全 文 ：Table2　 ContentsoftotalflavonoidsandthreeflavonoidglycosidesindifferentL.gracilesamples
Samples
Totalflavonoids
Mean±SD(mg/g),
RSD(%)
Isoorientin
Mean±SD(mg/g),
RSD(%)
Vitexin
Mean±SD(mg/g),
RSD(%)
Tricin7-O-glycoside
Mean±SD(mg/g),
RSD(%)
Zhejiangprovince(070810) 4.40±0.10, 2.27 0.67±0.02, 2.98 0.14±0.00, 0.00 0.05±0.00, 0.00
Fujianprovince(070826) 7.95±0.25, 3.14 0.95±0.02, 2.10 0.13±0.00, 0.00 0.05±0.00, 0.00
Shanxiprovince(070818) 3.12±0.07, 2.24 0.29±0.01, 3.44 0.13±0.00, 0.00 0.04±0.00, 0.00
Hunanprovince(070814) 5.64±0.12, 2.13 0.57±0.02, 3.50 0.12±0.00, 0.00 0.06±0.00, 0.00
Anhuiprovince(070709) 3.26±0.09, 2.76 0.32±0.01, 3.12 0.07±0.00, 0.00 0.03±0.00, 0.00
Anhuiprovince(070715) 2.15±0.04, 1.86 0.22±0.01, 4.54 0.08±0.00, 0.00 0.04±0.00, 0.00
Shanxiprovince(070828) 3.72±0.10, 2.68 0.18±0.00, 0.00 0.44±0.01, 2.27 0.03±0.00, 0.00
Hebeiprovince(070830) 2.78±0.05, 1.79 0.26±0.01, 3.84 0.13±0.00, 0.00 0.04±0.00, 0.00
Guangdongprovince(070823) 2.17±0.03, 1.38 0.19±0.00, 0.00 0.07±0.00, 0.00 0.03±0.00, 0.00
Anhuiprovince(070803) 6.98±0.18, 2.57 0.48±0.01, 2.08 0.16±0.00, 0.00 0.04±0.00, 0.00
　　±SD=standarddeviation(n=3);RSD=relativestandarddeviation
accurateandreproducibleandcouldbereadilyutilized
asasuitablequalitycontrolmethodforthequantifica-
tionoftheaerialofL.gracile, derivedextractsand
phytomedicines.Theresultsoftheanalysisontheten
L.gracilesamplessuggestedthatcontentsoftotalfla-
vonoidsandthreeflavonoidglycosidesvariedsignifi-
cantlyintheaerialofL.gracilefromdiferentlocations
ofChina.Therefore, theevaluationofdatamightbe
usefulinqualityassuranceaswelasfordetermination
ofadulterationofthecrudedrug.
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HPLC测定不同产地威灵仙中齐墩果酸的含量
谢　乐 , 　马晓黎 , 　刘丽芳＊ , 　池玲玲 , 　何　斌 , 　王琪琳
(中国药科大学中药分析教研室 ,江苏 南京 210038)
收稿日期:2008-04-12
基金项目:国家自然科学基金项目(3077270);江苏省高技术计划基金项目资助(BG2007613)
作者简介:谢　乐(1983-),男 ,硕士生 ,从事中药分析研究。 Tel:(025)85391253
＊通讯作者:刘丽芳(1969-),博士 ,副教授 ,主要从事中药活性成分和动物药研究。 E-mail:liulifang69@hotmail.com
关键词:威灵仙;齐墩果酸;HPLC
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摘要:目的:建立高效液相色谱法测定中药威灵仙中齐墩果酸含量的方法。方法:采用反相高效液相色谱法。色谱条件:
色谱柱为 AgilentTCC18色谱柱(150mm×4.6mm, 5 μm);流动相为乙腈-水(90∶10);检测波长为 215nm;流速为 1 mL/
min;柱温:25℃。结果:齐墩果酸在 1.505 ～ 10.034 μg范围内线性关系良好 , 回归方程为:Y=314.43X+22.552(r=
0.999 7),平均回收率为 100.17% (RSD=2.34%)。结论:本法简单 ,准确 、稳定 ,可用于威灵仙药材质量评价。
中图分类号:R284.1　　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:1001-1528(2009)01-0100-03
　　中药威灵仙为毛茛科植物威灵仙 Clematis
chinensisOsbeck.、棉团铁线莲 Clematishexapetala
Pal.或东北铁线莲 ClematismanshuricaRupr.的干
燥根及根茎 ,具有祛风除湿 , 通络止痛之功效 [ 1] 。
威灵仙为较常用中药 ,资源丰富 ,在我国有悠久的临
床应用历史 。
现代研究表明 ,中药威灵仙化学成分复杂 ,并且
具有广泛的生物活性 。近年来从威灵仙中已分离鉴
定出 60多种皂苷类化合物[ 2-7] 。文献报道表明:威
灵仙总皂苷具有抗肿瘤及抗炎镇痛的作用[ 8, 9] ,近
来还发现该类成分在抗免疫性炎症方面显示出较强
的活性 [ 10] ,具有广阔的应用前景 ,已经逐渐成为研
究的热点。
近年来 ,虽然针对威灵仙化学成分的研究越来
越深入 ,但对其质控方法的研究却报道较少 ,故限制
了对该药物的进一步深入开发研究 。研究表明 ,威
灵仙 ClematischinensisOsbeck.及棉团铁线莲 Clema-
tishexapetalaPal.中所发现的大多数皂苷的苷元均
为齐墩果酸(oleanolicacid)。齐墩果酸具有清热 、
消炎 、抑菌 、强心 、利尿和抑制 S180瘤株生成的作
用 [ 11] 。因此 ,我们选择来源及产地不同的中药威灵
仙药材经提取后进行水解反应 ,通过测定水解产物
中齐墩果酸的含量 ,间接反映出药材中皂苷的含量 ,
从而为该药材质量的控制提供更为简便和切实可行
的依据 ,同时也将对威灵仙药材的质量控制研究具
有重要的参考价值。
1　仪器与试药
1.1　仪器 　Agilent1100 Series液相色谱仪 (美
国);色谱柱:AgilentTCC18 (4.6 mm×150 mm, 5
μm);H66025T型超声波仪(无锡超声电子仪器设
备厂)。
1.2　试药 　对照品:齐墩果酸 (批号 110709-
200204,购于中国药品生物制品检定所),乙腈为色
谱纯(Merck),流动相用水为乐百氏纯净水;其余试
剂均为分析纯;9批威灵仙药材的来源见表 1,经中
国药科大学中药分析教研室刘丽芳副教授鉴定为毛
茛科植物威灵仙 ClematischinensisOsbeck及棉团铁
线莲 ClematishexapetalaPal.的干燥根及根茎 。将
上述药材样品经低温干燥后 ,粉碎成粗粉(过 40目
筛),备用 。
表 1　 威灵仙药材的来源
批号 产地(种名)
040329 江苏(威灵仙 ClematischinensisOsbeck.)
040906 河南(棉团铁线莲 ClematishexapetalaPal.)
041003 西安(伪品 黑叶菝葜 SmilaxnigrescensWangetTang.)
030313 安徽(威灵仙 ClematischinensisOsbeck.)
040815 萍乡(威灵仙 ClematischinensisOsbeck.)
040326 河北(棉团铁线莲 ClematishexapetalaPal.)
040509 安徽(威灵仙 ClematischinensisOsbeck.)
040314 辽宁(棉团铁线莲 ClematishexapetalaPal.)
071110 安徽(威灵仙 ClematischinensisOsbeck.)
2　方法与结果
2.1　色谱条件　色谱柱:Agilent-ODS柱(4.6 mm
×150 mm, 5 μm);流动相:乙腈-水(90∶10);流
速:1.0 mL/min,检测波长:215 nm;柱温:25 ℃;进
样量:20 μL。
2.2　对照品溶液的制备　精密称取齐墩果酸对照
品 5.02 mg,置 10mL量瓶中 ,甲醇超声溶解 ,定容 ,
得浓度为 0.502 mg/mL的对照品溶液 。
2.3　方法学考察　
2.3.1　提取条件的优化　在样品溶液制备时 ,考虑
到指标性成分的提取率 ,以及其它成分对含量测定
的影响。取同一批样品 ,分别对提取溶剂 、水解液酸
浓度 、水解时间 、萃取溶剂以及萃取次数进行了考
察。考察了 50%乙醇及甲醇为提取溶剂;比较了
10%盐酸乙醇溶液和 20%盐酸乙醇溶液的水解效
果 ,观察了 0.5 h、1.0h、1.5 h、2.0 h不同水解时间
对含量测定的影响 ,并且比较了氯仿 、石油醚和醋酸
乙酯的萃取效果。结果表明 ,采用 50%乙醇水浴回
流提取后 ,经 20%盐酸乙醇溶液水解 0.5 h,再用氯
仿萃取 4次除杂质 ,游离齐墩果酸的提取率最高 ,杂
质除去较完全 ,对样品测定干扰小 ,测得游离齐墩果
酸的含量最高 ,为 1.063%;而采用氯仿萃取 5次的
样品溶液 , 测得游离齐墩果酸的含量最低 , 为
0.598%。结果见表 2。
2.3.2　标准曲线的绘制　精密吸取对照品溶液 3,
5, 10, 15, 20 μL,注入高效液相色谱仪 ,在 2.1项色
谱条件下进行分析 ,记录色谱峰面积 。以对照品的
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峰面积为纵坐标 ,以齐墩果酸对照品量(μg)为横坐
标 ,做线性回归 。在 1.505 ～ 10.034 μg的范围内 ,
齐墩果酸色谱峰面积与齐墩果酸的量呈良好的线性
关系。其回归方程为 Y=314.43X+22.552(r=
0.999 7)。
表 2　 不同提取条件下测定游离齐墩果酸的含量
提取溶剂 水解液酸度
水解时间
/min
萃取溶剂
及次数
游离齐墩
果酸含量 /%
甲醇 20%盐酸乙醇 60 氯仿萃取 4次 0.623
50%乙醇 20%盐酸乙醇 60 氯仿萃取 4次 1.022
50%乙醇 10%盐酸乙醇 60 氯仿萃取 4次 0.808
50%乙醇 20%盐酸乙醇 30 氯仿萃取 4次 1.063
50%乙醇 20%盐酸乙醇 90 氯仿萃取 4次 1.039
50%乙醇 20%盐酸乙醇 120 氯仿萃取 4次 0.953
50%乙醇 20%盐酸乙醇 60 氯仿萃取 5次 0.598
50%乙醇 20%盐酸乙醇 60 醋酸乙酯萃取 4次 0.795
50%乙醇 20%盐酸乙醇 60 石油醚萃取 4次 1.006
2.3.3　精密度试验　精密吸取同一对照品溶液 20
μL,重复测定 5次 ,结果其峰面积 RSD为 0.64%(n
=5),精密度良好 。
2.3.4　稳定性试验　取同一样品溶液在 0 , 3, 5, 7,
9, 12h分别进样 20 μL,依次测定 ,结果 6次测定齐
墩果酸含量 RSD=1.68%(n=6),结果表明样品溶
液在 12 h内稳定。
2.3.5　重复性试验　取同批号药材 6份 ,按供试品
溶液的制备项操作 ,平行制备 6份样品 ,分别吸取
20 μL,注入高效液相色谱仪 ,测定水解后游离齐墩
果酸的平均含量为 1.026 6%, RSD=2.53%(n=
6)。结果表明 ,该方法的重复性良好 。
2.3.6　加样回收率试验　取含量为 1.026 6%的药
材粉末进行加样回收试验。取本品 6份 ,每份约
1.0 g,精密称定 ,置于 250 mL圆底烧瓶中 ,分别加
入浓度为 0.502 mg/mL的齐墩果酸对照品溶液 2
mL,分别按照最佳提取条件制样 ,精密吸取 20 μL,
测定并计算齐墩果酸的回收率 ,结果表明该方法准
确 、可靠。结果见表 3。
表 3　 齐墩果酸加样回收率试验结果
样品重
量 /g
加样量
/mg
检出量
/mg
回收率
/%
平均回收
率 /%
RSD
/%
1.002 4 1.053 6 2.102 3 100.14
0.999 4 1.053 6 2.135 1 102.26
1.001 7 1.003 4 2.050 9 102.81 100.17 2.34
1.000 2 1.053 6 2.079 6 99.40
0.999 4 1.003 4 1.961 2 96.87
1.000 3 1.053 6 2.100 5 102.77
2.3.7　样品的含量测定　取由市场购得的不同产
地不同批号的药材样品 9批 ,粉碎 ,过筛(40目),精
密称取药材粉末 1.0 g,加 50%乙醇回流提取 3次 ,
每次 50mL、1 h,过滤后合并滤液 ,减压挥干 ,定容
于 50 mL量瓶中 ,取续滤液 ,进样 20 μL,在 2.1项
色谱条件下测定游离齐墩果酸含量。另精密吸取续
滤液 25 mL,水浴蒸干 ,残渣加入 20%的盐酸乙醇溶
液 20 mL,加热水解 0.5 h,放冷 ,摇匀 ,转移到分液
漏斗中 ,用 25mL氯仿分 3次荡洗容器后并入分液
漏斗中 ,再用水 10 mL分两次荡洗容器后并入分液
漏斗中 ,振摇萃取 4次 ,每次氯仿用量 25mL。合并
氯仿层 ,蒸干 ,残渣加甲醇溶解 ,定容至 25 mL量瓶
中 ,进样 20 μL,在 2.1项色谱条件下测定齐墩果酸
总量 。结果见图 1和表 4。
表 4　 不同产地样品中齐墩果酸的含量
批号 产地(种名) 取样量/g
水解前齐墩
果酸含量 /%
总齐墩
果酸含量 /%
030313 安徽(威灵仙 ClematischinensisOsbeck.) 0.999 9 - 0.985
040509 安徽(威灵仙 ClematischinensisOsbeck.) 1.001 9 - 0.730
040329 江苏(威灵仙 ClematischinensisOsbeck.) 0.999 5 0.009 0.362
040815 萍乡(威灵仙 ClematischinensisOsbeck.) 1.000 4 0.014 0.245
040906 河南(棉团铁线莲 ClematishexapetalaPal.) 1.000 8 - 1.280
041003 西安(伪品黑叶菝葜 SmilaxnigrescensWangetTang.) 1.000 5 - -
040326 河北(棉团铁线莲 ClematishexapetalaPal.) 1.000 1 - 0.928
040314 辽宁(棉团铁线莲 ClematishexapetalaPal.) 1.000 2 - 0.285
71110 安徽(威灵仙 ClematischinensisOsbeck.) 1.000 2 - 1.027
　　注:“— ”表示为未检测到。
3　讨论
3.1　本实验对中药威灵仙中齐墩果酸的提取方法
进行了全面深入的研究和优化 ,考察了不同的提取
溶媒 、水解时间 、水解酸度 、萃取次数 、萃取溶媒对含
量测定的影响 ,摸索出一套合理的提取方法 。结果
表明 ,用 50%乙醇回流提取 , 20%盐酸乙醇水解
0.5 h,氯仿萃取 4次后 ,测得齐墩果酸的含量最高 ,
提取效率最佳 。
3.2　从对 9批产地和来源不同的药材样品及其伪
品中齐墩果酸的含量的测定结果来看 ,药材中游离
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齐墩果酸的含量极低 ,测得的齐墩果酸基本上都是
由皂苷水解产生而来 。另外 ,不同来源的威灵仙药
材中齐墩果酸的含量差别较大 。其中批号为
040906的棉团铁线莲 ClematishexapetalaPal.含量
最高 ,为 1.28%;批号为 040815的威灵仙 Clematis
chinensisOsbeck.含量最低 ,为 0.245%。这是否与
当地的气候 、种植环境 、采集时期有关 ,还有待进一
A
B
C
图 1　齐墩果酸标准品及样品的 HPLC图
A.齐墩果酸对照品　B.威灵仙 ClematischinensisOsbeck.　C.棉
团铁线莲 ClematishexapetalaPal.
步研究。而伪品黑叶菝葜 SmilaxnigrescensWanget
Tang.中未检测到齐墩果酸。
3.3　本实验对中药威灵仙中齐墩果酸含量的测定
方法进行了进一步的研究和优化 ,所建立的该药材
中齐墩果酸含量的 HPLC测定方法 ,具有操作简便 、
结果准确 、重现性好等薄层色谱法无法比拟优点 ,并
且所采用的色谱条件分离效果好 、干扰因素少 ,为中
药威灵仙的深入开发研究和质量控制提供了科学依
据。
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