全 文 ：收稿日期:2006-03-29;修订日期:2006-12-20
基金项目:安徽省自然科学基金项目(99042130)资助
作者简介:胡晓倩(1972—),女;硕士 ,讲师;研究方向为生物化学和微生物生理。E-mail:hxq@hsu.edu.cn
通讯作者:唐欣昀 ,教授 ,硕导;E-mail:tangxinyun@21cn.com
抑制螺旋藻胞内核酸酶酶活的研究
胡晓倩1 ,2　唐欣昀1
(1.安徽农业大学生命科学学院 ,合肥　230036;2.黄山学院生物系 ,黄山　245041)
摘要:有效抑制胞内核酸酶的活性对提高外源 DNA导入和稳定表达具有重要作用 , 本文通过对钝顶螺旋藻 A9、抗
刀豆氨酸(CS)突变株 A9c、藻体长直型 A9L这 3种藻株胞内核酸酶活性的研究发现 ,在培养液中添加 EDTA或不同
温度不同时间处理藻丝体 ,都能明显抑制 3 种藻株胞内核酸酶的活性 , 并对合适的 EDTA浓度 、合适的处理温度和
时间进行了探讨。
关键词:抑制;螺旋藻;胞内核酸酶;酶活;EDTA
中图分类号:Q933　　文献标识码:A 　　文章编号:1000-3207(2007)03-0419-06
　　螺旋藻营养丰富 ,是很理想的外源基因表达受
体。外源基因能否在螺旋藻细胞内稳定遗传和表
达 ,取决于稳定的转化方法和 DNA重组系统。螺旋
藻具有较强活性的胞内核酸酶 ,这是螺旋藻基因转
化的一个重要障碍 ,所以到目前为止还没有建立稳
定的转化方法。为了建立螺旋藻稳定的遗传转化体
系 ,提高外源 DNA 导入和稳定表达的效率 ,必须有
效抑制胞内核酸酶的活性 ,这不仅对螺旋藻本身而
且对其他微藻的基因工程研究都具有重要的理论和
实际意义。目前在 DNA 提取实验中通过缓冲液中
的EDTA抑制 DNase 活性而保护 DNA;李文蓉[ 1] 等
人报道了 EDTA 对绵羊精清中脱氧核糖核酸酶的抑
制作用;茅云翔[ 2]和柯珍恋[ 3]等人用 EDTA 预培养
的方法显著抑制了螺旋藻不同品系藻株的胞内核酸
酶活性。本实验发现不仅用合适浓度 EDTA预培养
的方法 、而且用不同温度不同时间处理藻丝体的方
法 ,均可降低螺旋藻胞内核酸酶的活性 ,为螺旋藻的
遗传转化奠定基础。
1　材料与方法
1.1　材料 　无菌钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)品
系 A9 藻株 、突变型抗刀 豆氨酸(L-canavanine
sμLphate ,CS)A9c 藻株 、A9L(藻体长直型)藻株均由
安徽农业大学生命科学院微生物实验室分离纯化 。
接种培养 10d左右在对数生长中期时用于实验。培
养条件:温度 28 ±2℃, 3000lx , Zarrouk 培养基溶
液[ 4]所需试剂及电泳缓冲液所需试剂均为国产分析
纯;λ-DNA 、λ-DNA的Marker 、琼脂糖均为大连宝生物
工程有限公司产品;质粒 8760(p8760)由吴龙飞博士
惠赠。
1.2　EDTA处理藻株胞内核酸酶粗提液的提取　
在对数生长期用于实验的前两天 ,向 50mL 螺旋藻
A9 培养液补加 EDTA(pH8.0)至终浓度分别为
2mmol/L、4mmol/L、6mmol/L 、8mmol/L 、10mmol/L ,以
不加 EDTA为对照 ,再培养 2d ,参考柯珍恋[ 3]等和王
高歌[ 5] 等人的方法:取各藻株对数生长期的藻液
1.5mL ,6000r/min离心 5min ,再重复一次后收集藻
丝;用不含 EDTA 的 Zarrouk 培养基洗涤藻丝 2 次
(以排除胞外酶活性的影响),再用含 1.5mol/L NaCl
的 Zarrouk培养基清洗一次 ,最后用无菌蒸馏水清洗
一次;将藻丝体置于超低温冷藏柜中反复冻融 ,镜检
确定细胞破裂率达 98%以上 ,6000r/min离心30s ,取
上清液的无细胞溶液作为螺旋藻胞内核酸酶的粗提
液 ,冷藏备用 。
1.3　不同温度不同时间处理藻株胞内核酸酶粗提
液的提取　取对数生长中期的螺旋藻培养液 6mL ,
6000r/min 离心 5min ,弃上清液 , 用不含 EDTA 的
Zarrouk培养基清洗藻丝 2 次(以排除胞外核酸酶
活性的影响),再用 1.5mL 不含 EDTA 的 Zarrouk培
养基悬浮藻丝体 , 置于 45℃、50℃、55℃、60℃、
第 31卷 第 3 期 水 生 生 物 学 报 Vol.31 , No .3
2 0 0 7 年 5 月 ACTA HYDROBIOLOGICA SINICA May , 2 0 0 7　
65℃恒温水浴 , 每一温度分别设置 5min 、10min 、
15min 3个处理。然后参照 1.2的方法制备胞内核
酸酶的粗提液 。
1.4　不同方法处理后的藻株胞内核酸酶酶活研
究　取不同方法处理后的藻株胞内核酸酶的粗提
液 ,分别与λ-DNA或 p8760进行酶切消化后 ,琼脂糖
凝胶电泳研究酶活 。琼脂糖浓度 0.9%,电泳缓冲
液TAE ,处理点样量为 8μL ,作为对照的λ-DNA点样
量为 1μL ,作为对照的 p8760点样量为 2μL ,λ-DNA的
Marker 点样量为 5μL。每次点样前将 λ-DNA 的
Marker在 60℃水浴中处理 5min ,确保标记电泳条带
清晰 。电泳条件:电压 80V ,电泳 70—80min[ 6] 。
2　实验结果与分析
2.1　EDTA对 A9藻株胞内核酸酶活性的影响
从图 1可以看出:EDTA处理 2d后 ,当 EDTA 浓
度为 2mmol/L时 ,A9藻株的胞内核酸酶活性开始被
抑制;随着 EDTA 浓度分别为 4mmol/L、6mmol/L 、
8mmol/L、10mmol/L时 ,该藻株胞内核酸酶活性被明
显地抑制;当 EDTA 浓度为 10mmol/L 时 ,该藻株胞
内核酸酶活性被抑制得最完全;不加 EDTA的 A9藻
株的胞内核酸酶 ,在酶切 3h以上把 p8760几乎全部
降解 。
图 1　EDTA 对A9藻株胞内核酸酶活性的抑制
Fig.1　Inhibition of EDTA on intracellular nuclease of A9 strain
1Marker;2.p8760;3—8.分别用 0 、2 、4 、6 、8 、10mmol/ L EDTA的酶
提取液 37℃酶切 p8760 3.5h
1:Marker;2.p8760;3—8.Enzyme extract adding 0 , 2 , 4 , 6 , 8 , 10mmol/
L EDTA enzymolyzed p8760 for 3.5h
2.2　EDTA对 A9c藻株胞内核酸酶活性的影响
从图 2可以看出:EDTA处理 2d后 ,当 EDTA 浓
度为 2mmol/L时 ,A9c 藻株的胞内核酸酶活性开始
被抑制 ,随着 EDTA 浓度分别为 4mmol/L、6mmol/L 、
8mmol/L、10mmol/L时 ,该藻株胞内核酸酶活性被抑
制 ,但抑制作用不能得到加强;对照不加 EDTA 的
A9c藻株的胞内核酸酶 ,在酶切 3h 时对 p8760有酶
切作用 。
图 2　EDTA对A9c藻株胞内核酸酶活性的抑制(37℃, 3h)
Fig.2　Inhibition of EDTA on intracellμlar nuclease of A9c strain
1.Marker;2.p8760;3—8.分别用 0 、2 、4 、6 、8 、10mmol/ L EDTA的
酶提取液 37℃酶切 p8760 3h(图 3同)1.Marker;2.p8760;3—
8.Enzyme extract adding 0 , 2 , 4 , 6, 8 , 10 mmol/ L EDTA enzymolyzed
p8760 for 3h(the same as Fig.3)
2.3　EDTA对 A9L藻株胞内核酸酶活性的影响
从图3可以看出:EDTA处理 2d 后 ,当 EDTA浓
度为 2mmol/L 时 ,A9L 藻株的胞内核酸酶活性开始
被明显抑制;随着 EDTA 浓度分别为 4mmol/L、
6mmol/L 、8mmol/L 、10mmol/L的升高 , A9L藻株胞内
核酸酶活性被抑制逐渐增强;当 EDTA 浓度为
10mmol/L时 ,A9L 藻株胞内核酸酶活性被抑制最明
显;不加 EDTA的A9L藻株的胞内核酸酶 ,在酶切3h
以上把 p8760几乎全部降解。
2.4　不同温度不同时间处理对 A9藻株胞内核酸酶
活性的影响
图 3　EDTA对 A9L藻株胞内核酸酶活性的抑制
Fig.3　Inhibition of EDTA on intracellular nuclease of A9L strain
从图 4可以看出:在 45℃条件下处理藻丝体
5min 、10min ,对A9藻株胞内核酸酶的活性无影响 ,
可以把 p8760全部降解;当处理时间延长至 15min
时 ,A9藻株胞内核酸酶的活性开始被抑制;50℃处
理藻丝体 5—10min 时 ,A9藻株胞内核酸酶的活性
420　 水　　生　　生　　物　　学　　报 31卷
被抑制但很弱 ,可以把 p8760大部分降解;50℃处
理藻丝体 15min 和 55℃处理藻丝体 5 —15min 时 ,
A9藻株胞内核酸酶的活性被较明显地抑制;当温
度在 60℃、65℃时处理藻丝体 , A9 藻株胞内核酸
酶的活性就被很明显地抑制 。在 45℃和 50℃下处
理时间的长短对 A9 藻株胞内核酸酶活性有显著
影响 ,而当温度≥55℃时 ,处理时间的长短不再是
影响 A9藻株胞内核酸酶活性的主要因素 。对于
A9藻株 , 45℃是一个既不影响其生理活性又能明
显使其胞内核酸酶失活的最适宜温度 。在实验中
发现 , 45℃、50℃处理 5—15min 和 55℃处理 5min
后 ,提取的藻丝体的颜色呈现对数生长中期正常
的蓝绿色 ,但 45℃处理 5 —10min 其胞内核酸酶的
活性不能被抑制 ,而 45℃处理 15min 或 50℃处理
5min ,其胞内核酸酶活性被抑制但不会导致细胞
死亡。
图 4　温度对 A9藻株胞内核酸酶活性的抑制
Fig.4　Inhibition of temperature on intracellular nuclease of A9 strain
1.Marker;2.19.p8760;3.37℃酶切 p8760 3h;4—6.45℃处理 5min 、10min 、15min后 37℃酶切 p8760 3h;7—9.50℃处理 5min 、10min 、15min后
37℃酶切 p8760 3h;10—12.55℃处理 5min 、10min 、15min后 37℃酶切 p8760 3h;13—15.60℃处理 5min 、10min 、15min后 37℃酶切 p87603h;16—
18.65℃处理 5min 、10min 、15min后 37℃酶切 p8760 3h
1.Marker;2.19.p8760;3.Enzyme extract enzymolyzed p8760 for 3h at 37℃;4—6.Enzyme extract dealing with the filament for 5 min , 10min, 15min at
45℃ enzymolyzed p8760 for 3h at 37℃;7—9.Enzyme extract dealing with the f ilament for 5min , 10min , 15min at 50℃enzymolyzed p8760 for 3h at 37℃;
10—12.Enzyme extract dealing with the filament for 5min , 10min , 15min , at 55℃ enzymolyzed p8760 for 3h at 37℃;13—15.Enzyme extract dealing with
the f ilament for 5min , 10min , 15min at 60℃ enzymolyzed p8760 for 3h at 37℃;16—18.Enzyme extract dealing with the filament for 5min , 10min , 15min at
65℃ enzymolyzed p8760 for 3h at 37℃
2.5　不同温度不同时间处理对 A9c 藻株胞内核酸
酶活性的影响
从图 5 可以看出:在 45℃条件下处理藻丝体
5min 、10min对 A9c藻株胞内核酸酶的活性基本无影
响 ,与未进行温度处理状态下的A9c藻株胞内核酸
酶的活性相当 ,可将λ-DNA 酶切降解;当处理时间
延长至 15min时 ,A9c 藻株胞内核酸酶的活性开始
被抑制;50℃处理藻丝体 5—15min时 ,A9c藻株胞内
核酸酶的活性被抑制但不是很明显;55℃处理藻丝
体10min时 ,A9c藻株胞内核酸酶的活性开始被非常
明显地抑制 ,随温度的升高抑制作用越明显;当温度
在60℃、65℃时处理藻丝体即使 5min ,A9c 藻株胞内
核酸酶的活性就被非常明显地抑制。在45℃和 55℃
时 ,处理时间的长短对 A9c藻株胞内核酸酶活性有显
著影响;而当温度≥60℃,处理时间的长短不再是影
响A9c藻株胞内核酸酶活性的主要因素。
2.6　不同温度不同时间处理对 A9L藻株胞内核酸
酶活性的影响
从图 6 可以看出:在 45℃条件下处理藻丝体
5—15min ,对A9L 藻株胞内核酸酶的活性有促进作
用 ,与未进行温度处理状态下的 A9L 藻株胞内核酸
酶的活性相比 ,对λ-DNA 酶切降解更完全;50℃处
理藻丝体5min时 ,A9L藻株胞内核酸酶的活性开始
被抑制但不是很明显;随温度的升高抑制作用越明
3期 胡晓倩等:抑制螺旋藻胞内核酸酶酶活的研究 421　
显 ,当温度在 60℃、65℃时处理藻丝体即使 5min ,
A9L藻株胞内核酸酶的活性就被明显地抑制。当温
度≥60℃时 ,处理时间的长短不再是影响 A9L 藻株
胞内核酸酶活性的主要因素 。
图 5　温度对 A9c藻株胞内核酸酶活性的抑制
Fig.5　Inhibition of temperature on intracel lular nuclease of A9c st rain
1.Marker;2.λ-DNA;3.37℃酶切λ-DNA 3h;4—6.45℃处理 5min、10min 、15min后 37℃酶切λ-DNA 3h;7—9.50℃处理 5min 、10min 、15min后
37℃酶切λ-DNA 3h;10—12.55℃处理 5min 、10min、15min后 37℃酶切λ-DNA 3h;13—15.60℃处理 5min 、10min 、15min后 37℃酶切λ-DNA 3h;
16—18.65℃处理 5min、10min 、15min后 37℃酶切λ-DNA 3h(图 6同)
1.Marker;2.λ-DNA;3.Enzyme extract enzymolyzedλ-DNA for 3h at 37℃;4—6.Enzyme extract dealing with the fi lament for 5min , 10min , 15min at 45℃
enzymolyzedλ-DNA for 3h at 37℃;7—9.Enzyme extract dealing with the filament for 5min , 10min, 15min at 50℃ enzymolyzedλ-DNA for 3h at 37℃;10—
12.Enzyme extract dealing with the filament for 5min , 10min , 15min at 55℃ enzymolyzedλ-DNA for 3h at 37℃;13—15.Enzyme ext ract dealing with the f ila-
ment for 5min, 10min ,15min at 60℃ enzymolyzedλ-DNA for 3h at 37℃;16—18.Enzyme extract dealing with the filament for 5min , 10min , 15min at 65℃
enzymolyzedλ-DNA for 3h at 37℃(the same as Fig.6)
图 6　温度对 A9L藻株胞内核酸酶活性的抑制
Fig.6　Inhibition of temperature on int racellular nuclease of A9L st rain
1.Marker;2.λ-DNA;3.37℃酶切λ-DNA 3h;4—6.45℃处理 5min 、10min 、15min后 37℃酶切λ-DNA 3h;7—9.50℃处理 5min 、10min 、15min后
37℃酶切λ-DNA 3h;10—12.55℃处理 5min 、10min 、15min后 37℃酶切λ-DNA 3h;13—15.60℃处理 5min 、10min 、15min后 37℃酶切λ-DNA 3h;
16—18.65℃处理 5min 、10min 、15min后 37℃酶切λ-DNA 3h
1.Marker;2.λ-DNA;3.Enzyme extract enzymolyzedλ-DNA for 3h at 37℃;4—6.Enzyme extract dealing with the fi lament for 5min , 10min , 15min at 45℃
enzymolyzedλ-DNA for 3h at 37℃;7—9.Enzyme extract dealing with the filament for 5min , 10min , 15min at 50℃ enzymolyzedλ-DNA for 3h at 37℃;
10—12.Enzyme extract dealing with the filament for 5min , 10min , 15min at 55℃ enzymolyzedλ-DNA for 3h at 37℃;13—15.Enzyme extract dealing with
the f ilament for 5min ,10min ,15min at 60℃ enzymolyzedλ-DNA for 3h at 37℃;16—18.Enzyme extract dealing with the filament for 5min , 10min , 15min at
65℃ enzymolyzedλ-DNA for 3h at 37℃
422　 水　　生　　生　　物　　学　　报 31卷
3　讨　论
3.1　EDTA对 3种藻株胞内核酸酶酶活的影响
EDTA是一种很强的金属螯合剂 ,能螯合培养
液中的微量元素供藻细胞正常生长需要 ,所以藻细
胞在没有 EDTA时几乎不生长[ 7] ;但高浓度的 EDTA
会影响螺旋藻转化后的生长状况[ 8] 。在实验中发现
EDTA在培养液中的终浓度不能过高 ,过高会导致
藻细胞不能正常生长甚至死亡 ,藻丝体呈现衰败的
草黄绿色 。核酸酶降解核酸发挥酶活时需要有一定
的金属离子作辅基 ,而 EDTA 通过螯合二价离子特
别是Mg2+ 、Ca2+ ,可以抑制大多数依赖二价离子尤
其是 Mg2+的核酸酶的活性。所以用 EDTA 来抑制
螺旋藻胞内核酸酶的活性 ,最重要的是要选择合适
浓度的 EDTA 来处理藻丝体 ,达到既能抑制胞内核
酸酶活性又不影响藻丝体的生长和活性 。
对于实验用 3种藻株 , 2mmol/L EDTA 的浓度是
一个既不影响其生理活性又能明显抑制其胞内核酸
酶活性的最适宜浓度。在实验中发现 ,加入 EDTA
后再培养 2d ,当 EDTA 浓度分别为 6mmol/L、8mmol/
L 和 10mmol/L时 ,培养液中藻丝体的颜色呈现对数
生长后期的草黄绿色 ,说明此时螺旋藻部分细胞已
不能正常生长或生长缓慢;而当 EDTA 浓度为
2mmol/L 、4mmol/L 时 ,其培养液中藻丝体的颜色呈
现对数生长中期正常的蓝绿色 ,但为了保证受体螺
旋藻转化后的正常生长 , 一般不使用较高浓度的
EDTA处理要用于转化的螺旋藻[ 3] 。对于螺旋藻 S9
和F3-3品系藻株 ,2mmol/L EDTA是最适宜浓度[ 5] ;对
于S6-11品系藻株 , 10mmol/L EDTA 仍然不能抑制其
胞内核酸酶的活性[ 5] ;可见不同品系的藻株需要不
同浓度的 EDTA来抑制其胞内核酸酶的活性 。
3.2　不同温度不同时间处理对 3种藻株胞内核酸
酶酶活的影响
一般生物体内的活性酶的反应温度在 28—
37℃,低温时酶的活性还存在但会受到抑制 ,柯珍恋
等人[ 3]实验发现低于 28℃培养可降低螺旋藻胞内
核酸酶活性。
在温度处理中 ,适合的温度和合适的处理时间
是主要因素。在本实验中 ,对于A9藻株 、A9c 藻株 ,
45℃处理 15min是一个既不影响其生理活性又能明
显使其胞内核酸酶失活的最适宜温度和时间 ,此时
提取的藻丝体的颜色呈现正常的蓝绿色;对于 A9L
藻株 ,50℃处理藻丝体 5min是一个既不影响其生理
活性又能明显使其胞内核酸酶失活的最适宜温度和
时间 ,此时提取的藻丝体的颜色呈现对数生长中期
正常的蓝绿色;对于 3种藻株 60℃、65℃处理 5min
后 ,提取的藻丝体的颜色都呈现对数生长后期衰败
的草黄绿色 ,这可能是因为高温不仅使胞内核酸酶
失活而且使藻丝体的部分细胞死亡 。对于螺旋藻
S6-4品系藻株 ,温度要高达 65℃才没有胞内核酸酶
的活性但此温度会导致螺旋藻细胞死亡[ 5] 。可见不
同品系的藻株需要不同的最适温度和最适时间来抑
制其胞内核酸酶的活性 。
螺旋藻具有胞外和胞内核酸酶 ,相对于胞外核
酸酶 ,胞内核酸酶活性很强 ,能迅速降解外源 DNA ,
这是导致遗传转化失败的最重要原因[ 5] 。Cao 等[ 9]
发现用无Mg2+的 Zarrouk培养基培养螺旋藻 ,能大
大降低其胞内和胞外 DNAase活性;茅云翔等人[ 2]用
EDTA预培养的方法显著抑制了螺旋藻胞内核酸酶
活性 ,并通过电激转化法实现了氯霉素抗性基因在
螺旋藻细胞内的表达;从本实验数据可以初步看出 ,
未做任何处理的实验用 3种藻株胞内核酸酶粗提液
可以迅速地酶切λ—DNA和质粒 8760 ,这是将外源
DNA 导入螺旋藻细胞并稳定遗传和表达的限制因
子;如采用2mmol/L EDTA可明显地抑制3种藻株胞
内核酸酶的活性;或 45℃处理 15min可抑制 A9藻
株 、A9c 藻株胞内核酸酶的活性 、50℃处理 5min 可
抑制 A9L 藻株胞内核酸酶的活性 ,从而有利于外源
基因在其细胞内的转化和整合表达。
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RESEARCH ON INHIBITING INTRACELLULAR NUCLEASE ACTIVITY IN
SPIRULINA PLATENSIS
HU Xiao-Qian1 , 2 , TANG Xin-Yun1
(1.Life SciencesSchool of AnHui Agricultural University , Hefei　230036;2.Biology Department of HuangshanUniversity , Huangshan　245041)
Abstract:Effectively inhibiting intracellular nuclease activity plays a key role in the enhancement of integrating exogenous
DNA and stable expression.By research on intracellular nuclease activity in three strains , that is , A9 strain , A9c strain
(mutant anti-L-canavanine sulphate)and A9L strain(elongated strain), it was found that intracellular nuclease activity
could be inhibited by adding ethylene diamine tetraacetic acid in the culture media or being treated for variant timing at
variant temperature , but proper consistency of ethylene diamine tetraacetic acid and appropriate temperature and time
were key factors to keep the three strains being normal physiological status.The intracellular nuclease activity in A9
strain and A9c strain was obviously inhibited with 2mmol/L EDTA or with the treatment for the filament at 45℃ for 15
min.With this treatment A9 and A9c filament appeared to be in normal physiological state.As for A9L strain , 2mmol/
L EDTA or dealing with filament at 50℃ for 5 min obviously inhibited the intracellular nuclease activity , and the treat-
ment could let the filament still in its normal physiological state.By the fundamental and comparative study of the intra-
cellular nuclease activity in different strains , we could come to the conclusion that S .platensis A9 strain , A9c strain and
A9L strain may be served as receptors for genetic transformation , some proper methods could be used to inhibit the intra-
cellular nuclease activity , and the technique might help the integration and expression of the exogenous gene in Spirulina.
Key words:Inhibit;Spirulina platensis;Intracellular nuclease;Enzyme activity;Ethylene diamine tetraacetic acid
424　 水　　生　　生　　物　　学　　报 31卷