 志
Chinese Journal o f Medicinal Chemistry
Vol.18　No.1　p.11
Feb.2008 Sum 81
DOI :10.14142/j.cnki.cn21-1313/r.2008.01.010
果酸(2),2与草酰氯反应得到 3-氧代齐墩果酰氯
(3),化合物 3再与不同的氨基酸乙酯盐酸盐反应
得到 4a～ 4i ,最后经碱水解得到目标化合物 5a ～
5i ,合成路线见图 1。
a:Jone′s reagent , CH2Cl2 , 5 ℃;b:(COCl)2 , CH2Cl2 , r.t.;c:amino acid ethy l ester hydrochlo ride ,
Et3N , CH2Cl2 , 0 ℃;d:4 mol·L-1 NaOH , THF ,H2O , r.t.
Figure 1　The synthet ic route of conjugates 5a-5i
　　
1　合成实验
熔点用 Yanaco显微熔点仪测定 ,温度未经校
正。质谱采用 Agilent 1100 LC/MSD(ESI)液质
联用仪测定。高分辨质谱采用 Agilent LC/MSD
TOF(HR-ESI)液质联用仪测定。核磁共振氢谱
用 Varian Mercury -400 (400 MHz)和 Varian
Mercury -300(300 MHz)型核磁共振仪测定。
HPLC采用 Ag ilent 1100(USA)高效液相色谱仪
测定 ,采用 1100双元泵 ,二极管阵列多波长紫外
检测器 ,色谱柱为(150 mm×4.6 mm ,5 μm)XDB
-C18(Agilent)。
1.1　3-氧代齐墩果酸(2)的合成
齐墩果酸 2.0 g(4.4 mmol)溶于100 mL二氯
甲烷-丙酮(体积比 1∶1)的混合溶液中 ,冰浴冷却 ,
12 中 国 药 物 化 学 杂 志 第 18 卷
滴加琼斯试剂(2.0 mL),滴加用时约30 min ,保持
温度为5 ℃左右 ,滴加完毕 ,反应15 min ,向反应混
合物中加入异丙醇(1 mL)和水(4 mL), 搅拌
10 min。加入30 mL 水和 20 mL 二氯甲烷 ,分出有
机层 ,有机层用饱和氯化钠溶液(20 mL×2)洗涤 ,
干燥 ,浓缩 ,剩余物用甲醇重结晶 ,得针状结晶 ,mp
181.0 ～ 182.0 ℃(文献[ 4] :mp 178.0 ～ 179.0 ℃)。
1.2　3-氧代齐墩果酰氯(3)的合成
50 mg(0.11 mmol)化合物 2 溶于干燥的二
氯甲烷(2.5 mL)中 , 冷却至0 ℃, 加入草酰氯
54μL(0.55 mmol),搅拌反应 2 h。蒸除溶剂和
剩余的草酰氯 ,得白色固体。
1.3　N-(3-氧代齐墩果酰)氨基酸乙酯(4a ～ 4i)
的合成通法
按照文献[ 5] 的方法 , 将 3-氧代齐墩果酰氯
53 mg(0.11 mmol)溶于干燥的二氯甲烷中 ,冷却
至 0 ℃,加入氨基酸乙酯盐酸盐 0.55 mmol 和三
乙胺111 μL(1.10 mmol),搅拌4 h。加入 50 mL
二氯甲烷和50 mL水 ,分离有机层 ,有机层用饱和
氯化钠水溶液(30 mL×3)洗涤 ,干燥 ,蒸干 ,剩余
物经硅胶柱色谱(石油醚-丙酮 ,体积比 20∶1)纯
化 ,得 N-(3-氧代齐墩果酰)氨基酸乙酯 4a ～ 4i ,
收率 64%～ 93%。
1.4　N-(3-氧代齐墩果酰)氨基酸(5a ～ 5i)的合
成通法
将化合物 4a～ 4i(0.1 mmol)溶于2 mL四氢呋
喃-水(体积比 4∶1)的混合溶液中 ,加入浓度为
4 mol·L-1的氢氧化钠水溶液500μL(2.0 mmol),
室温搅拌 4 h。反应完毕 , 加 入 50 mL 水 , 用
0.3 mol·L-1的稀盐酸调 pH=2 ,反应液用二氯甲
烷(50 mL×3)萃取 ,合并有机层 ,用饱和氯化钠水
溶液(30 mL×2)洗涤 ,干燥 ,蒸干 ,剩余物经硅胶柱
色谱(石油醚-丙酮 ,体积比 10∶1)纯化 ,得目标化合
物5a ～ 5i ,收率为 65%～ 95%。
合成的 9个目标化合物及中间体 2的理化常
数及波谱数据见表 1。
Table 1　The physical and spectral data of conjugates 5a-5i and 2
Compd. mp/ ℃ Yield/ % ESI-MS m/ z 1H-NMR(CDCl3)δ
2① 181-182 100 455.4[ M+H] + 0.80(s , 3H , CH3), 0.90(s , 3H , CH3), 0.92(s , 3H , CH3),
1.02(s , 3H , CH3), 1.04(s , 3H , CH3), 1.08(s , 3H , CH3),
1.14(s , 3H , CH3), 2.31 -2.58(m , 2H , H-2), 2.68(dd ,
1H , J=4.5 Hz ,H-18), 5.30(t , 1H , J=3.3 Hz ,H-12)
5a① 152-153 95 526.4[ M+H] +;
524.3[ M-H] -;
HR-ESI-MS(+):
526.389 0[ M+H] +,
C33H52NO4 Calc.
for 526.389 0
0.77(s , 3H , CH3), 0.91(s , 6H , 2×CH3), 1.03(s , 6H , 2×
CH3), 1.08(s , 3H , CH3), 1.18(s , 3H , CH3), 1.44(d , 3H ,
J=6.9 Hz , H-3′), 2.32 -2.64(m , 2H , H-2), 2.57(m ,
1H ,H-18), 4.42(m , 1H , H-2′), 5.46(t , 1H , J =3.6 Hz ,
H-12), 6.59(d , 1H , J=6.0 Hz , CONH)
5b① 155-157 88 602.3[ M+H] +;
600.4 [ M-H] -;
HR-ESI-MS(+):
602.420 8[ M+H] +,
C39H56NO4 Calc.
for 602.420 3
0.68(s , 3H , CH3), 0.73(s , 3H , CH3), 0.88(s , 3H , CH3),
1.03(s , 3H , CH3), 1.04(s , 3H , CH3), 1.08(s , 3H , CH3),
1.11(s , 3H , CH3), 2.36 -2.64(m , 2H , H-2), 2.57(m ,
1H ,H-18), 3.08(m , 1H ,H-3′), 3.30(m , 1H ,H-3′), 4.64
(m , 1H ,H-2′), 5.19(t , 1H , J =3.3 Hz , H-12), 6.32(d ,
1H , J=5.4 Hz , CONH), 7.28(m , 5H , Ph-H)
5c② 181-183 87 542.3[ M+H] +;
540.4[ M-H] -;
HR-ESI-MS(+):
542.383 9[ M+H] +,
C33H52NO5 Calc.
for 542.383 6
0.77(s , 3H , CH3), 0.91(s , 3H , CH3), 0.92(s , 3H , CH3),
1.02(s , 3H , CH3), 1.03(s , 3H , CH3), 1.08(s , 3H , CH3),
1.18(s , 3H , CH3), 2.34 -2.61(m , 2H , H-2), 2.57(m ,
1H ,H-18), 3.75(m , 1H ,H-3′), 4.17(m , 1H ,H-3′), 4.39
(m , 1H , H-2′), 5.51(s , 1H , H-12), 6.82(d , 1H , J =
5.2 Hz , CONH)
(to be continued)
13第 1期 孙 华等:3-氧代齐墩果酸氨基酸偶联物的合成 、水溶性的测定及抗肿瘤活性研究
Continued Table 1
Compd. mp/ ℃ Yield/ % ESI-MS m/ z 1H-NMR(CDCl3)δ
5d① 174-175 81 618.3 [ M+H] +;
616.3[ M-H] -;
HR-ESI-MS(+):
618.414 5[ M+H] +,
C39H56NO5 Calc.
for 618.415 3
0.66(s , 3H , CH3), 0.79(s , 3H , CH3), 0.88(s , 3H , CH3),
1.01(s , 3H , CH3), 1.04(s , 3H , CH3), 1.08(s , 3H , CH3),
1.11(s , 3H , CH3), 2.32 -2.55(m , 2H , H-2), 2.26(m ,
1H ,H-18), 3.06(m , 1H ,H-3′), 3.18(m , 1H ,H-3′), 4.61
(m , 1H , H-2′), 5.20(s , 1H , H-12), 6.35(d , 1H , J =
5.1 Hz , CONH), 6.80(d , 2H , J=7.8 Hz , Ph-3′, 5′), 7.08
(d , 2H , J=7.8 Hz , Ph-2′, 6′)
5e② 235-236 76 584.3[ M+H] +;
582.3[ M-H] -;
HR-ESI-MS(+):
584.394 2[ M+H] +,
C35H54NO6 Calc.
for 584.394 5
0.74(s , 3H , CH3), 0.92(s , 3H , CH3), 1.01(s , 3H , CH3),
1.03(s , 3H , CH3), 1.08(s , 3H , CH3), 1.16(s , 3H , CH3),
1.25(s , 3H , CH3), 4.57(m , 1H , H-2′), 5.48(m , 1H , H-
12), 6.87(m , 1H , CONH)
5g① 177-178 92 526.4[ M+H] +;
560.4[ M+Cl] -;
HR-ESI-MS(+):
526.389 0[ M+H] +,
C33H52NO4 Calc.
for 526.389 0
0.82(s , 3H , CH3), 0.89(s , 6H , 2×CH3), 1.03(s , 6H , 2×
CH3), 1.08(s , 3H , CH3), 1.16(s , 3H , CH3), 2.38 -2.64
(m , 2H ,H-2), 2.56(m , 1H ,H-18 and 2H ,H-2′), 3.38(m ,
1H ,H-3′), 3.62(m , 1H ,H-3′), 5.37(t , 1H , J =3.3 Hz ,
H-12), 6.56(t , 1H , J=5.4 Hz , CONH)
5f① 65 632.3 [ M+H] + 0.66(s , 3H , CH3), 0.79(s , 3H , CH3), 0.88(s , 3H , CH3),
1.01(s , 3H , CH3), 1.04(s , 3H , CH3), 1.08(s , 3H , CH3),
1.11(s , 3H , CH3), 2.35(m , 1H ,H-2), 2.51(m , 1H , H-2),
2.26(m , 1H , H-18), 3.05(m , 1H , H-3′), 3.18(m , 1H , H-
3′), 3.70(s , 3H , OCH3), 4.61(m , 1H ,H-2′), 5.20(s , 1H , H-
12), 6.35(d , 1H , J =5.1 Hz , CONH), 6.80(d , 2H , J =
8.4 Hz , Ph-3′, 5′), 7.08(d , 2H , J=8.4 Hz , Ph-2′, 6′)
5h② 87 540.5[ M+H] + 0.78(s , 3H , CH3), 0.89(s , 6H , 2×CH3), 1.03(s , 6H , 2×
CH3), 1.07(s , 3H , CH3), 1.15(s , 3H , CH3), 2.35(t , 2H ,
J=6.8 Hz , H-2′), 2.35(m , 1H ,H-2), 2.52(m , 1H ,H-2),
2.54(m , 1H , H-18), 3.02(m , 1H , H-4′), 3.38(m , 1H , H-
4′),5.36(t , 1H , J =3.2 Hz , H-12), 6.04(t , 1H , J =
5.6 Hz , CONH)
5i② 79 568.5[ M+H] + 0.81(s , 3H , CH3), 0.90(s , 6H , 2×CH3), 1.04(s , 6H , 2×
CH3), 1.08(s , 3H , CH3), 1.16(s , 3H , CH3), 2.35(t , 2H ,
H-2″), 2.38(m , 1H , H-2), 2.54(m , 1H , H-2), 2.52(m ,
1H ,H-18), 3.01(m , 1H ,H-6″), 3.34(m , 1H ,H-6″), 5.33
(t , 1H , J =3.6 Hz , H-12), 6.41(t , 1H , J =5.6 Hz ,
CONH)
　　①1H-NM R 300 MHz;②1H-NMR 400 MHz
2　水溶性测定
目标化合物 5a ～ 5e 、5g和 3-氧代齐墩果酸各
1 mg 溶解于 2 mL 色谱级四氢呋喃中 ,滤膜过
滤 ,HPLC 法进行含量测定 ,每个样品进样 5 次 ,
进样量为 0.1 、0.5 、1 、5 、10μL ,在210 nm检测波
长下得到相应 5个不同进样量的绝对峰面积 ,绘
制每个样品进样量对应峰面积的标准曲线。另
外 ,取 5a ～ 5e 、5g和 3-氧代齐墩果酸各1 mg ,加入
1 mL 0.2 mol·L-1的磷酸缓冲液(pH =7.3 ,
23 ℃),振荡 ,使其充分溶解 ,滤膜过滤 ,得到 6个
样品的澄清水溶液 ,HPLC法测定含量 ,进样量均
为100 μL ,测得210 nm波长下的绝对峰面积 ,根
据已绘制的标准曲线 ,利用峰面积分别计算出相
应的进样量 ,从而计算出100 μL水溶液中含有 5a
～ 5e、5g和 3-氧代齐墩果酸的质量浓度 ,即目标
14 中 国 药 物 化 学 杂 志 第 18 卷
化合物在水中的溶解度(S)。5a ～ 5e、5g和 3-氧
代齐墩果酸的水溶性测试结果见表 2 。
Table 2　Water solubility of 5a～ 5e, 5g and 2
Compd. S /(m g·L-1) Compd. S/(mg·L-1)
5a 1.503 5e 9.067
5b <1.000 5g 3.207
5c 1.777 2 <1.000
5d 1.679
　　由于 5b和3-氧代齐墩果酸(2)在100μL水中
的溶解度小于 HPLC 检测限(约100 ng),因此这
两个化合物的确切数值没有得到。水溶性实验结
果表明 ,所测定的化合物的水溶性顺序是 5e>5g
>5c>5d>5a>5b和 2 ,其中 ,具有两个羧基的谷
氨酸偶联物 5e的水溶性最好 ,其次是羧基比较外
露的 β-丙氨酸偶联物 5g和带有羟基的丝氨酸偶
联物 5c。因此 ,除 5b 外 ,所测试的氨基酸偶联物
的水溶性比 2都有不同程度的改善 。
3　药理实验
RPM I 1640培养基 、胰蛋白酶和小牛血清为
Gibco BRL 公司产品 ,KB和 KB/V 购自中国医学
科学院基础医学科学研究所细胞培养中心。
将对数生长期的肿瘤细胞 ,用胰蛋白酶消化
后 ,用质量分数为 10%的小牛血清培养基配成细
胞浓度为5 000个·mL-1的细胞悬液 。接种于 96
孔培养板中 ,每孔接种 200 μL。在 37 ℃,于体积
分数为 5%的 CO2 培养箱中培养24 h。实验组加
入含不同质量浓度 5a ～ 5e、5g的培养液 ,对照组
则用不同体积的培养液 ,每组设 3个以上的平行
孔 ,在 37 ℃、体积分数为 5%的 CO2 培养箱中培
养24 h 。弃去上清液 ,用培养液洗 3次 ,以去除化
合物 5a ～ 5e 和 5g , 每孔加入200μL 含 MTT
(0.2 mg·mL-1)的无血清培养基 ,在37 ℃培养
4 h 。弃去上清液 ,加入200μL DMSO 溶解甲躜
沉淀 ,用振荡器混匀后 ,在酶标仪上于570 nm波
长处 ,测定光密度(OD)值 ,参比波长为450 nm 。
按公式:肿瘤细胞生长抑制率 =(1 -实验组
OD)/对照组 OD×100%,计算出 5a ～ 5e和 5g对
肿瘤细胞生长的抑制率 ,结果见表 3。
Table 3　Inhibitory activity of 5a-5e and 5g as estimated by MTT assay
Compd. Concentration/(mo l·L-1) Inhibitory ratio/ %
KB KB/V
5a 1×10-5 -28.15 -2.96
5b 1×10-5 -7.94 -0.48
5c 1×10-5 10.17 12.15
5d 1×10-5 -11.85 -7.24
5e 1×10-5 10.47 2.43
5g 1×10-5 3.65 -2.48
　　初步体外活性筛选结果表明 ,具有羧基和羟
基取代的偶联物 5e 、5c保持抗肿瘤活性 ,这说明
具有极性取代基的偶联物能改善化合物的水溶性
和抗肿瘤活性;另外 ,羧基比较外露的偶联物 5g
仍保持抗肿瘤活性 ,可能是由于羧基受齐墩果酸
位阻的影响比较小 ,有利于与受体的相互作用。
初步药理筛选结果表明 ,化合物 5c、5e和 5g保持
抗肿瘤活性 ,而且这 3 个化合物也具有较高的水
溶性 ,说明水溶性与活性具有一定的相关性。
致谢:中国医学科学院北京协和药物研究所
陈晓光教授课题组进行药理活性的测定 。
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