全 文 ：药　物　生　物　技　术
Pharmaceutical Bio technology 　2005 , 12(1):22 ～ 25
螺旋藻中性多糖硫酸化及性质研究*
沈　 ,尹鸿萍* ,王　 *
(中国药科大学微生物教研室 ,江苏 南京 210009)
摘　要　采用氯磺酸-吡啶法对螺旋藻中性多糖进行硫酸化修饰;玫瑰酸钠法测定修饰前后的多糖 SO2-4 含
量分别为 0. 17%、20. 0%;取代度 Ds=0. 429;利用琼脂糖凝胶电泳对多糖硫酸酯修饰物进行研究 , 结果表明多
糖硫酸酯修饰物的琼脂糖凝胶电泳呈一均一斑点 , 与其他几种硫酸化多糖相比迁移率有较大差异;红外光谱法
确定硫酸酯键在1 270 ～ 1 200 cm-1 , 1 000 ～ 800 cm-1处存在强的特征吸收峰;HPLC 显示出一个主要的单峰 , 说
明此制备方法可行。
关键词　螺旋藻;多糖硫酸酯;化学修饰
中图分类号:S555. +6　　　文献标识码:A　　文章编号:1005-8915(2005)01-0022-04
　　20世纪 60年代以来陆续发现 ,一些半合成硫
酸化多糖对多种有胞膜病毒有显著的抑制作用[ 1] ,
实验研究表明:均一多糖硫酸酯化产物抑制病毒的
作用优于杂多糖的硫酸酯化产物(如硫酸酯化香菇
多糖)[ 2 , 3] 。螺旋藻是一种浮游性丝状蓝藻 ,含有
多种生物活性物质[ 4] 。其中多糖具有提高机体免
疫力 、抗肿瘤 、抗辐射 、抗氧化 、抗衰老 、降血脂及提
高造血功能等作用[ 5] 。作者分离纯化所得的螺旋
藻中性多糖(neutral poly saccharide of S pirul ina
P latensis , NPSP)为均一葡聚糖 。对其进行硫酸
化修饰 ,并对修饰后的硫酸酯化多糖的性质及结构
进行一系列的研究。
1　实验试剂与仪器
琼脂糖 , Spanish 进口分装;玫瑰酸钠 、肝素 、
硫酸软骨素 、硫酸化葡聚糖 DE-1(平均分子质量
1 000 u),Sigma 公司;吡啶 、氯磺酸及其他试剂均
为国产分析纯。
惠普 6 890气相色谱仪;EPS604 电泳仪 、
EPS604水平电泳槽(胶板面积 7 cm ×9 cm),南京
科宝仪器研究所 , 752N 紫外可见分光光度计 ,上
海精密科学仪器有限公司;涡旋混合器 ,上海医科
大学仪器厂;万分之一电子分析天平 ,北京赛多利
斯仪器系统有限公司;高效液相层析系统 ,A gilent
公司;Nico le t Im2Pact410型红外光谱仪。
NPSP 供试品由本室制备 ,其糖含量经硫酸苯
酚法[ 6] 测定为 89. 07%。
2　实验方法
2. 1　GC检测多糖组成
2. 1. 1　色谱条件　HP-5%苯甲基硅烷毛细管柱
(30 m ×0. 25mm ×0. 25 μm)N 2 流速:恒流模式
1. 3ml /min;程序升温:110℃至 124℃,0. 2℃/min;
124℃至126℃,3℃/min;126℃至280℃,10℃/min。
2. 1. 2　酸水解 　精密称取 NPSP 样品15 mg ,溶
于2 mol /L三氟乙酸1. 5 ml ,充氮气封口 , 110℃油
浴2 h ,60℃减压蒸干。
2. 1. 3　糖醇乙酸酯衍生物的制备[ 6] 　在蒸干的
多糖水解样中加入30 mg硼氢化钠 , 2 m l水 , 振
荡使完全溶解后室温放置1. 5 h ,使单糖还原成
相应的糖醇 。滴入醋酸分解过量的硼氢化钠 ,
至无气泡产生为止 。溶液在 60℃下减压浓缩至
干 ,加入0. 1%(V /V)盐酸甲醇溶液2 m l ,振荡
后减压蒸发至干 , 重复 4 次(加盐酸甲醇并蒸
干)以彻底除去硼酸根 。剩余物在 105℃烘箱中
加热 15 min以除去水分 。加入 0. 5 m l吡啶和
0. 5 m l醋酸酐 ,封管后沸水浴反应1 h使转变成
糖醇乙酸酯衍生物 ,反应物减压浓缩至干 ,将剩
余物用适量二氯甲烷溶解 , 离心除去不溶物 ,取
样进行气相色谱分析 。
22
* 收稿日期:2004-09-29　修回日期:2004-11-11
作者简介:沈 ,女 , 1977年生 ,江苏南京人 ,中国药科大学生命科学与技术学院 2002级硕士研究生.
　 * 通讯作者:尹鸿萍,副教授 , Tel:025-83271108　王 ,教授 ,博导 , Tel:025-83271395
2. 2　多糖硫酸酯的合成[ 1] 及理化性质
2. 2. 1　合成方法 　采用氯磺酸-吡啶法 。将吡
啶10 m l加入附有冷凝管和搅拌装置的100 m l三
颈瓶中 。冰盐浴冷却下 , 用恒压漏斗慢慢滴入
氯磺酸1. 8 m l , 10 min 滴加完毕 。将 N PSP 约
200 mg加入三颈瓶 , 立即将三颈瓶移入预热至
100℃的油浴中恒温反应1 h。修饰分子摩尔比
约为氯磺酸∶吡啶∶NPSP =1∶4. 5∶5. 7×10-7 。
冷至室温 , 将反应液倾入冰水中 , 2. 5 mol /L
NaOH 调至中性 。用去离子水透析 3 d ,未透液
经浓缩 ,加入 3 倍体积无水乙醇 ,过夜沉淀 。离
心收集沉淀 , 低温真空干燥得淡黄色多糖硫酸
酯修饰物 。
2. 2. 2　多糖 SO 2-4 含量测定 　取 NPSP 、多糖硫
酸酯修饰物约10 mg , 精密称定 ,置玻璃离心管
中 ,加1 mol /L HC l溶液10 m l ,振摇至供试品全
溶 ,于 100℃水解6 h 。冷却后 , 65℃下减压蒸
干 。加少许水 ,重新减压蒸干 。残渣加水溶解 ,
NPSP 定容于25 m l容量瓶 、多糖硫酸酯修饰物
定容于100 m l容量瓶中 。过滤除去不溶物即得
供试品溶液 。
按文献[ 7]方法进行 SO 2-4含量测定
2. 2. 3　取代度(Deg ree o f substi tution , Ds)[ 6]
按分式:Ds=[ 1. 62×ω(s)/%] /[ 32-1. 02×
ω(s) /%]计算 。
2. 3　琼脂糖凝胶电泳
取 NPSP 、多糖硫酸酯修饰物 、硫酸软骨素 、肝
素及标准硫酸化葡聚糖 ,加水溶解配成10 mg /ml
的供试品溶液 ,按文献[ 8]方法进行电泳 ,电泳结束
后 ,计算各供试品的电泳迁移率。
2. 4　红外光谱分析
采用 KBr 压片 , 在4 000 ～ 400 cm-1区间扫描
红外吸收 。
2. 5　HPLC分析
将 NPSP 、多糖硫酸酯修饰物供试品进行
HPLC分析。
HPLC色谱条件:Ag ilent高压液相层析系统;
柱为 Shodex 公司 KS-804和 KS-802两柱串联 ,示
差光学检测器检测。样品浓度为4 mg /ml ,上样量
20μl , 洗脱液为0. 03 mo l /L NaAc-HAc 缓冲液
(pH 值 5. 0),柱温 50℃,流速0. 5m l /min 。
3　结　果
3. 1　NPSP 单糖组成测定
NPSP 气相色谱见图 1。
Fig 1　P rofile of NPSP on GC
由 GC 结果分析:N PSP 由均一的葡聚糖
组成 。
3. 2　多糖理化性质测定结果
NPSP 、多糖硫酸酯修饰物的 SO 2-4含量分别为
0. 17%, 20. 0%(n=3)。D s=0. 429。
3. 3　琼脂糖凝胶电泳
1. NPSP sulfate;2. NPSP;3. Bromophenod blue
Fig 2　Agarose gel electropho resis before and after chemi-
cal modifica tion
NPSP 、多糖硫酸酯修饰物的电泳结果见图 2。
结果显示 ,NPS P 在电泳中无斑点显示 ,多糖硫酸
酯修饰物在琼脂糖凝胶电泳上呈单一斑点。标准
硫酸化葡聚糖 、肝素 、硫酸软骨素 、多糖硫酸酯修饰
物的电泳结果见图 3 。结果显示 ,多糖硫酸酯修饰
23沈　 等:螺旋藻中性多糖硫酸化及性质研究
物在琼脂糖凝胶电泳上呈均一斑点 ,且斑点位置与
标准硫酸化葡聚糖等其他几种酸性多糖的斑点位
置有明显区别。与溴酚蓝指示剂相比 ,各组分 Rf
依次为1. 37 ,1. 19 ,1. 16 , 1. 02 。
1. Su lfated dex t ran (M r 10 1 000)l;2. H eparin;
3. Chondroitin sulfated;4. NPSP sulfate;5. Bromophenol blue
Fig 3　Aga rose gel electropho resis of polysaccha rides
3. 4　红外光谱分析
Fig 4　FT IR spectra of NPSP
图 4和图 5分别为 NPSP 和多糖硫酸酯修饰
物的红外光谱图。从中可以看出多糖硫酸酯修饰
物在波数 3 560 cm-1有 O —H 的伸缩振动特征吸
收峰;在1 270 ～ 1 200 cm-1处有 S O不对称伸缩
振动和S O对称伸缩振动特征吸收峰;在1 000
～ 800 cm-1处有一组 S —O 伸缩振动吸收峰。而
NPSP 的红外光谱图中未见 S O 和 S —O 的振
动吸收峰。这进一步证实了硫酸基与 NPSP 结合
成硫酸酯化合物 。
Fig 5　FT IR spectra o f NPSP sulfate
3. 5　HPLC 分析
Fig 6　HPLC analy sis o f NPSP
Fig 7　HPLC analy sis o f NPSP sulfa te
图 6和图 7是 HPLC 对 NPSP 和多糖硫酸酯
修饰物样品进行检测的结果 。图 8为两者混合进
样的结果 。结果显示 ,在此硫酸化条件下N PSP 与
多糖硫酸酯修饰物均呈现出一个主要的单峰 。出
峰的时间分别为21. 289 min 、23. 789 min;含量分
别为 91. 34%、90. 26%。
24 药 物 生 物 技 术 第 12 卷第 1 期　
F ig 8　HPLC ana ly sis o f NPSP and NPSP sulfate
4　讨　论
以往测定多糖中 SO 2-4 含量多用硫酸钡浊度
法 ,此法在其测定波长360 nm处没有最大吸收峰 。
本文采用玫瑰酸钠法测定多糖中的 SO2-4 含量并对
此法进行了方法学考察 ,证明其灵敏度是硫酸钡浊
度法的 20倍。并且操作简便 ,适合实验室分析操
作。通过实验验证该方法在 2 ～ 10μg 范围内线性
关系良好 ,相关系数 r能够达到 0. 999 9。同时 ,该
方法具有良好的精密度 、准确度和重现性。利用本
方法测定 SO 2-4含量时 , 10 min之前随时间延长测量
结果升高 ,而30 min后 ,随时间的延长测量值会逐
渐降低 。因此 ,加样静置10 ～ 15 min后 , 在30 min
内进行检测。
以琼脂糖凝胶作为电泳介质 ,一般按供试品的
电荷量进行分离 ,供试品自身所带电荷的多少决定
了其电泳迁移率的大小。从实验结果可以看出 ,
NPSP 供试品在凝胶中不呈现斑点 。经过硫酸化 ,
供试品在凝胶中呈现均一斑点 ,表明生成了螺旋藻
中性糖硫酸酯 ,并且其所带电荷在一定范围内均匀
连续分布;螺旋藻中性糖硫酸酯的电泳迁移率与其
它酸性多糖相比有较大差异 ,提示可利用琼脂糖凝
胶电泳对其进行定性鉴别。
螺旋藻中性糖硫酸酯的生物活性将另文报道 。
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Study on the Sulfarization and Charater of Neutral Polysaccharide from
Spirulina Platensis
SHEN Yun , YIN Hong-ping , WANG Min
(Department of Microbiology , China Pharmaceutical Univ ersity , Nanj ing 210009 , China)
Abstract　A neutral poly saccharide f rom S pirul ina Platensis (NPSP) as sulfated by chlorosulfonic acid-
py ridine method. With the me thod o f sodium rhodizonate , the content of sulfate group of NPSP and NP-
SP sulfate w as 0. 17%and 20. 0%. T he average of substi tution Ds was 0. 492. Using agarose gel elect ro-
phoresis (AGE), the electrophoretic behaviors o f NPSP sulfate had one spot and compared w ith other
kinds o f sulfate poly saccharides , i ts mig ration ratio w as dif feren. Some strong characteristic absorption
peaks o f ester sulphate bonds w ere observed at 1 270 ～ 1 200 cm-1 and 1 000 ～ 800 cm-1 respect ively by
FTIR. A majo r sing le peak in HPLC showed the method w as successful.
Key words　S pirulina Platensis , Po lysaccharide sulfate , Chemical modification
25沈　 等:螺旋藻中性多糖硫酸化及性质研究