全 文 ：· 1850 · 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2013, 48 (12): 1850−1855



基于 DNA 条形码技术探讨板蓝根及大青叶基原物种问题
孙稚颖 1, 庞晓慧 2*
(1. 山东中医药大学药学院, 山东 济南 250355;
2. 中国医学科学院、北京协和医学院药用植物研究所, 濒危药材繁育国家工程实验室, 北京 100193)
摘要: 本文对我国板蓝根及大青叶原植物的物种进行了探讨, 以澄清分类上的混乱现象。利用 PCR直接测序
法对采集的全国 22份样本, 测定了核基因 ITS2区和叶绿体 matK基因片段, 所得序列经 CodonCode Aligner拼
接后, 用软件MEGA4.0进行相关数据分析, 并构建 NJ (邻接) 树。 结果表明, 所研究样本 ITS2片段长度为 191 bp,
测序峰图显示不同研究样本间具有多个单核苷酸多态性 (SNP) 位点, 部分样本具有杂合位点; 从构建的 NJ 树
图可以看出, 基于核 ITS2片段, 所研究样本被分成两大支, 其中一支与欧洲菘蓝相聚。基于叶绿体matK序列, 所
研究样本也被明显分成两支。因此本研究支持板蓝根及大青叶的原植物为菘蓝 (Isatis indigotica Fortune), 与欧
洲菘蓝 (Isatis tinctoria L.) 是独立的两个物种, 不支持 Flora of China中将二者合并的观点。
关键词: 菘蓝; 欧洲菘蓝; DNA条形码; 分类
中图分类号: R931 文献标识码: A 文章编号: 0513-4870 (2013) 12-1850-06
Discussion on the botanical origin of Isatidis Radix and
Isatidis Folium based on DNA barcoding
SUN Zhi-ying1, PANG Xiao-hui2*
(1. College of Chinese Medicine, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China;
2. National Engineering Laboratory for Breeding of Endangered Medicinal Materials, Institute of Medicinal Plant Development,
Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100193, China)

Abstract: This paper aimed to investigate the botanical origins of Isatidis Radix and Isatidis Folium, and
clarify the confusion of its classification. The second internal transcribed spacer (ITS2) of ribosomal DNA,
the chloroplast matK gene of 22 samples from some major production areas were amplified and sequenced.
Sequence assembly and consensus sequence generation were performed using the CodonCode Aligner.
Phylogenetic study was performed using MEGA 4.0 software in accordance with the Kimura 2-Parameter (K2P)
model, and the phylogenetic tree was constructed using the neighbor-joining methods. The results showed that
the length of ITS2 sequence of the botanical origins of Isatidis Radix and Isatidis Folium was 191 bp. The
sequence showed that some samples had several SNP sites, and some samples had heterozygosis sites. In the
NJ tree, based on ITS2 sequence, the studied samples were separated into two groups, and one of them was
gathered with Isatis tinctoria L. The studied samples also were divided into two groups obviously based on
the chloroplast matK gene. In conclusion, our results support that the botanical origins of Isatidis Radix and
Isatidis Folium are Isatis indigotica Fortune, and Isatis indigotica and Isatis tinctoria are two distinct species.
This study doesn’t support the opinion about the combination of these two species in Flora of China.
Key words: Isatis indigotica; Isatis tinctoria; DNA barcodes; classification

收稿日期: 2013-06-10; 修回日期: 2013-07-29.
基金项目: 国家高技术研究发展计划 (863 计划) (2012AA021602); 教育部长江学者和创新团队发展计划 (IRT1150); 中央级公益性科研院所基本
科研业务费专项 (YZ-12-08).
*通讯作者 Tel: 86-10-57833051, E-mail: xhpang@implad.ac.cn
孙稚颖等: 基于 DNA条形码技术探讨板蓝根及大青叶基原物种问题 · 1851 ·


板蓝根和大青叶是我国传统中药材, 具有清热解
毒、凉血利咽作用, 2010版《中国药典》规定二者来源
均为十字花科植物菘蓝 (Isatis indigotica Fortune)[1]。
然而, 在 Flora of China (2001)[2]中, 我国的菘蓝已被
并入欧洲菘蓝 (I. tinctoria L.), 原因是二者在形态上
具有多样性, 存在种间过渡, 不应作为两个独立的物
种。我国乔传卓教授等早在 1980～1982 年间曾对菘
蓝 (I. indigotica) 和欧洲菘蓝 (I. tinctoria) 的染色体、
孢粉学、蛋白质化学以及吲哚苷的含量做过研究[3],
认为菘蓝是我国原产的 I. indigotica, 尽管在长期栽
培过程中菘蓝形态上产生了较大变异, 但其染色体
数为 2n = 14, 而欧洲菘蓝为 2n = 28, 另外二者所含化
学成分也有所差异。明确药材的物种来源是确保药材
安全有效的重要前提, 因此我国传统大宗药材板蓝
根和大青叶的原植物到底是菘蓝还是欧洲菘蓝, 亦
或是一个种？它们的遗传背景如何？尚需进一步从
分子水平进行研究。
DNA 条形编码[4]或称 DNA 条形码技术 (DNA
barcoding) 是利用标准的、有足够变异的、易扩增且
相对较短的 DNA 片段 (DNA barcode) 自身在物种
种内的特异性和种间的多样性而创建的一种新的生
物身份识别系统, 它可以对物种进行快速的自动鉴
定[5]。自加拿大动物学家 Paul Hebert[6]于 2003年首次
提出 DNA条形码概念以来, DNA条形码研究已成为
近年来生物分类学研究的热点和前沿[7−9]。对于分类
学中难以区分的类群, 采用 DNA 条形码可以抛开形
态上的假象, 从基因水平上提供一种分类依据[10]。本
研究选取目前被广泛认可的 DNA 条形码候选序列:
核 ITS2 片段和叶绿体 matK 基因[11−20], 对采自全国
板蓝根和大青叶不同产区和研究基地的二十余份样
本进行了研究和探讨, 主要目的是为我国传统药材
板蓝根及大青叶的基原物种的确定提供分子证据。

材料与方法
材料 从全国 7 个省和直辖市采集板蓝根及大
青叶原植物样本共计 22份。由笔者做初步形态鉴定。
取新鲜叶片, 硅胶干燥保存备用。供试样品来源见表
1。凭证标本保存于中国医学科学院药用植物研究所。
DNA提取 取硅胶干燥叶片约 10 mg, 用 DNA
提取研磨仪 (Retsch MM400, Germany) 研磨 1 min
(30 次/秒) 后, 利用植物 DNA 提取试剂盒 (Tiangen
Biotech Co., China) 提取总 DNA。
PCR扩增及测序 扩增 ITS2序列所用引物, 正
向为 5-GCGATACTTGGTGTGAAT-3, 反向为 5-GA
CGCTTCTCCAGACTACAAT-3。PCR反应体积为 25
μL, 体系内含 MgCl2 2 μL (25 mmol·L−1)、dNTP 2 μL

Table 1 Source of materials
Sample No. Code Collection place Collector Collection date
1 FY02 Economic development zone of Fuyang, Anhui ZY Sun, S Li 2009.5.20
2 FY13 Economic development zone of Fuyang, Anhui ZY Sun, S Li 2009.5.20
3 LX04 Taihe, Anhui ZY Sun, S Li 2009.5.20
4 LX06 Taihe, Anhui ZY Sun, S Li 2009.5.20
5 ZY01 China Pharmaceutical University, Nanjing ZY Sun, S Li 2009.5.21
6 ZY02 China Pharmaceutical University, Nanjing ZY Sun, S Li 2009.5.21
7 ZS01 Jiangsu Institute of Botany, Nanjing ZY Sun, S Li 2009.5.21
8 ZS02 Jiangsu Institute of Botany, Nanjing ZY Sun, S Li 2009.5.21
9 EJ01 Medicinal Plant Garden, Shanghai Second Military Medical University ZY Sun, S Li 2009.5.22
10 EJ11 Medicinal Plant Garden, Shanghai Second Military Medical University ZY Sun, S Li 2009.5.22
11 LM01 Liming College, Shandong ZY Sun 2009.5.25
12 LM04 Liming College, Shandong ZY Sun 2009.5.25
13 LZ01 Yuanyang, Henan ZY Sun 2009.5.27
14 LZ05 Yuanyang, Henan ZY Sun 2009.5.27
15 YZ02 Institute of Medicinal Plant Development, Beijing ZY Sun 2009.4.18
16 YZ12 Institute of Medicinal Plant Development, Beijing ZY Sun 2009.6.7
17 YZ13 Institute of Medicinal Plant Development, Beijing ZY Sun 2009.6.7
18 YZ01 Institute of Medicinal Plant Development, Beijing ZY Sun 2009.6.7
19 SLYZ Institute of Medicinal Plant Development, Beijing ZY Sun 2010.6.20
20 AG02 Anguo, Hebei S Li 2009.6.3
21 AG11 Anguo, Hebei S Li 2009.6.3
22 SLNJ Jiangsu Institute of Botany, Nanjing L Li 2010.10
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(2.5 mmol·L−1)、PCR buffer 2.5 μL (10×)、引物各 1.0 μL
(2.5 μmmol·L−1)、Taq聚合酶 1.0 U、总DNA约 1 μL (～
30 ng)。扩增程序: 94 ℃, 变性 5 min; 再进行 40个循
环 (94 ℃变性 30 s, 56 ℃退火 30 s, 72 ℃延伸 45 s);
最后 72 ℃延伸 10 min。叶绿体 matK基因序列的 PCR
反应条件、通用引物及扩增程序参见文献[11−14]。PCR
仪为 Peltier Thermal Cycler PTC0200 (BioRad Lab,
Inc., USA)。利用 ABI3730XL对纯化的 PCR产物双
向测序, 测序引物与 PCR扩增引物一致。
数据处理 测序峰图利用CodonCode Aligner V 3.0
(CodonCode Co., USA) 校对拼接, 去除引物区, 基
于隐马尔可夫模型的HMMer注释方法去除两端 5.8S
和 28S 区段获得 ITS2 间隔区序列[21]。matK 基因片
段采用 CodonCode Aligner处理, 剔除两端测序低质
量部分。此外, 从 GenBank下载了采自捷克的欧洲菘
蓝 ITS2序列DQ249851和采自新疆的乌斯玛 ITS2序
列 AF384105。将所有序列用软件 MEGA (Molecular
Evolutionary Genetics Analysis) 4.0分析比对并进行
遗传距离等分析, 用 NJ (邻接) 法构建系统聚类树。

结果与分析
1 序列分析
1.1 核 ITS2序列分析 经序列比对分析, 实验样本
的 ITS2间隔区序列长度为 191 bp, GC含量为 56.0%,
具有一个 PolyC结构。不同样本间具有单核苷酸多态
性位点 (SNP), 此外部分样本序列碱基具有杂合位
点, 见图 1 (样本号在每条峰图的左上角) 和表 2, 如
147nt处, 样本 LX06和 AG02都是纯合的碱基 T, 样
本 ZS01和 ZS02都是纯合的碱基C, 而采自中国医学
科学院药用植物研究所药植园和上海第二军医大学
药圃的样本出现了 (T-C) 杂合位点。
1.2 叶绿体matK序列分析 叶绿体matK序列拼接
后, 除去两端引物及测序低质量部分, 所研究样本
matK序列长度为 783 bp, GC含量为 30.5%～30.8%,
具有 2个 PolyT结构, 7个 PolyA结构; 包含 4个 SNP
位点, 见图 2、表 3, 如 120 nt处, 样品 AG02、LX04、
YZ02、YZ12的碱基是A, 而样品 SLNJ、ZS01和 ZS02
的碱基是 C, 均为纯合位点。
2 系统学分析
2.1 ITS2序列 基于 ITS2序列, 利用 MEGA4.0构
建的NJ系统聚类树图 (图 3) 显示, 所研究样本被聚
为两大分支。其中绝大多数样本聚在了第一分支 ,
AF384105 是采自新疆的菘蓝, 当地人称“乌斯玛”,
第二分支包括捷克的欧洲菘蓝 DQ249851 以及采自
江苏植物研究所的 3 个样本和中国医学科学院药用
植物研究所的 YZ13。


Figure 1 Part ITS2 sequence peaks of studied samples (Note: SNP and heterozygosis sites)
孙稚颖等: 基于 DNA条形码技术探讨板蓝根及大青叶基原物种问题 · 1853 ·


Figure 2 MatK sequence peaks of some samples (Note: SNP site)


Table 2 SNP and heterozygosis sites in ITS2 sequence of
studied samples
Sample 34nt 55nt 109nt 147nt 153nt 163nt
AG02 A G T T C G
AG11 A G T T C G
FY02 A G(C) T T C G
FY13 A G T T C G
LM01 A G T T C G
LM04 A G T T C G
LX04 A G T T C G
LX06 A G(C) T T C G
LZ01 A G T T C G
LZ05 A G T T C G
ZY01 A G T T C G
ZY02 A G T T C G
EJ01 A(G) G T(C) T(C) C(T) G(A)
EJ11 A G T T C G
YZ02 A G T T C G
YZ01 A G T(C) T(C) C G
YZ12 A G T(C) T(C) C(T) G
YZ13 A(G) G(C) C(T) C(T) T(C) G(A)
SLYZ A(G) G(C) C(T) C(T) C(T) G(A)
AF384105 A G T T T G
ZS02 A(G) G C C T G(A)
ZS01 G(A) G C C T A(G)
SLNJ G(A) G C C T A(G)
DQ249851 G G C C T A
Table 3 SNP sites in matK sequence of studied samples
Sample 29nt 120nt 435nt 484nt
AG02, AG11, FY02, FY13, LM01, LM04,
LX06, LX04, LZ05, LZ01, ZY01, ZY02,
EJ01, EJ11, YZ02, YZ13, SLYZ
C


A


C


C


ZS01, ZS02, SLNJ T C C T
YZ01, YZ12 T A A C


Figure 3 Phylogenetic tree constructed by the ITS2 sequences
using NJ method. The bootstrap scores (1 000 replicates) are
shown (≥50%) for each branch.
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2.2 matK 序列 基于叶绿体 matK 序列 , 利用
MEGA4.0 构建的 NJ 系统聚类树图 (图 4) 显示, 所
研究样本被聚为两大分支。第一分支包括绝大多数样
本, 其中 YZ01 和 YZ12 又与其余样本有所区别; 第
二分支为采自江苏植物所药用植物园的 3个样本。


Figure 4 Phylogenetic tree constructed by the matK sequences
using NJ method. The bootstrap scores (1 000 replicates) are
shown (≥50%) for each branch

讨论
长期以来, 国内外植物分类学界和药学界对我
国菘蓝的基原植物存在分歧。王希平等[22]对菘蓝学
名的考证认为 Isatis tinctoria (欧洲菘蓝) 非我国原
产, 而我国原产的菘蓝应是 I. indigotica。乔传卓等[23]
研究表明: 菘蓝和欧洲菘蓝不仅在外部形态, 而且在
染色体数、花粉形态及同工酶和可溶性蛋白的生化特
征等方面均有明显的差异。在板蓝根的商品中, 以前
一些老药工在鉴别时发现, 药材有“性糯”不易折断
及“性硬”易折断两种类型。这说明商品药材的原植
物非同一种, 可能是两种不同的原植物。后来包雪生
等人对菘蓝及欧洲菘蓝在生药性状、组织解剖等方面
进行了系统研究, 发现菘蓝根中木质部较不发达, 木
质部纤维较少, 韧皮部占大部分, 基本组织中含大量
淀粉粒, 干燥的根易折断, 这与药工所谓“性硬”相
符; 而欧洲菘蓝根木质部发达, 且具较发达的木纤维,
基本组织含淀粉粒少, 干燥根不易折断, 这与药工所
谓“性糯”相符。这说明在以往的板蓝根药材中确
有菘蓝及欧洲菘蓝两种原植物。但现在商品中只有
菘蓝了, 其主要原因是欧洲菘蓝须根多, 质量欠佳而
被淘汰[3]。本研究利用 DNA条形码 ITS2片段及叶绿
体 matK 基因序列发现, 所研究样本确实分为两大类
群。江苏植物研究所药用植物园所取样品均独立出
来, 且其 ITS2 序列与欧洲菘蓝聚为一支。序列结果
表明此两类群间有 5 个稳定的碱基变异位点, 参照
峰图, 其碱基位点均为纯合位点。因此, 研究结果认
为所研究样本包含两大类, 一类为菘蓝, 占绝大多
数, 其中包括主产区河北、安徽、河南等地所采样本;
另一类即为欧洲菘蓝, 主要分布在以科研为目的的
药用植物园, 引种而来[24, 25]。本研究支持我国学者乔
传卓及包雪生等人的研究结果, 也支持一些欧洲学
者[26−28]基于化学成分和分子标记确定欧洲菘蓝与菘
蓝为两独立物种, 不支持 Flora of China中将二者合
并的观点。
在所研究样本中, 采自中国医学科学院药用植
物研究所、上海第二军医大学的几个样本在核 ITS2
序列中来自双亲的碱基位点叠加形成杂合现象, 并
且呈现一种过渡状态, 初步认为出现了基因流。据后
来笔者调查, 中国医学科学院药用植物研究所药用
植物园、上海第二军医大学药用植物园在种植菘蓝的
同时, 也引种了欧洲菘蓝, 所以很有可能混种在一起
的菘蓝与近缘种欧洲菘蓝发生了一定程度的杂交 ,
引种的欧洲菘蓝将其自身的某些基因带到了新的群
体中, 从而发生了基因流现象。基于叶绿体 matK 基
因序列片段所得结果与核序列 ITS2 结果稍有差异,
主要集中在变异类型 YZ13的归属。核基因序列与叶
绿体基因序列进化规律不同, 核基因序列为双亲遗
传, 而叶绿体基因序列为母系遗传, 前人研究报道单
亲遗传构建的分支关系往往不能真正反映种内进化
方向[29], 两种序列就本研究的具体类群所体现的差
异, 值得进一步探讨。
菘蓝与欧洲菘蓝在外部形态上有一定差异, 欧
洲菘蓝为四倍体, 植株较高大, 叶绿色, 常被毛, 而
菘蓝为二倍体, 植株相对较矮, 叶常呈灰绿色, 被蜡
质。但由于某些地区引种欧洲菘蓝与菘蓝混种, 导致
形态出现了过渡, 从而引起对其物种认识的偏差, 要
解决这些由于对形态变异的认识不同而产生的分类
学问题, 必须借助于独立于形态特征之外的分子标
记。DNA条形码用短的、标准的 DNA片段作为物种
标记进行鉴定, 不受个体形态特征限制, 可实现生物
物种的快速准确鉴定, 并能从基因水平提供一种分
类依据。本研究基于 DNA 条形码候选序列 ITS2 与
matK 基因对菘蓝及欧洲菘蓝的物种分类问题进行了
探讨, 可为我国传统药材板蓝根及大青叶基原物种
孙稚颖等: 基于 DNA条形码技术探讨板蓝根及大青叶基原物种问题 · 1855 ·

的确定提供分子证据。
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