全 文 ：海洋科学/2003年/第 27卷/第 1期34
抑制螺旋藻胞内核酸酶活性的研究 *
柯珍恋 徐 虹 章 军 **
(厦门大学生命科学学院 细胞生物学与肿瘤细胞工程教育部重点实验室 厦门 361005)
提要 螺旋藻细胞内较高的胞内核酸酶活性是外源基因转化螺旋藻的主要障碍 。以供体质
粒 pEUTISI为酶消化底物 , 通过多种方法处理螺旋藻细胞 , 然后检测其胞内核酸酶粗提液对
pEUTISI的降解作用 ,结果表明 , 2 mmol/L以上的 EDTA处理 16 h或无Mg2 +螺旋藻培养基培养
72 h以上 , 都可使处于对数生长期的螺旋藻胞内核酸酶活性显著降低;低于 28℃(如 24℃)培
养也可降低螺旋藻的胞内核酸酶活性 。根据实验结果 ,建议在螺旋藻转化前 72 h开始低温 、无
Mg
2 +培养 ,转化前 16 h提高培养基中EDTA的浓度至 2 mmol/L ,就能获得胞内核酸酶活性极低
的受体藻 ,有利于外源基因的转化 。
关键词 螺旋藻 ,胞内核酸酶 ,低温培养 , EDTA处理 ,无Mg2 +培养
中图分类号 Q949.22 文献标识码 A 文章编号 1000_3096(2003)01_0034_04
螺旋藻是众所周知的优良天然营养源 , 由于其
基因组结构简单便于遗传操作 、对外源蛋白的容受力
高 、繁殖迅速 、再生快 、培养条件简单 、成本低廉等诸
多优点而使其成为极具潜力的基因工程受体藻 。但
是 ,尽管有不少研究者在螺旋藻基因工程方面开展了
大量的工作 , 进行了不懈的努力 , 但其进展依然缓
慢 。其主要原因目前尚不很清楚 ,但许多研究者认为 ,
螺旋藻细胞内存在丰富的高活性核酸酶 ,能阻止外源
DNA的转入和整合 。对螺旋藻来说 ,这是一种自我保
护机制 , 能防止外源 DNA的侵入 。但对研究者而言 ,
这却成了螺旋藻基因转化的一个巨大障碍 [1 ]。要成功
建立螺旋藻的转化与表达体系 ,实现外源基因在螺旋
藻中的稳定和高效表达 , 就必须克服螺旋藻胞内高活
性核酸酶的障碍 。Cao等 [2 ]和茅云翔等 [3 ]先后报道用
无Mg2 +的 Zarrouk培养基培养螺旋藻或用 EDTA处理
等方法 ,均能大大降低其胞内和胞外 DNAase活性 。本
实验室也通过对多种处理条件的探索 ,发现适当的处
理 ,如低温 、无Mg2 +的 Zarrouk培养基培养或 EDTA处
理等 , 均可降低螺旋藻对供体质粒 pEUTISI的降解作
用 , 从而使外源基因的转化障碍得以克服 , 为以后利
用该质粒对螺旋藻的转化奠定基础 。
1 材料与方法
1.1 材料
螺旋藻 (Spirulina platensis) 厦门大学生命科学
学院程兆第教授提供;
质粒 pEUTISI 由本实验室构建;
培养基 Zarrouk medium [4 ] 。
1.2 方法
1.2.1 螺旋藻的培养 在 28℃, 光照强度为
3 000 lx的条件下培养 。
1.2.2 胞内核酸酶活性的检测方法 螺旋藻
胞内核酸酶粗提液的制备:取 4 mL螺旋藻藻液 ,低速
离心 (4 000 r/min , 10 min), 收集 , 用不含 EDTA的
Zarrouk培养基洗涤 2次(以排除胞外酶活性的影响),
重悬藻体于 1mL无 EDTA的 Zarrouk培养基中 , 冰浴
超声波破碎藻体(输出功率 47.5 W ,约 60 s),离心 ,取
上清液备用 。
酶切检测胞内核酸酶活性:取上面制备的螺旋藻
胞内酶粗提液 20μL ,加入 300 ng pEUTISI ,混匀 , 28℃
温浴 2 h后 ,电泳检测 。
1.2.3 抑制螺旋藻胞内核酸酶活性的方法
EDTA处理:取对数生长期的螺旋藻藻液 ,加入 ED-
TA ,使其终浓度分别为 0.5 ,1 ,2 ,5 , 10mmol/L ,正常培养
条件下培养 8 h后 ,按上述方法检测胞内核酸酶活性 。
*国家 863计划资助项目 819-04-03号;福建省自然科学基
金资助项目 B0210001号
第一作者:柯珍恋 , 出生于 1976年 , 硕士生 , 研究方向为植
物生理学。
* *通讯作者:E-mail jzhang@jingxian.xmu.edu.cn
收稿日期:2001_09_24;修回日期:2001-12-28
研究报告 REPORTS
Marine Sciences/Vol.27, No.1/2003 35
无Mg2 +培养基处理:取对数生长期的螺旋藻藻
液 ,低速离心(4 000 r/min , 10min)收集 , 重悬于不含
MgSO4的Zarrouk培养基中 ,分别培养 24 , 48 , 72 h后取
4 mL藻液检测螺旋藻胞内核酸酶活性 。
低温处理:按 10%接种量接种对数生长期的螺
旋藻 3组 , 分别置于 24 , 26 , 28℃培养 , 藻体生长至对
数生长期时检测螺旋藻胞内核酸酶活性 。
2 结果与分析
2.1 螺旋藻胞内核酸酶活性的检测
从图 1可以看出 , 未经任何处理的钝顶螺旋藻胞
内核酸酶粗提液对供体质粒 pEUTISI 有明显的降解
作用 , 如用这样的藻细胞作为受体进行转化 , 外源基
因极易被其核酸酶降解 , 不可能在细胞质中稳定存在
和表达 。早期的实验中 ,用正常培养条件下、未经任何
预处理的螺旋藻作为转化受体材料 ,分别探索了包括
自然转化 、 超声转化和电击转化在内的多种转化方
法 ,都不能获得成功 ,这也说明 ,螺旋藻胞内核酸酶对
供体质粒的降解是螺旋藻难以转入外源基因的一个
重要原因 。除了使用质粒 pEUTISI外 , 作者还使用了
其它几种与 pEUTISI质粒 DNA序列差异显著的质粒
如 pEUTR、pAH 、pKR等作了相同的检测 ,均得到类似
的被降解的结果(数据未列出)。
2.2 EDTA对螺旋藻胞内核酸酶的抑制作用
由于 EDTA是一种很强的金属螯合剂 , 对生物体
内需金属离子的酶(如核酸酶)活性具有普遍的抑制
效应 , 所以本文设计了一组含不同浓度 EDTA的培养
液对螺旋藻进行预处理 。实验结果表明 , 1 mmol/L的
EDTA 处理 16 h就可对螺旋藻的胞内核酸酶活性起
到较强的抑制作用 , 随浓度的增加 EDTA的抑制作用
加强 (图 2A);当 EDTA处理时间延长至 24 h时 , 1
mmol/L以上浓度的 EDTA能完全抑制胞内核酸酶对
质粒的降解作用(图 2B);而 0.5 mmol/L的 EDTA无
论是对螺旋藻处理 16 h还是 24 h均不能抑制其细胞
内核酸酶的活性 。另外 ,在作者的后续实验中发现 ,高
浓度的 EDTA会影响螺旋藻转化后的生长状况 , 使藻
体生长变缓 , 颜色发黄 , 故建议一般不使用过高浓度
的 EDTA处理用于转化的受体螺旋藻 。
2.3 无镁培养基处理对螺旋藻胞内核酸酶
的抑制作用
将正常培养条件下生长到对数期的螺旋藻转入
不含镁的 Zarrouk培养基中继续培养 ,结果发现 ,培养
基中Mg2 +的缺乏 , 使胞内核酸酶对供体 DNA的降解
作用受到明显的影响 。取在此培养基中培养 24 h的
螺旋藻检测其胞内核酸酶活性 , 发现质粒仍被降解;
培养时间延长到 48 h时 , 胞内核酸酶活性降低 , 质粒
降解不完全;培养 72 h后 ,大部分的质粒 DNA没有被
降解 ,仍保持完整 ,说明螺旋藻在无Mg2 +培养 72 h后
其胞内核酸酶的活性已经大大降低(图 3)。
2.4 降低螺旋藻培养温度对胞内核酸酶的
抑制效应
螺旋藻最适培养温度为 28℃, 在低于最适温度
的培养条件下培养后 ,其胞内核酸酶粗提液对质粒的
降解程度有所降低 (图 4), 虽然其抑制效果不显著 ,
但相对于 EDTA和无镁处理 , 降低培养温度是一种较
为温和的作用方式 。后续的观察发现 , EDTA或无镁培
养基处理过度的螺旋藻均在处理后的培养过程中表
现出生长不好的状况 ,严重时藻细胞出现不同程度的
发黄甚至死亡 。而降低培养温度 ,虽然会使螺旋藻的生
长速度减慢 ,但藻的生长状态却没有发生较大的改变。
3 讨论
外源基因是否能导入螺旋藻细胞并在其内稳定
遗传和表达 ,一直是研究者们关注的问题。现在普遍
认为 , 螺旋藻遗传转化之所以难以成功 , 与其胞内高
活性核酸酶有关 。螺旋藻细胞中所含核酸酶包括高活
性的核酸外切酶和种类丰富的限制性内切酶 ,其中已
图 1 螺旋藻胞内核酸酶对转化供体质粒 pEUTISI
的降解作用
Fig.1 Digestion of pEUTISI by endocellular nuclease in
Spirulina platensis
1.质粒 pEUTISI对照 , 28℃温浴 2 h;2.pEUTISI与螺旋藻胞内核
酸酶粗提液混合 , 28℃温浴 2 h。
Lane1:(control)2 μL pEUTISI+18μL ddH 2O;Lane2:2 μL
pEUTISI+18μL endocellular nuclease solution , Both 1 and 2 were incu-
bated at 28℃ for 2 h
研究报告 REPORTS
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图 2 EDTA处理后螺旋藻胞内核酸酶对 pEUTISI的降解作用
Fig.2 Effects of EDTA on the activities of endocellular nuclease in Spirulina platensis(pEUTISI as the substrate)
A.EDTA 处理螺旋藻 16 h后 ,螺旋藻胞内核酸酶对供体质粒 pEUTISI的降解情况;B.EDTA处理螺旋藻 24 h后 ,螺旋藻胞内核酸酶对供
体质粒 pEUTISI的降解情况。
1.pEUTISI;2.正常培养条件下(含 0.2 mmol/L EDTA);3.0.5 mmol/L EDTA处理;4.1 mmol/L EDTA 处理;5.2 mmol/L EDTA处理;
6.5 mmol/L EDTA处理;7.10 mmol/LEDTA处理。
(A)treated for 16 h and (B)treated for 24 h.Lane1:(control)2μl pEUTISI;Lane2～ 7:2μL pEUTISI+18μL endocellular nuclease solution from
Spirulina platensis which have been treated by 0.2 , 0.5 , 1 , 2 ,5 , 10 mmol/L EDTA respectively
图 3 无镁培养后螺旋藻胞内核酸酶对 pEUTISI的降解情况
Fig.3 Effects of Mg2+-f ree medium on the activities of endocullular
nuclease in Spirulina platensis (pEUTISI as the substrate).
1.质粒 pEUTISI对照;2.正常培养条件;3.无镁处理 24 h;4.无
镁处理 48 h;5.无镁处理 72 h
Lane1:(control)2μL pEUTISI;Lane2～ 5:2μL pEUTISI+18μL
endocellular nuclease solution from Spirulina platensis which have been cul-
tured in Mg
2+-free Zarrouk medium for 24 , 48 , 72 h respectively.
图 4 不同温度下螺旋藻胞内核酸酶粗提液对 pEUTISI的
降解情况
Fig.4 Effects of growing temperature on the activities of endocell_
ular nuclease in Spirulina platensis(pEUTISI.as the sub_
strate)
1.质粒 pEUTISI对照;2.24℃培养;3.26℃培养;4.正常培养条
件(28℃).
Lane1:(control)2μL pEUTISI;Lane2～ 4:2μL pEUTISI+18μL
endocellular nuclease solution from Spirulina platensis which have been cul-
tured under 24 , 26 , 28℃ respectively
经得到鉴定的内切酶就有 4种:Spa Ⅰ 、 Spa Ⅱ 、 Spa
Ⅲ 、Spa Ⅳ,它们分别是 Tth111 Ⅰ 、Pva Ⅰ 、Pva Ⅱ 、Hind
Ⅲ的同裂酶 ,在 25～ 37℃均保持较高的内切酶活性 [5 ] 。
这些高活性的核酸酶与螺旋藻细胞防御外源 DNA 入
侵 , 保护自身基因组稳定性密切相关 , 是一种防御性
机制 。但这同时也成为螺旋藻遗传转化的一大障碍 。
为了实现外源基因在螺旋藻细胞中的稳定转化 ,就必
须降低其胞内核酸酶活性 ,为此作者设计了本实验以
便为螺旋藻遗传转化提供相关参数 。
本文的研究表明 ,在没有对螺旋藻藻体进行任何
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处理之前 , 螺旋藻胞内核酸酶粗提液可以迅速地降解
供体质粒 , 这是外源 DNA导入螺旋藻细胞并在其内
稳定遗传和表达的限制因子。Cao等 [2 ]发现用无Mg2 +
的 Zarrouk培养基培养螺旋藻 ,能大大降低其胞内和胞
外DNAase活性 。茅云翔等人用 EDTA预培养的方法显
著抑制了螺旋藻胞内核酸酶活性 , 并通过电激转化法
实现了氯霉素抗性基因在螺旋藻细胞内的表达 [3 ] 。本
文通过对多种处理条件的探索 , 也证明适当的处理 ,
如无Mg2+的 Zarrouk培养基培养、 EDTA或低温预培养
等 , 均可降低螺旋藻对供体质粒的降解作用 , 从而使外
源基因能顺利 、稳定地整合到染色体上(另文发表)。基
因整合平台系统和穿梭质粒系统是在蓝藻基因工程
中应用最多的两类转化系统。在螺旋藻这样高核酸酶
活性的受体细胞中 , 即使对受体藻进行转化前的处理
也只能暂时抑制其胞内核酸酶活性 , 一旦回到正常的
培养条件 , 核酸酶活性不再受抑制而恢复高活性状
态 。即使穿梭质粒能暂时转入到螺旋藻细胞内 , 也将
由于质粒本身的内切酶位点和外源 DNA序列而被螺
旋藻识别降解 , 不可能稳定传代;并且在螺旋藻细胞
中也未发现有内源质粒的存在 , 因此 , 在螺旋藻遗传转
化中不宜采用穿梭质粒载体系统 。而依据同源重组机
制 , 将外源基因整合到螺旋藻染色体上 , 是使外源基因
在螺旋藻细胞中稳定遗传和表达的最好方式 。综上所
述 , 在外源基因转化螺旋藻的研究中建议采用基因整
合平台系统 , 并在转化前后进行适当物理或化学处
理 。根据作者的实验结果 ,在转化前 72 h开始低温 、无
Mg
2 +培养 , 转化前 16 h提高培养基中 EDTA的浓度至
2mmol/L , 就能获得胞内核酸酶活性极低的受体藻 ,
从而有利于外源基因的转化 。
参考文献
1 徐虹 ,柯珍恋 ,章军.螺旋藻的系统分类学及基因工程
研究进展 .海洋科学 , 2001 , 25(9):14-19
2 Cao J , Xu Z , Qiu G , et al.Effects of Mg2+ on the growth
and Dnase activi ty of Spirulina platensis , a cyanobacterium.
Bioresource Technol , 1999, 67(3):287-290
3 茅云翔 ,王高歌 ,张宝红 ,等 .建立螺旋藻转基因体系初
报 .青岛海洋大学学报 , 2000 , 30(2):13-18
4 Vonshak A , Appendix.In:Spirulina platensis(Arthrospira):
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USA , 1997 , 205-212
5 Tragut V , Xiao J , Bulina EJ , et al.Characterization of DNA
restriction-modification systems in Spirulina platensis strain
pacifica.Journal of Applied Phycology , 1995(7):561-564
REPRESSION OF ENDOCELLULAR NUCLEASE ACTIVITY
IN Spirulina platensis
KE Zhen-Lian XUHong ZHANG Jun
(The Key Laboratory of Ministry of Education for Cell Biology and Tumor Cell Engineering , School of Life Science , Xiamen
University , Xiamen , 361005)
Received:Sept., 24, 2001
Key Words:Spirulina platensis , Endocellular nuclease activity , EDTA treatment , Mg2+-free medium, Lower temperature culture
Abstract
The high-activity endocellular nuclease of Spirulina platensis is believed to be the most serious barrier to foreign gene
transformation.We detected the status of plasmid pEUTISI after incubation with endocellular nuclease extract from Spir-
ulina platensis.Results showed that the activity of endocellular nuclease could be efficiently repressed when the Spirulina
platensis was cultured in the medium of EDTA at the concentration of 2 mmol/L above 16 hours , or cultured in Mg2 +-free
medium for more than 72 hours.When the Spirulina platensis was cultured in lower temperature , such as 24℃, the enzyme
activity also showed a little decrease.By these results , it suggests that Spirulina platensis be cultured in Mg2 +-free medium
at 24℃ for 72 hours , and improve the EDTA concentration to 2 mmol/L for 16 hours ahead of transformation.Then the
strain of Spirulina platensis contained low activity of endocellular nuclease , which were suitable for transformation , could be
obtained. (本文编辑:张培新)
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