全 文 ：酶法辅助提取南板蓝叶中靛玉红的工艺研究
黄凤婷1，马永良2，林春颖1，熊清平3* (1．广州中医药大学第三附属医院芳村分院，广东广州 510360;2．中山大学孙逸仙纪念医
院，广东广州 510120;3．淮阴工学院，江苏淮安 223003)
摘要 ［目的］研究酶法提取关键参数对南板蓝叶中靛玉红提取工艺的影响。［方法］采用 HPLC测定靛玉红的含量，并考察酶用量、酶
解 pH值和酶解时间对提取率的影响，并优选出了最佳工艺条件。［结果］南板蓝叶中靛玉红酶法辅助提取的最佳工艺条件为:酶用量
25 U/g，酶解 pH值 4． 8，酶解时间 6 h; 在此条件下，靛玉红的 Z值为 7． 02%。［结论］酶法辅助提取法适用于南板蓝叶中靛玉红的提取。
关键词 酶法辅助提取;靛玉红( Indirubin) ; 南板蓝根( Baphicacanthus cusia( Nees) Bremek)
中图分类号 S567 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611( 2012) 26 －12866 －02
Study on Enzyme-assisted Extraction of Indirubin from Baphicacanthus cusia ( Nees) Bremek Leaves
HUANG Feng-ting et al ( Fangcun Branch of the 3rd Affiliated hospital of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine，Guang-
zhou，Guangdong 510360)
Abstract ［Objective］To observe the key parameters of enzymatic extraction that impact extraction of indirubin from Baphicacanthus cusia
( Nees) Bremek leaves． ［Method］The content of indirubin was determined using HPLC． Effects of enzyme dosage，hydrolysis pH and hydrol-
ysis time on extraction rate of indirubin were investigated with the aim of optimizing its extraction technology． ［Result］The optimal enzyme-as-
sisted extraction conditions of indirubin from B． cusia leaves were the combination of enzyme dosage 25 U /g，hydrolysis pH 4． 8 and hydrolysis
time 6 h． Under the above conditions，the Z value of indirubin was 7． 02% ． ［Conclusion］Enzyme-assisted extraction method is suitable for
extraction of indirubin from B． cusia leaves．
Key words Enzyme-assisted extraction; Indirubin; Baphicacanthus cusia ( Nees) Bremek
基金项目 广州市卫生局中医科研课题资助项目( 2009-A-50) ;广东省
中医药局建设中医药强省科研课题项目( 2009303) 。
作者简介 黄凤婷( 1971 － ) ，女，广东广州人，主任中药师，硕士，从事
医院药学研究工作，E-mail: zhuangft@ sina． com。* 通讯作
者，硕士，从事天然药物活性成分研究，E-mail: xqp666 @
163． com。
收稿日期 2012-05-02
靛玉红(Indirubin)是从常用中药青黛中分离出来抗白
血病的有效成分，为双吲哚类抗肿瘤药物，现临床上广泛被
应用于慢粒细胞白血病的治疗［1］。随着临床用量增多，靛玉
红的需求量大为增加。其中，在南板蓝根(Baphicacanthus cu-
sia(Nees)Bremek)的叶中，靛玉红含量(0． 42 mg /g)高于同类
药［2］。因此，南板蓝根是提取靛玉红的理想资源。酶法辅助
提取系指利用酶反应的高度专一性，根据中草药成分选择合
适的酶，将植物细胞壁的组成成分水解或降解，破坏细胞壁，
从而提高有效成分提取率的方法。与传统提取工艺相
比［2 －4］，该法仅增加了酶解过程，但能大大缩短提取时间，改
善有效成分的分布，提高提取效率，具有反应条件温和、提取
时间短和提取产率高等优点。因此，笔者对酶法应用于南板
蓝叶中靛玉红提取的相关参数进行了研究，以期为提高靛玉
红产量提供新的提取工艺。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 研究对象。南板蓝叶，购自广东省平远县石正镇基
地，经鉴定为南板蓝根(Baphicacanthus cusia(Nees)Bremek)
的新鲜叶。
1． 1． 2 主要仪器。SZ-93自动双重纯水蒸发器，购自上海亚
荣生化仪器厂;DJ-02粉碎机，购自上海淀久中药机械制造有
限公司;201有机制备仪，购自金坛晶玻实验仪器厂;R201L
旋转蒸发仪，购自上海申生科技有限公司;高效液相色谱仪，
购自美国 waters公司;电子天平，购自上海天平仪器厂;微量
移液器，购自上海求精生化试剂仪器有限公司。
1． 1． 3 主要试剂。靛玉红对照品，购自中国药品生物制品
检验所，批号:717-200204;纤维素酶，购自无锡高润杰科技有
限公司;柠檬酸(分析纯)、柠檬酸氢二钠(分析纯)和乙醇
(分析纯) ，均购自国药集团化学试剂有限公司;甲醇(色谱
纯)和氯仿(色谱纯) ，购自江苏汉邦科技有限公司;去离子
水，自制。
1． 2 方法
1． 2． 1 色谱条件。色谱柱为 C18柱(250 mm × 4． 6 mm，5
μm) ;流动相为无水甲醇 － 水(75 ∶ 25，V/V);流速为 1． 0
ml /min;柱温为30 ℃;进样量为10 μl;检测波长(λ)为290 nm。
1． 2． 2 标准储备液制备。精密称取 10． 5 mg经五氧化二磷
干燥至恒重的靛玉红对照品，置于 50 ml 烧杯中，加入 20 ml
无水甲醇 －氯仿(80∶ 20，V /V) ，超声溶解，将溶液转至 50 ml
容量瓶中，用无水甲醇 －氯仿(80∶ 20，V /V)稀释至刻度，即得
浓度为 210 μg /ml的标准储备溶液。
1． 2． 3 供试品溶液的制备。精密称取靛玉红样品适量
(m样品) ，置于 50 ml烧杯中，加入 20 ml无水甲醇 －氯仿(80∶
20，V /V) ，超声溶解，将溶液转至 50 ml 容量瓶中，用无水甲
醇 －氯仿(80∶ 20，V /V)稀释至刻度，即得供试品溶液。
1． 2． 4 方法学考察。①线性关系考察。分别精密吸取标准
储备液 0． 5、1． 0、2． 0、4． 0和 6． 0 ml于 10 ml容量瓶中，用无
水甲醇 － 氯仿(80 ∶ 20，V /V)定溶至刻度，摇匀，即得浓度
10. 5、21． 0、42． 0、84． 0和 126． 0 μg /ml的标准浓度系列溶液，
将各标准系列溶液分别在“1． 2． 1”项下的色谱条件进样测
定，以峰面积对各溶液的浓度进行线性回归，计算线性回归
方程。②精密度测定。取同一标准浓度系列溶液连续进样 5
次，按“1． 2． 1”项下的色谱条件进行测定，计算靛玉红峰面积
的 RSD。③稳定性试验。将同一供试品分别于 0、1、2、4 和
责任编辑 石金友 责任校对 卢瑶安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2012，40(26):12866 － 12867，12879
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2012.26.133
12 h各进样 1次，测试峰面积，计算靛玉红的峰面积的 RSD。
④加样回收率试验。分别精密吸取 3 份已知含量的同一供
试品液 5 ml于 10 ml容量瓶中，分别用浓度为 10． 5、21． 0 和
42． 0 μg /ml的标准浓度系列溶液定容至刻度，按“1． 2． 1”项
下的色谱条件进行测定，计算样品的平均回收率和 RSD。
1． 2． 5 含量测定。按“1． 2． 1”项下的色谱条件，将供试品溶
液进样测定，将所得峰面积数值代入“1． 2． 4”项下的回归方
程，计算其对应含量，并按照公式 1计算样品中靛玉红含量。
C样品 =
C供试品 ×50
m样品
×100% (1)
1． 2． 6 工艺筛选指标。由于各试验所得靛玉红样品的含量
X(%)是考察靛玉红品质的主要指标，具有质量控制意义;
而南板蓝叶中靛玉红样品的提取率 Y(%)在工业生产上具
有经济控制意义，故笔者筛选的最终考察指标为靛玉红样品
含量 X与靛玉红样品提取率 Y的算术平均值 Z。
1． 2． 7 酶法辅助提取工艺过程。将南板蓝叶药材粉碎至
40 ～60目粉末备用。称取适量的南板蓝叶粗粉，分别溶于一
定体积的 pH缓冲液中，在不同条件下酶解，然后，用布氏漏
斗抽滤，滤渣用一定量的浓度 60%乙醇溶液，在一定温度下
提取一定时间后，过滤，滤渣重复提取 2 次，合并滤液，将滤
液转至旋转蒸发仪中，于(65 ± 5)℃的条件下真空浓缩至半
浸膏，取出半浸膏，于(65 ± 5)℃的条件下真空干燥，干浸膏
经粉碎后得靛玉红样品粉末。
1． 2． 8 参数条件的筛选。(1)酶用量对南板蓝叶中靛玉红
酶法辅助提取的影响。称取 8份适量的南板蓝叶粗粉，按料
液比为1∶ 8(W/V，g /ml，下同)的比例溶解于 pH值为 4． 8 的
缓冲溶液中，用恒温水浴升温至 50 ℃，分别按 5、10、15、20、
25、30、35和 40 U /g的酶用量将纤维素酶加入发酵罐中，振
摇发酵 4 h后，用布氏漏斗抽滤，滤渣用一定量的浓度 60%
乙醇溶液溶解，在一定温度下提取一定时间后，过滤，滤渣重
复提取 2次，合并滤液，将滤液转至旋转蒸发仪中，其余同
“1． 2． 7”项下操作制备靛玉红样品粉末，然后按“1． 2． 3”操作
制备供试品溶液，并在“1． 2． 4”的方法下进行测定。(2)酶解
pH值对南板蓝叶中靛玉红酶法辅助提取的影响。称取 8 份
适量的南板蓝叶粗粉，按料液比为1∶ 8 的比例分别溶解于 pH
值分别为 4． 0、4． 2、4． 4、4． 6、4． 8、5． 0、5． 2和 5． 4 的缓冲溶液
中，用恒温水浴升温至50 ℃，按25 U /g药材的酶用量将纤维
素酶加入发酵罐中，振摇发酵 4 h后，其余同“1． 2． 7”项下操
作，然后按“1． 2． 3”操作制备供试品溶液，并在“1． 2． 4”的方
法下进行测定。(3)酶解时间对南板蓝叶中靛玉红酶法辅助
提取的影响。称取 6份适量的南板蓝叶粗粉，按料液比为 1∶
8的比例溶解于 pH值为 4． 8的缓冲溶液中，用恒温水浴升温
至 50 ℃，按25 U /g药材的酶用量将纤维素酶加入发酵罐中，
分别振摇发酵 2、4、6、8、10和 12 h后，其余同“1． 2． 7”项下操
作，然后按“1． 2． 3”操作制备供试品溶液，并在“1． 2． 4”的方
法下进行测定。
2 结果与分析
2． 1 方法学考察 ①线性关系考察。计算得线性回归方程
为 Y =293 824X +10 311，R =0． 999 2(n = 5) ，表明在 10． 5 ～
126． 0 μg /ml的范围内，靛玉红浓度与峰面积呈良好的线性
关系。②精密度测定。计算得靛玉红峰面积的 RSD 为
1. 74%，表明靛玉红测量的进样精密度良好。③稳定性试
验。计算得靛玉红的峰面积的 RSD 为 2． 65%，表明样品溶
液在 12 h内稳定。④加样回收率试验。计算得样品的平均
回收率为 102． 8%，RSD为 1． 48%，表明该方法准确、可靠，可
用于南板蓝叶中靛玉红的含量测定。
2． 2 参数条件的筛选
2． 2． 1 酶用量对南板蓝叶中靛玉红酶法辅助提取的影响。
图 1表明，当酶用量小于 25 U /g时，提取的 Z值随着酶用量
的增加而逐渐增大;当酶用量为 25 U /g 时，Z 值最大，为
6. 62%;但当酶用量大于 25 U /g 时，Z 值随着酶用量的增加
而逐渐减小。这是由于发酵反应体系中其他成分不变时，酶
与底物接触的机会会随着酶浓度的上升而增加，同一时间内
水解的分子数不断增加，更多成分就会分离出来;但是当酶
浓度升高到一定程度时，酶分子过于饱和，一部分酶将没有
机会与底物结合，使底物水解的速度变慢。因此，南板蓝叶
中靛玉红酶法辅助提取的酶用量宜选择 25 U /g。
图 1 酶用量对南板蓝叶中靛玉红酶法辅助提取的影响
2． 2． 2 酶解 pH值对南板蓝叶中靛玉红酶法辅助提取的影
响。由于 pH值影响酶活力，适当的 pH 值，通过静电作用，
维持了酶活性中心的最佳三维构象，促进了酶与底物结合。
而且，pH值还会影响酶的催化速度。pH 值不同，酶及作用
底物所带电荷不同，酶的立体构象及酶与底物的亲和力不
同，催化速度也就不同。图 2 表明，pH 值为 4． 8 时，Z 值最
大，为 6． 45%。因此，pH值宜选择 4． 8。
图 2 酶解 pH对南板蓝叶中靛玉红酶法辅助提取的影响
( 下转第 12879页)
7682140 卷 26 期 黄凤婷等 酶法辅助提取南板蓝叶中靛玉红的工艺研究
光过度使叶片图像发白所致;4 个叶锈病叶片被误判为条锈
病，原因是图像中叶片发黄导致其颜色特征与条锈病相近。
由此可见，采用该算法进行病害识别，平均准确率达到 98%。
如果从绿色叶片上拍摄病害图像，并注意曝光强度，可进一
步提高病害的识别准确率。
表 2 小麦病害部位颜色均值和特征参数
病害种类 R G B r b
健康叶片 0 0 0 0 0
叶锈病叶片 16 97 132 0． 164 9 1． 360 8
条锈病叶片 64 187 218 0． 342 2 1． 165 7
白粉病叶片 184 215 214 0． 855 8 0． 995 3
表 3 小麦病害识别结果
病害种类 图像数∥个 正确识别数∥个 识别准确率∥%
健康叶片 25 24 96
叶锈病叶片 69 65 94
条锈病叶片 74 74 100
白粉病叶片 72 72 100
3 结论
运用机器视觉技术，依据小麦健康叶片和绿色特征进行
病害图像分割，从分割后的病害图像中提取表达病害的颜色
特征，并利用颜色特征进行 3 种小麦病害的识别，取得了较
好的效果。为了提高算法的适用性，可进一步改进病害图像
分割算法，并增加病害的种类，以实现更多病害的可靠识别。
参考文献
［1］尹燕妮，张晓梅，郭坚华．小麦的细菌性病害［J］．江苏农业科学，2006
(6):159 －162．
［2］万安民，赵中华，吴立人． 2002年我国小麦条锈病发生回顾［J］．植物保
护，2003，29(2):5 －8．
［3］宋玉立，王瑞芳．小麦病害化学防治研究进展［J］．河南农业科学，2004
(7):50 －51．
［4］WIJEKOON C P，GOODWIN P H，HSIANG T． Quantifying fungal infection
of plant leaves by digital image analysis Haim Permuter，Joseph Francos，
Ian Jermyn． A study of Gaussian mixture models of color and texture fea-
tures for image classification and segmentation［J］． Pattern Recognition，
2006，39(4):695 －706．
［5］崔艳丽，程鹏飞，董晓志，等．温室植物病害的图像处理及特征值提取
方法的研究———基于色度的特征值提取研究［J］． 农业工程学报，
2005，21(Z2):32 －35．
［6］田有文，张长水，李成华．基于支持向量机和色度矩的植物病害识别研
究［J］．农业机械学报，2004，35(3):95 －98．
［7］章毓晋．图像工程［M］．北京:清华大学出版社，1999．
［8］ HAIM PERMUTER，JOSEPH FRANCOS，IAN JERMYN． A study of
Gaussian mixture models of color and texture features for image classifica-
tion and segmentation［J］． Pattern Recognition，2006，39(4):695 －706．
［9］SENA JR D G，PINTO F A C，QUEIROZ D M，et al． Fall armyworm dam-
aged maize plant identification using digital images［J］． Biosystems Engi-
neering，2003，85(3):449 －454．
［10］SMITH C S． Image pattern classification for the identification of disease
causing agents in plants［J］． Computers and Electronics in Agriculture，
2009，66(2):121 －125．
［11］ MARIAN WIWART，GABRIEL FORDO N SKI，KRYSTYNA Z·UK-
GOASZEWSKA，et al． Early diagnostics of macronutrient deficiencies
in three legume species by color image analysis［J］． Computers and Elec-
tronics in Agriculture，2009，65(1):125 －132．
［12］MIGUEL PAGOLA，RUBN ORTIZ，IGNACIO IRIGOYEN，et al． New
method to assess barley nitrogen nutrition status based on image colour a-
nalysis:Comparison with SPAD-502［J］． Computers and Electronics in
Agriculture，2009，65(2):213 －218．
［13］TELLAECHE A，BURGOS ARTIZZU X P，PAJARES G，et al． A new vi-
sion-based approach to differential spraying in precision agriculture［J］．
Computers and Electronics in Agriculture，2008，60(2):144 －155．
［14］毛罕平，张艳诚，胡波．基于模糊 C均值聚类的作物病害叶片图像分
割方法研究［J］．农业工程学报，2008，24(9):136 －140．
［15］张静，王双喜，董晓志，等．基于温室植物叶片纹理的病害图像处理及
特征值提取方法的研究［J］．沈阳农业大学学报，2006，37(3):282 －
285．
［16］邢永康，葛小青．一种基于区域分割的红外可见光图像融合方法［J］．
重庆理工大学学报(自然科学版)，2011(1):59 －63，
檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪
106．
( 上接第 12867页)
2． 2． 3 酶解时间对南板蓝叶中靛玉红酶法辅助提取的影
响。图 3表明，随着酶解时间的延长，Z 值逐渐增大。但是
从曲线的变化趋势来看，当酶解时间达 6 h时，Z值增加趋势
缓慢，酶解时间由 6 h 增加到 12 h，Z 值仅从 6． 72 上升至
7． 05。因此，酶解时间宜选择 6 h。
图 3 酶解时间对南板蓝叶中靛玉红酶法辅助提取的影响
3 结论与讨论
(1)为了寻求酶法辅助提取南板蓝叶中靛玉红的最佳工
艺条件，试验对影响酶法提取工艺的因素进行了单因素考
察，其最佳参数为:酶用量 25 U /g，酶解 pH值 4． 8，酶解时间
6 h;在此条件下，靛玉红的 Z值为 7． 02%。但优化出的该工
艺方法是否为南板蓝叶中靛玉红最优工艺方法，还需与其他
方法进行对比研究。
(2)在试验过程中发现，操作顺序对试验结果影响较大，
先加酶后升温很容易导致酶失去活力，其正确的操作顺序为
先调节 pH值，然后加入药材细粉和升温，最后加酶。
(3)由于受条件的限制，试验仅对工艺方法进行了单因
素考察，而对优化出来的工艺参数条件没有进行验证试验，
仍有待于进一步研究。
参考文献
［1］李长玲，籍秀娟，张福荣．靛玉红及其某些衍生物抗癌活性与体内吸收
的关系［J］．生理科学，1983，3(5):39 －40．
［2］梁文法，闭业范，卢华，等．南板蓝的根、茎、叶、中靛玉红与靛蓝的含量
测定［J］．中成药，1990，12(2):31 －32．
［3］王景文，袁雪海．青黛中提取靛玉红等有效成分最佳工艺的研究［J］．
中成药，1999，21(11):556 －558．
［4］张建军，薄少英，张玉霞，等．板蓝根提取工艺探讨［J］．中国中医药杂
志，1990，15(5):31 －33．
9782140 卷 26 期 刘连忠等 基于改进颜色特征的小麦病害图像识别技术研究