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(收稿日期:2010-05-11)　　
(本文编辑:李志文)　　
论　　著
绵马贯众水和乙醇提取物抗病毒的实验研究
孙科峰 , 　于艳 , 　李丽静 , 　张哲 , 　邓莉 , 　李春霞 , 　杨关林
基金项目:辽宁省教育厅创新团队项目(2006T 096)
作者单位:110032沈阳 ,辽宁中医药大学附属医院中医药实验中心(孙科峰 ,于艳),心血管内科(张哲 ,邓莉 ,李春霞, 杨关林);130117 长
春 ,长春中医药大学中药药理教研室(李丽静)
作者简介:孙科峰(1956-),男 ,医学博士 ,主任医师。研究方向:中药复方配伍规律及中药药效组分成分筛选评价。
通讯作者:杨关林 ,110032 沈阳 ,辽宁中医药大学附属医院心血管内科。
　　【摘要】　目的　观察绵马贯众水 、乙醇两种提取物的抗病毒作用。方法　(1)离体实验:采用致细胞病
变法观察绵马贯众水 、乙醇两种提取物对流感病毒(FM1 株)、呼吸道合胞病毒(Long)、副流感病毒(Ⅰ型 、
Ⅲ型)、腺病毒(AD3)的抑制作用 , 计算药物半数有效浓度(EC50)、治疗指数(T I);(2)在体实验:绵马贯众提
取物按 25%、12.5%、6.25%原液的浓度设高 、中 、低 3 个剂量给药 ,并设立正常对照组和病毒对照组 ,观察
绵马贯众水 、乙醇两种提取物对滴鼻感染 FM 1 株流感病毒的昆明种小鼠肺指数的影响。 结果　绵马贯众
水 、乙醇两种提取物对流感病毒(FM 1 株)、呼吸道合胞病毒(Long)、副流感病毒(Ⅰ 型 、Ⅲ型)、腺病毒
(AD3)均具有一定的抗病毒作用 , 绵马贯众水提取物对上述病毒的 EC50分别为 110.58 、141.72 、126.21 、
152.66、182.55 ng/ L;T I 分别为 34.94 , 14.21 , 30.62 , 25.31 , 21.17。绵马贯众乙醇提取物对上述病毒的
EC50分别为 152.08 、168.27、132.28、135.26、156.38 ng/ L;T I 分别为 14.24 , 11.12 , 16.37 , 16.01 , 13.84。
绵马贯众水提物高 、中剂量组 、乙醇提取物高剂量组降低感染 FM1 株的小鼠肺指数 ,与病毒对照组比较差
异有统计学意义(P<0.05 , 0.01)。结论　绵马贯众水 、乙醇两种提取物均具有一定的抗病毒作用 , 可减低
病毒引起的肺损伤。
【关键词】　贯众/分离和提纯;　流感病毒/药物作用;　呼吸道合胞病毒/药物作用;　腺病毒/药物作
用;　动物 , 实验
doi:10.3969/ j.issn.1674-3865.2010.04.012
【中图分类号】　R285.5　【文献标识码】　A　【文章编号】　1674-3865(2010)04-0319-03
The antiviral research of water and alcohol extracts of Dryopteris Crassirhizoma　SUN Ke- feng ,YU Yan , LI
L i-j ing , et al.The E xperimental Center of TCM , the A f f i liated Hospital of L iaoning University o f
TCM , S henyang 110032 , China
【Abstract】　Objective 　 To investiga te the antiviral effects o f the wa te r and alcohol ex tracts of
Dryopteris Crassirhizoma.Methods　(1)The cy topa thic me thod w as used to obse rve the antiviral effects
in vitro o f the water and alcoho l ex tracts of Dryopteris C rassirhizoma on influenza v irus(FM1), respirato ry
syncyntial v ir us(Long), pa ra influenza virus(Ⅰ , Ⅲ), adenovirus(AD3);(2)Mice we re randomly div ided into
treated g roup(25%, 12.5%, 6.25% ex tract as high , middle and low do se respectively), normal contro l g roup
and model g roup , the in vivo antiviral effects o f them were studied in mice infected w ith influenza virus
(FM 1)on induced lung index.Results　Both the water and alcohol extracts of D ryopteris Crassirhizoma had the
antiviral effect on influenza virus(FM1), respiratory syncyntial virus(Long), para influenza virus(Ⅰ, Ⅲ), adenovirus
(AD3).EC50 of the water extract was 110.58 , 141.72 , 126.21 , 152.66 and 182.55 ng/ L , T I was 34.94 , 14.21 ,
30.62 , 25.31 and 21.17.EC50 of the alcoho l ex tract w as 152.08 , 168.27 , 132.28 , 135.26 and 156.38 ng/ L , T I
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was 14.24 , 11.12 , 16.37 , 16.01 and 13.84.The water ex tract 250 mg/ L(P<0.01)125 mg/ L(P<0.05), the
alcohol ex tract 250 mg/ L(P<0.01)Significantly inhibited lung index of mice infected with influenza virus
(FM1)increased the injury caused by virus.Conclusions　The w ater and alcoho l e xtr acts of Dryopteris Cras-
sirhizoma have the antiviral effect , which can reduce the lung injury caused by v irus.
【Key words】　Dryopteris Crassirhizoma/ separ ation and purifica tion;　Influenza virus/ action o f drugs;
Respirato ry syncyntial virus/action o f drugs;　Adenovirus/ action of drug s;　Animal , experiment
　　绵马贯众为常用中药 ,又名东北贯众 ,其来源为
鳞毛蕨科植物粗茎鳞毛蕨 Dryopteris crassirhizoma
Nakai的干燥根茎及叶柄残基 ,主产于东北 。始载
于《神农本草经》 ,有驱虫 、止血 、清热解毒的功能 ,临
床上用于风热感冒 、虫积腹痛 、热毒疮疡 、痄腮肿痛 、
崩漏等。本实验采用离体和在体实验的方法评价绵
马贯众两种提取物抗流感病毒(FM 1株)、呼吸道合
胞病毒(Long)、副流感病毒(Ⅰ型 、Ⅲ型)、腺病毒
(AD3)的作用。
1　材料与方法
1.1　实验动物　昆明种小鼠 108 只 ,雌雄各半 ,体
质量 18 ～ 22 g ,由吉林大学实验动物中心提供 ,动物
合格证号:SCXK(吉)2003-0002。
1.2　药品　绵马贯众水 、乙醇提取物由辽宁中医药
大学提供(每毫升含生药 1 g)。阳性对照药利巴韦
林注射液(湖北制药有限公司 ,批号:091022)。
1.3　试剂　MT T(3-(4 , 5-二甲基噻唑-2)-2 ,5-二苯
基四氮唑溴盐)为 Hyclone公司产品 ,M TT 以磷酸
盐缓冲液配制成 5 g/L 溶液 ,过滤除菌后置 4 ℃冰
箱保存备用 。二甲基亚砜为上海菲达有限公司产
品。1%鸡血由来亨公鸡翅下静脉取血 ,按 1∶4 加
入 Alserver 液后 4 ℃保存 ,使用时用生理盐水配成
1%鸡红细胞悬液。
1.4　细胞　犬肾传代细胞(Madin-Darby canine kid-
ney ,MDCK)、人宫颈癌传代细胞(Hela)由吉林市防
疫站提供。DMEM(Dulbecco′s modified eag le′s
mediurn)培养基由美国 Gibco 公司提供。 MDCK
细胞生长液中含有 10%胎牛血清 、1×105 U/L 青霉
素 、100 mg/L 链霉素;MDCK 细胞维持液中除含有
2%胎牛血清 ,并加入 2 g/mL 胰蛋白酶外 ,其他含
量均同细胞生长液。
1.5　病毒株　流感病毒(FM1株)、呼吸道合胞病毒
(Long)、副流感病毒(Ⅰ型 、Ⅲ型)、腺病毒(AD3)均购于
中国预防科学院病毒学研究所 ,用于体外抗病毒实
验。流感病毒使用前在 10日龄鸡胚尿囊腔接种传代
3～ 4次 ,收集尿囊液 ,以 3 000 r/min离心 15 min ,取
上清液进行血凝实验 ,将血凝滴度大于 1∶320且细
菌培养阴性的病毒液分装 ,置 -80 ℃保存备用 。
FM 1株由吉林省疾病预防控制中心提供 ,用于体内
抗病毒实验。
1.6　实验仪器　Model-680型酶标仪(美国伯乐公
司);二级生物安全柜(305040195 , France Ther-
mo);CKX41型倒置显微镜(日本奥林巴斯);MCO-
175型 CO 2 培养箱(日本三洋);AL-204型分析天平
(Metter-Thermo G roup);LD4-2A 型离心机(上海
安亭);Human up 900型超纯水机(韩国 Human)。
1.7　实验方法
1.7.1　药物对 MDCK 和 Hela 细胞毒性测定　实
验于长春中医药大学中药药理实验室完成 。将样品
分别配成0.1 g/mL 混悬液 , 0.22 μm 微孔滤膜滤过
除菌 ,分装备用。将 96孔板每孔加入 2×105 个/mL
密度的 MDCK细胞或 Hela细胞 0.1 mL ,培养至细
胞长成单层后 ,弃去原培养液 ,换含不同浓度的含药
维持液 ,每孔 200μL。药物的终浓度分别为 10 、20 、
40 、80 、160 、320 、640 、800 、1 600 μg/L ,置于 37 ℃
5%CO 2 培养箱培养。每日于倒置显微镜下观察细
胞变化 ,培养 72 h后计算细胞存活率 ,每一药物浓
度均重复 4孔 ,同时设正常细胞对照和病毒对照。
以 Probi t回归方法计算药物对 MDCK细胞的半数
毒性浓度(TC50)。
1.7.2　药物对抗病毒作用　先用 10TCID50的流感
病毒(FM1株)感染 MDCK细胞 ,用呼吸道合胞病毒
(Long)、副流感病毒(Ⅰ型 、Ⅲ型)、腺病毒(AD3)感染
Hela细胞 ,每孔 0.1 mL ,置于 35 ℃5%CO2 培养箱
孵育 2 h后 ,吸去病毒液 ,加入不同浓度的含药维持
液 ,在 35 ℃5%CO 2 培养箱继续培养 ,每天于倒置
显微镜下观察细胞变化;采用致细胞病变法进行试
验 ,待病毒对照孔细胞病变呈+++～ ++++,且
细胞对照正常时 ,计算细胞存活率 ,每一药物浓度重
复 4孔 ,同时设正常细胞对照和病毒对照 ,以 Probit
回归方法计算药物半数有效浓度(EC50)。治疗指数
(TI)=药物半数毒性浓度(TC50)/药物半数有效浓
度(EC50)[ 1] 。
1.7.3　绵马贯众水 、乙醇提取物体内抗病毒试验　取
昆明种小鼠 108只 ,用抓阄法随机分为 9 组 ,正常对
照组 、阳性对照组(利巴韦林)、病毒对照组及试验药
物高 、中 、低剂量组 ,每组 12只。在乙醚轻度麻醉下 ,
用已滴定的 FM 1株流感病毒液(以无菌盐水稀释成
每 0.05 mL 含 15个 LD50)滴鼻感染 ,每鼠 4滴 ,约
0.05 mL 。贯众提取物按 25%、12.5%、6.25%原液
的浓度设高 、中 、低 3个剂量给药 ,分别为 250 、125 、
62.5 mg/kg;阳性对照药利巴韦林剂量为 70 mg/kg 。
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以上药物均在病毒攻击后 2 h开始灌胃给药 ,共给药
4 d ,每日 1次。感染后 4 d禁食禁水 4 h以上 ,称小
鼠体质量 ,麻醉后处死取出鼠肺 ,记录病变程度 ,将
肺置于生理盐水的平碟中洗涤 2次 ,用吸水纸吸干
表面水分 ,称出肺湿质量。按以下公式计算肺指数
与抑制率:肺指数=小鼠肺湿质量(g)/小鼠体质量
(g)×100%;肺指数抑制率=(病毒对照组平均肺指
数-实验组平均肺指数)/病毒对照组平均肺指数×
100%[ 2] 。
1.8　统计学方法　采用 SPSS 11.5统计软件进行
统计学处理 ,数据以 x ±s表示 ,计量资料行 t检验 。
2　结果
2.1　绵马贯众水 、乙醇提取物对 MDCK 细胞和
Hela细胞的半数毒性浓度(TC50)比较　见表 1。
表 1　绵马贯众水 、乙醇提取物对 MDCK 和 H ela细胞的
半数毒性浓度(TC50)(ng/ L)
细胞株 绵马贯众水提取物 绵马贯众乙醇提取物 利巴韦林
Hela 3 864.08 2 165.02 >500
MDCK 2 014.09 1 870.65 171.71
2.2　绵马贯众水 、乙醇提取物的抗病毒作用比
较　见表 2。
表 2　绵马贯众水 、乙醇提取物的抗病毒作用
病毒株 型别 细胞株 绵马贯众水提取物
EC50(ng/ L) TI
绵马贯众乙醇提取物
EC50(ng/ L) TI
利巴韦林
EC50(ng/ L) TI
呼吸道合胞病毒 Long H ela 110.58 34.94 152.08 14.24 11.27 >44.37
流感病毒 FM1 M DCK 141.72 14.21 168.27 11.12 2.75 62.44
副流感病毒 Ⅰ型 H ela 126.21 30.62 132.28 16.37 10.43 >47.94
副流感病毒 Ⅲ型 H ela 152.66 25.31 135.26 16.01 11.70 >42.74
腺病毒 AD3 H ela 182.55 21.17 156.38 13.84 23.29 >21.47
　　注:EC 50 :药物半数有效浓度 , TI:治疗指数。
　　表 2结果表明 ,绵马贯众水 、乙醇提取物对呼吸
道合胞病毒(Long)、流感病毒(FM 1株)、副流感病
毒(Ⅰ型 、Ⅲ型)、腺病毒(AD3)均具有一定的抑制作
用。
2.3　绵马贯众水 、乙醇提取物的体内抗病毒作用　见
表3。
表 3　绵马贯众水 、乙醇提取物的体内抗病毒作用(n=12)
组别 剂量(m g/ kg)
肺指数
( x±s)
抑制率
(%)
正常对照组 - 0.92±0.30 -
病毒对照组 - 1.80±0.30a -
阳性对照组 70 1.24±0.19c 31.11
绵马贯众水提取物高剂量组 250 1.39±0.17c 22.78
绵马贯众水提取物中剂量组 125 1.52±0.25b 15.56
绵马贯众水提取物低剂量组 62.5 1.66±0.31 0.78
绵马贯众乙醇提取物高剂量组 250 1.32±0.35c 26.67
绵马贯众乙醇提取物中剂量组 125 1.59±0.19 11.70
绵马贯众乙醇提取物低剂量组 62.5 1.81±0.22 0
　　注:与正常对照组比较 , a t=7.235 , P<0.01;与病毒对照组比
较 , bt=2.469 , P<0.05 , c t=5.530 , 4.162 , 3.541 , P<0.01。
　　表 3结果表明 ,绵马贯众水提物高 、中剂量组 、
乙醇提取物高剂量组对滴鼻感染 FM 1株的小鼠均
有保护作用 ,可降低流感病毒感染小鼠的肺指数 ,减
轻病区引起的炎症反应 ,具有一定的抗病毒作用。
3　讨论
绵马贯众是中药贯众的主流品种 ,现代研究表明
其具有抗肿瘤 、抗疟 、抗病毒等活性[ 3] 。本课题组利
用鸡胚试验进行了抗病毒中药的筛选工作 ,发现绵马
贯众提取物对流感病毒具有显著抑制作用;通过离体
试验发现绵马贯众提取物对流感病毒(FM1 株)、呼
吸道合胞病毒(Long)、副流感病毒(Ⅰ型 、Ⅲ型)、腺病
毒(AD3)均具有一定的抗病毒作用;并通过在体实
验 ,观察到绵马贯众提取物降低感染 FM1株流感病
毒的昆明种小鼠的肺指数 ,可减低病毒引起的肺损
伤。同时通过实验 , 观察到绵马贯众水提取物对
MDCK细胞 、Hela细胞的毒性比乙醇提取物稍大;但
是从离体 、在体实验结果看到 ,绵马贯众水提取物的
抗病毒活性略好于乙醇提取物 ,对于水提取物和乙醇
提取物抗病毒的活性性成分需要进一步的研究。
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(收稿日期:2010-06-30)　　
(本文编辑:刘颖)　　
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