全 文 ：三叶青乙酸乙酯提取物诱导人结肠癌 HT-29细胞凋亡
刘跃银 1，夏 红 2*
（1.郴州市第二人民医院，湖南 郴州 423000； 2.南华大学肿瘤研究所， 湖南 衡阳 421001）
【摘要】 目的： 评价三叶青乙酸乙酯提取物 (ethyl-acetate fraction of extracts from Tetrastigma hemsleyanum
Diels et. Gilg , EAFT)诱导人结肠癌 HT-29细胞凋亡作用。方法：体外培养 HT-29细胞。FITC标记 annexinⅤ/PI
染色流式细胞术分析细胞凋亡率。 ELISA法测定细胞组蛋白/DNA碎片。 Western Blotting分析细胞 Bax蛋白和细
胞色素 C的表达。 结果：EAFT以浓度依赖方式诱导 annexinⅤ染色阳性细胞百分率和组蛋白/DNA碎片增加(P<
0.01)。 10.0 mg/L EAFT分别作用 HeLa细胞 6 h、12 h和 24 h，细胞色素 C 和 Bax蛋白表达上调。 结论：EAFT具有
诱导人结肠癌 HT-29细胞凋亡作用，其作用机制与激活线粒体途径有关。
【关键词】 结肠癌；三叶青；三叶青乙酸乙酯提取物；细胞凋亡
【中图分类号】R735. 2 【文献标识码】A 【文章编号】1673-016x(2010)04-0022-03
收稿日期：2010-06-18
作者简介： 刘跃银 (1978-), 男， 湖南郴州人， 主管中药师， 主要从事医院临床药学研究。 Tel: 86-13975531030，Email:
1328675482@qq.com.
*通讯作者：夏红(1976-), 女，湖南益阳人，实验师，主要从事肿瘤药理学研究。 E-mail:xiahong998@yahoo.com.cn.
Induction of Apoptosis by Ethyl-acetate Fraction of Extracts from Tetrastigma
Hemsleyanum Diels et. Gilg in Human Colon Cancer HT-29 Cells
LIU Yue-Yin1, XIA Hong2
（1. The Second Peoples Hospital of Chenzhou, Chenzhou 423000, China;
2. Institute of Cancer Research of University of South China, Hengyang 421001, China）
[Abstract] Objective To evaluate the effects of ethyl -acetate fraction of extracts from Tetrastigma
hemsleyanum Diels et. Gilg (EAFT) on the apoptotic cell death in human colon cancer HT-29 cell line. Methods
Human colon cancer HT-29 cells were cultured in vitro. Flow cytometry after FITC labeled annexin V staining was
used to determine the percentage of apoptotic cells. Histone/DNA fragments were determined using ELISA assay.
Western Blotting was used to analyze the expresson of Bax and cyto C protein in HT-29 cells. Results EAFT
significantly induced increase of the percentage of apoptotic cells(P<0.05), and increased leakage of the histone/DNA
fragments in HT-29 cell line (P<0.05), in a concentration-dependent manner. The upregulation of the expression
level of Bax and cyto c protein in HT-29 cells treated with EAFT at 10mg/L for 6, 12, 24 h(P<0.05), as assessment by
Western blotting. Conclusion EAFT can effectively induce apoptosis of human colon cancer HT-29 cells, and its
mechanism is involved in activation of mitochondrial apoptotic pathway.
[Key words] colon cancer; Tetrastigma hemsleyanum Diels et. Gilg; ethyl-acetate fraction of extracts from
Tetrastigma hemsleyanum Diels et. Gilg; apoptosis
三叶青为葡萄科崖爬藤属植物， 学名为三叶崖
爬藤( Tetrastigma Hemsleyanum Diels et1Gilg)。 主要
分布于浙江、江西、福建、台湾、湖北、湖南、广东、广
西、四川、贵州、云南等省区[1]。 三叶青的块根或全草
均可入药, 具有清热解毒、祛风化痰、活血止痛的功
效，用于治疗高热惊厥、肺炎、哮喘、肝炎、风湿、月经
湖南师范大学学报（医学版）
J Hunan Normal Univ（Med Sci）
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不调、咽痛、瘰疬等症，具有很好的疗效[2]。 药物药理
学研究表明三叶青提取物有抗病毒作用和明显的消
炎镇痛[3]以及抗肿瘤作用[4]。 程伟等[5]在研究三叶青抗
肿瘤活性机制时发现：三叶青提取物诱导肺癌 A549
细胞 DNA 发生核小体间断裂，DNA 琼脂糖凝胶电
泳呈现梯状条带。 本文的研究目的是观察三叶青
乙酸乙酯提取物 (ethyl-acetate fraction of extracts
from Tetrastigma hemsleyanum Diels et. Gilg , EAFT)
诱导人结肠癌 HT-29细胞凋亡作用，并初步探讨其
作用分子机制。
1 材料与方法
1.1 受试物与试剂
三叶青购自湖南医药有限公司(中国长沙)。三叶
青提取物参照文献[6]描述的方法，采用乙酸乙酯提取
法获得。 紫杉醇(TAX)，北京四环医药科技股份有限
公司生产，规格：30mg/5mL/支，批号：080830。 RPMI-
1640培养基 (Invitrogen 公司)、 小牛血清(Invitrogen
公司)、AnnexinⅤ-FITC/PI双染试剂盒 (碧云天公司)
细胞死亡 ELISA 检测试剂盒(罗氏公司)和小鼠抗人
Bax和细胞色素 C抗体((Santa Cruz Biotechnology 公
司))购自湖南科泰生物技术有限公司(中国长沙)。
1.2 细胞与细胞培养
人结肠癌 HT-29 细胞购于中国典型培养物保
藏中心 (中国武汉市)， 用含 10%小牛血清的 RPMI-
1640培养基， 加 100 U/mL 青霉素，100 U /mL 链霉
素， 置于 37℃，5%CO2及饱和湿度培养箱中培养，取
对数生长期细胞用于实验。
1.3 FITC标记 Annexin-V/PI双染流式细胞术分析
取经药物或溶媒处理的 HT-29细胞 1×106，1000g
离心 5min，弃上清，加入 195μL Annexin V-FITC结合
液(1×)和 5μL Annexin V-FITC，室温(20～25℃)避光孵
育 10 min。 然后，1000g 离心 5min， 弃上清， 加入
190μL Annexin V-FITC结合液(1×)和 10μL碘化丙啶
染色液，混匀，立即用 EPICS XL 流式细胞仪 (美国
COULTER公司) 检测 Annexin V-FITC 阳性(早期凋
亡)和 Annexin V-FITC/PI 双染阳性(晚期凋亡)细胞
百分率。
1.4 组蛋白/DNA碎片的含量测定
参照细胞死亡 ELISA检测试剂盒 (罗氏公司)说
明书描述的步骤操作， 用 EXL-800 酶联免疫检测
仪， 以 405nm波长测定吸光度(A)值。
1.5 免疫印迹分析
参照文献[7]描述的方法，目的条带经薄层扫描仪
(日本产，型号 CS-930)扫描，Alphazmager2200 软件
测定印迹区带的光密度值。以 Bax/β-actin和 Cyto C/
β-actin 的比值分别代表 Bax 或 Cyto C 蛋白表达水
平，以 DMSO组为 1.00。
1.6 统计学分析
实验数据以 mean±s 表示， 应用 SPSS15.0 统计
软件进行单因素方差分析(One-way ANOVA)。 方差
具有齐性， 用 LSD法进行多样本均数之间的两两比
较；方差不齐，采用 Dunnet T3 法进行多样本均数之
间的两两比较。 P<0.05认为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 EAFT对 HT-29细胞凋亡率的影响
图 1 可见：EAFT 诱导 HT-29 细胞系 Annexin
V-FITC 阳性(早期凋亡)和 Annexin V-FITC/PI 双染
阳性(晚期凋亡)细胞百分率增高，呈浓度依赖性(P<
0.01)。
A
B
Annexin Ⅴ-FITC/PI 双染 FCM 分析细胞凋亡
率。 A：3此独立实验中 1次实验的典型图像。 B：3次
实验的 mean±s；与溶媒组比较,**P<0.01；与溶媒组比
较，***P<0.001；与 0.1mg/LEAFT处理组比较,##P<0.01；
与 0.1mg/LEAFT处理组比较,###P<0.001。
2.2 EAFT对 HT-29细胞组蛋白/DNA 碎片的影响
图 2 示：EAFT 以浓度依赖方式增加 HT-29 细
胞组蛋白/DNA碎片(P<0.05)。
三叶青乙酸乙酯提取物诱导人结肠癌 HT-29细胞凋亡 刘跃银等 23
ELISA法检测细胞组蛋白/DNA碎片水平。 3次
实验的 mean±s；与溶媒组比较,*P<0.05；与溶媒组比
较 ,***P<0.001； 与 #0.1mg/LEAFT 处理组比较 ,###P<
0.05；与 0.1mg/LEAFT处理组比较,P<0.001。
2.3 EAFT对 HT-29细胞 Bax表达的影响
Western Blotting 分析表明：EAFT(10 mg/L)上调
HT-29细胞 Bax蛋白表达水平， 呈时间依赖性 (P<
0.01)。
Western Blot分析全细胞提取物 Bax表达水平。
图示 3 次实验中 1 次实验的典型图像， 相对密度
(Relative density)为 3次实验的 mean±s； 与溶媒组比
较, ***P<0.01；与溶媒组比较,**P<0.001。
2.4 EAFT对 HT-29细胞 Cyto C表达的影响
Western Blotting 分析证实：10 mg/L EAFT 以时
间依赖方式增加 HT-29 细胞 Cyto C 蛋白表达 (P<
0.05)。
Western Blot 分析细胞提取物 Cyto c 蛋白表达
水平。 图示 1次实验的典型图像，相对密度(Relative
density) 为 3 次实验的 mean±s； 与溶媒组比较,**P<
0.05；与溶媒组比较,*P<0.01。
3 讨论
众所周知， 细胞凋亡早期具有一个重要的特征
即位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸外翻至细胞膜外
侧。磷脂酰丝氨酸能特异结合膜磷脂蛋白Ⅴ(annexin
Ⅴ)。 因此，流式细胞仪检测的单纯 AnnexinⅤ-FITC
染色阳性细胞为早期凋亡细胞。 细胞凋亡的晚期，细
胞膜的通透性增高，DNA染料即 PI能进入细胞使细
胞 DNA发出荧光。因此，AnnexinⅤ-FITC/PI双染色
阳性的细胞为晚期凋亡细胞。 同时，在细胞凋亡的晚
期发生细胞基因 DNA断裂，形成组蛋白/DNA碎片，
因此，细胞组蛋白/DNA碎片水平增高能反映晚期凋
亡细胞增加。 本文的研究结果首先证明，EAFT具有
诱导人结肠癌 HT-29细胞凋亡作用；其主要证据有：
1) EAFT 以浓度依赖方式增加 Annexin Ⅴ-FITC 染
色和 (或)Annexin Ⅴ-FITC/PI 双染色阳性的 HT-29
细胞数目；2) EAFT增高 HT-29细胞组蛋白/DNA碎
片水平。
线粒体在细胞凋亡机制中的作用越来越引起人
们的重视。一方面由于线粒体膜间隙的细胞色素 C释
放至胞质后触发 caspase级联，导致细胞死亡；另一方
面， 线粒体外膜上的 Bcl-2蛋白家族调控细胞色素 C
自线粒体释放，凋亡过程中细胞色素 C通过线粒体外
膜释放，在 ATP/dATP 参与下，在胞质中与 Apaf-1 结
合形成寡聚体，Apaf-1通过其氨基端和 procaspase-9
的功能前区相互作用，导致caspase-9激活，并进一步
激活下游的 caspase 级联反应[8]。而 Bcl-2蛋白家族是
通过释放细胞色素 C执行凋亡指令[9]。本文的Western
Blotting 分析结果显示，EAFT 以时间依赖方式上调
HT-29 细胞 Bax 和 cyto C 蛋白表达水平。 说明，
EAFT 可能通过激活线粒体凋亡诱导途径导致结肠
癌 HT-29细胞凋亡。
综上所述，我们的结果证实：中国特有植物三叶
青的乙酸乙酯提取物 (EAFT) 能有效诱导人结肠癌
HT-29细胞凋亡， 其作用机制涉及激活线粒体凋亡
诱导途径。 提升了 EAFT作为人结肠癌候选药物的
可能性。
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（上接第 24页）
RICU内实施有创机械通气所必需， 但它使上呼吸
道加温、加湿及纤毛清除尘埃和微生物的生理保护
作用消失，使细菌容易侵入下呼吸道;②鼻胃管或鼻
肠管插入， 造成食管下端贲门括约肌收缩功能受到
影响，易发生胃内容物返流，导致胃肠道定植菌移位
侵入下呼吸道;③呼吸机管道回路及湿化装置污染，
冷凝水返流， 将致病菌引入而发生 VAP; ④开放式
RICU环境以及医务人员手的污染，在诊疗、护理操
作过程中工作量过大以及无菌操作不严格，导致交
叉感染。 RICU患者一般原发病危重、 应激反应严
重、意识障碍、免疫力低下及侵入性操作较多，是造
成院内感染尤其是 VAP高发的另一主要原因。机械
通气前往往经验性使用多种广谱抗生素， 导致致病
菌对常用抗生素普遍多重耐药， 不仅增加了患者的
经济负担，而且直接影响患者的治疗和预后[12]。 为减
少 VAP 的发生率，要注意以下防治措施 [13~15]：①手
术、护理严格依照无菌操作，呼吸机接头、管道及湿
化用的蒸馏水及湿化瓶每天消毒更换、 室内空气每
天 2次紫外线消毒，每次 1h。 ②减少机械通气时间
及适应个体的保护性机械通气，减少气压伤，也是减
少 VAP 的有效措施。 ③VAP 依痰培养及药敏试验
调整抗生素，早期应联合使用抗生素，同时预防并发
二重感染。④加强营养支持，并调节机体内平衡也具
有防止或减少 VAP的发生。⑤尽早拔除各种留置导
管，采取适当体位，减少误吸危险，及时翻身拍背吸
痰、体位引流加强。
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