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基于红外指纹图谱的螺旋藻品质分析和蛋白含量测定



全 文 :第3 3卷,第4期             光 谱 学 与 光 谱 分 析 Vol.33,No.4,pp977-981
2 0 1 3年4月             Spectroscopy and Spectral Analysis  April,2013  
基于红外指纹图谱的螺旋藻品质分析和蛋白含量测定
刘海静1,2,许长华3,李伟明1,2,王 锋1,2,周 群3
李 安1,2,赵月亮1,2,哈益明1,2*,孙素琴3*
1.中国农业科学院农产品加工研究所,北京 100193             
2.农业部农产品加工综合重点实验室,北京 100193
3.清华大学化学系生命有机磷化学及化学生物学教育部重点实验室,北京 100084
摘 要 采用傅里叶变换红外光谱(FTIR)分析技术,对螺旋藻标准品、螺旋藻粉样品和糊精标准品的红外
光谱进行分析。螺旋藻中的蛋白质(1 657,1 537cm-1)和糖类(1 069,1 054cm-1)具有明显的红外指纹特
征。螺旋藻粉中的主要成分为蛋白质和糖类,主要辅料为糊精。比较28个不同厂家螺旋藻粉的红外指纹图
谱,计算图谱相关系数确定出辅料添加比例的高低。建立吸收峰强度比和蛋白质含量的关联标准曲线,形成
依据红外光谱测定样品蛋白含量的方法,与凯氏定氮法测定结果相对偏差小于5%,为螺旋藻粉品质鉴定提
供了一种简便、快速、无损的新方法。
关键词 红外光谱;螺旋藻;蛋白质;指纹图谱
中图分类号:O657.3  文献标识码:A   DOI:10.3964/j.issn.1000-0593(2013)04-0977-05
 收稿日期:2012-07-23,修订日期:2012-10-30
 基金项目:国家自然科学基金项目(21075076)资助
 作者简介:刘海静,1986年生,中国农业科学院农产品加工研究所硕士研究生  e-mail:liuhaijing09@163.com
*通讯联系人  e-mail:hayiming@sina.com;sunsq@tsinghua.edu.cn
引 言
  螺旋藻(spirulina)系蓝藻门(cyanophyta)颤藻目(osciua-
torialse)颤藻科(oscilatoriaceae)的螺旋藻属(spirulina)。目
前市场上销售的食品级螺旋藻主要为顿顶螺旋藻(splaten-
sis)。螺旋藻所含蛋白质的品质优良,包含人体全部必须氨
基酸,一直深受食品和医药研究领域的关注。目前螺旋藻已
经成为一种普遍的保健类食品[1]。按国家标准蛋白质含量是
螺旋藻粉等级的主要指标,螺旋藻蛋白水解物具有缓解高血
压、抗肿瘤的功能特性[2-4]。螺旋藻多糖能够促进细胞生长、
提高免疫力、抗肿瘤、抗衰老,对核酸内切酶活性和DNA修
复合成有增强作用,是螺旋藻主要的天然活性物质[5]。
傅里叶变换红外光谱(FTIR)法具有宏观整体鉴定复杂
体系以及无损、简便、快速等特点[6,7],是鉴定未知混合物
化学组成和化学结构的有效方法之一[6]。红外指纹图谱已经
广泛应用到食品领域的品质监控[8,9]。虽然国家标准对螺旋
藻培养条件、产品的理化指标、包装等方面做出规定,但是
具体的品质检测方法仍依靠传统的感官评价和理化检测[10]。
感官评价具有很强的主观性,而一些理化指标的测定费时费
力。
螺旋藻类保健品深受消费者的喜爱,但是缺少一种快速
鉴别其品质的有效方法,尚未形成检测保健品中螺旋藻确切
含量的具体方法。本研究一方面通过螺旋藻粉的红外光谱指
纹图谱,确定其主要营养成分及相对含量,分析鉴定出螺旋
藻粉生产过程中添加的辅料类型;另一方面测定不同螺旋藻
粉样品中蛋白质的含量,建立蛋白质含量与红外吸收峰强度
比之间的关联标准曲线。通过未知样品的红外吸收光谱与标
准曲线,即可以求得样品蛋白质的含量,形成应用傅里叶变
换红外光谱快速评价螺旋藻粉品质的有效方法。
1 实验部分
1.1 材料
螺旋藻标准品由清华大学环境生物研究所提供,经分
离、干燥制备成粉末状待用。螺旋藻粉样品购自不同的生产
厂家,均为食品级螺旋藻粉。糊精标准品由河南宣源化工有
限公司生产,纯度99%。
1.2 仪器与试剂
仪器:红外光谱仪为Perkin Elmer公司的Spectrum GX
FTIR光谱仪。采用 DTGS检测器,光谱分辨率为4cm-1,
测量范围为4 000~400cm-1,扫描次数为32次。试剂:溴
化钾(KBr),纯度99.9%。
1.3 数据处理
FTIR光谱测定:将溴化钾和待测样品研磨成细粉,以
适当比例混合,采用压片法测定。样品蛋白质含量采用凯氏
定氮法测定,参照GB/T5511-2008。
采用Perkin-Elmer公司Spectrum V3.02操作软件进行
数据采集和图谱预处理,预处理过程包括基线校正和归一化
处理。
2 结果与讨论
2.1 螺旋藻红外吸收指纹图谱
红外光谱是分子振动能级的吸收光谱,任何官能团都有
红外吸收,因此红外光谱可以反映样品化学成分的综合信
息,确定样品的主体成分。螺旋藻标准品的红外吸收谱图如
图1所示。
Fig.1 FTIR spectra of spirulina(4 000~400cm-1)
Fig.2 Second derivative infrared spectra of
spirulina(1 800~1 400cm-1)
  图1表明,螺旋藻中存在两类主要成分,即蛋白质和糖
类。其中1 657和1 537cm-1为蛋白质的特征吸收峰,1 657
cm-1为酰胺Ⅰ带吸收峰,主要是 C O 伸缩振动;1 537
cm-1为酰胺Ⅱ带吸收峰,氨基酸中N—H弯曲振动(60%)和
多肽链、碳骨架中的C—N伸缩振动(40%)。1 069和1 054
cm-1是糖类物质的C—O伸缩振动吸收峰。多糖分子中存在
多个C—OH基团,因此在1 100~1 000cm-1之间出现多个
C—O伸缩振动吸收峰。由于螺旋藻所含脂类成分少,所以
代表脂类物质的羰基 C O 伸缩振动吸收峰在红外光谱中
不明显。二阶导数红外光谱可以提高谱图的分辨率,并将一
维光谱中重叠的特征峰分开。脂羰基 C O 在二阶导数谱
中特征吸收峰为1 742cm-1,如图2所示。酰胺Ⅰ带吸收峰
为全谱最强峰,代表糖类结构的C—O振动吸收峰的强度明
显弱于酰胺Ⅰ带和酰胺Ⅱ带吸收峰强度,因此螺旋藻中的蛋
白质含量最高,其次是糖类[11]。表1为螺旋藻各吸收峰官能
团振动方式及主要归属。
Table 1 Main absorption peaks and attribution of spirulina
波数/cm-1 基团 振动方式 归属
2 925 次甲基 反对称伸缩 脂类
2 873 甲基 对称伸缩 蛋白质
2 853 次甲基 对称伸缩 脂类
1 742 羰基 伸缩 脂类
1 657 羰基 伸缩 蛋白质(酰胺Ⅰ带)
1 537 N—H 面内弯曲 蛋白质(酰胺Ⅱ带)
1 454 甲基 面外弯曲 蛋白质、脂类、糖
1 239 C—O 伸缩 蛋白质、脂肪酸
1 069,1 054 C—O 伸缩 糖
1 000~800 糖环 环振动 糖
2.2 螺旋藻标准品与螺旋藻粉样品、糊精标准品图谱比较
辅料的加入会影响螺旋藻的红外吸收指纹图谱。螺旋藻
标准品、螺旋藻粉样品和糊精标准品的红外吸收谱图如图3
所示:螺旋藻粉样品的主要红外特征吸收峰与螺旋藻标准品
的特征吸收峰相似,螺旋藻粉的蛋白质特征吸收峰为1 659
和1 537cm-1。1 659cm-1为全谱的最强吸收峰,说明蛋白
质是螺旋藻粉的主体成分。螺旋藻粉与螺旋藻标准品的糖类
特征吸收峰区别较大,螺旋藻粉的糖类特征吸收峰为1 154,
1 080和1 040cm-1,而螺旋藻标准品的糖类特征吸收峰为
1 069和1 054cm-1,这些差异说明螺旋藻粉样品与螺旋藻
标准品中的糖类不完全相同。糊精的糖类吸收峰为1 157,
Fig.3 FTIR spectra of spirulina a,spirulina
powder band dextrin standard c
879 光谱学与光谱分析                    第33卷
1 079和1 016cm-1。由于糊精的加入,螺旋藻粉样品中吸收
峰1 154cm-1增强,而原螺旋藻标准品中1 069和1 054
cm-1特征吸收峰在糊精吸收峰的叠加作用下位移到1 080和
1 040cm-1。
  螺旋藻标准品中蛋白质与糖类吸收峰的强度比明显高于
螺旋藻粉样品中二者的比值,这说明螺旋藻粉中蛋白质含量
低于螺旋藻标准品中蛋白质含量。辅料的加入降低了螺旋藻
粉中蛋白质的相对含量。糊精的加入使糖类物质吸收峰位置
和强度发生改变。因此,通过分析与比对螺旋藻标准品、螺
旋藻粉样品和糊精标准品的红外光谱图,可以说明螺旋藻粉
中的主要辅料为糊精,且辅料的用量直接影响到蛋白质所占
比例。
2.3 不同厂家螺旋藻粉的红外吸收光谱图与糊精标准谱图
比较
比较不同螺旋藻粉样品和糊精标准品的红外指纹图谱可
以确定辅料用量。三个不同厂家的螺旋藻粉样品和糊精标准
品的红外吸收光谱如图4所示。
Fig.4 FTIR spectra of different spirulina powder and
dextrin standard(4 000~400cm-1)
Table 2 Comparion between FTIR spectra of spirulina
power and dextrin standard
样品 相关系数 样品 相关系数
1  0.929 6  15  0.783 8
2  0.932 4  16  0.833 0
3  0.933 3  17  0.692 5
4  0.921 2  18  0.832 7
5  0.894 6  19  0.743 7
6  0.841 9  20  0.692 7
7  0.841 2  21  0.769 7
8  0.728 9  22  0.785 5
9  0.629 4  23  0.734 4
10  0.703 0  24  0.687 7
11  0.854 0  25  0.772 7
12  0.770 7  26  0.792 1
13  0.770 6  27  0.596 0
14  0.829 9  28  0.730 7
  Note:the comparion range is 1 200~800cm-1
  图4中a为糊精标准品,b—d分别为不同厂家的螺旋藻
粉样品的红外吸收光谱图。比较不同厂家螺旋藻粉与糊精标
准品的谱图,发现1 079cm-1附近特征峰在所有样品中都有
出现,螺旋藻粉样品的吸收峰形状和位置与糊精标准品相
似。应用Perkin-Elmer公司Spectrum V3.02操作软件中的
相似度比较功能,计算1 200~800cm-1范围内b—d与a的
相关系数,结果依次为:0.894 6,0.734 4,0.596 0。这些谱
图与糊精标准品谱图的相关系数程递减趋势,说明糊精的含
量在降低。其他厂家螺旋藻粉样品与糊精标准品相似度比较
结果见表2。
  以糖类吸收峰为基准对图4中三家样品的吸收光谱进行
归一化处理,结果如图5所示。辅料的含量越多,蛋白质吸
收峰强度越低,因此估算出d厂家的螺旋藻粉样品蛋白质含
量最高,b厂家的螺旋藻粉样品蛋白质含量最低[12,13]。
Fig.5 FTIR spectra of spirulina powder of
three different factories(b,c,d)
2.4 不同蛋白质含量螺旋藻粉的标准曲线
选定螺旋藻粉样品,添加不同比例的糊精,测定样品的
红外吸收光谱。根据蛋白质和糖类的特征吸收峰强度比与蛋
白质含量之间的线性关系建立标准曲线。样品的红外吸收光
谱和相对峰强度值如图6和表3所示。当样品中蛋白质含量
低于40% 时,全谱的最强吸收峰为糖类的特征吸收峰;当
蛋白质含量高于40% 时,全谱的最强吸收峰为酰胺Ⅰ带;
当样品中蛋白质含量接近40%时,蛋白质与糖类特征吸收峰
Fig.6 FTIR spectra of spirulina power with different amount
of protein(4 000~400cm-1)
Note:the protein content of samples as folowing a:14.86%;
b:20.39%;c:28.27%;d:31.25%;e:41.30%;f:50.91%;g:
56.52%;h:59.09%;i:64.03%;j:69.58%
979第4期                    光谱学与光谱分析
强度相当。取1 700和900cm-1为端点做出基线,测量1 658
~1 657cm-1和1 080~1 079cm-1处的峰强度。建立吸收峰
强度比和蛋白质含量之间的关联标准曲线,结果如图7。
Fig.7 Standard curve of spirulina powder
with different amount of protein
  由图7得到蛋白质和糖类特征吸收峰强度比和样品蛋白
质含量的关联方程如式(1)所示,标准曲线的相关性系数为
0.998 4。
y=42.71x-5.038 2 (1)
  选取八种不同的螺旋藻粉样品,应用凯氏定氮法和标准
曲线法分别测定和计算样品的蛋白质含量,比较二者相关
性,如图8所示。应用标准曲线计算的蛋白质含量与凯氏定
氮法测定值之间的相对偏差小于5%。由于压片法测定红外
光谱时样品用量小,样品的均匀性会影响到红外谱图的一致
性,红外吸收峰强度比的差异会引起对蛋白质含量计算的准
确性。凯氏定氮法中消化、蒸馏和滴定过程的重复性也会引
起测定误差。因此样品的均匀性和凯氏定氮法的重复性是产
生计算值和预测值偏差的主要原因。
Fig.8 Measured values and predicted values of protein
contents in different spirulina powder
3 结 论
  (1)通过解析螺旋藻标准品、螺旋藻粉样品和糊精标准
品的红外光谱指纹图谱,确定螺旋藻粉中的主要成分为蛋白
质和糖类,螺旋藻粉生产中添加的主要辅料为糊精。
(2)建立的关联特征吸收峰强度比和蛋白质含量的标准
曲线,相关性系数为0.998 4。预测判定出未知样品的蛋白质
含量,标准曲线计算的样品蛋白质含量与凯氏定氮法测定结
果的相对偏差小于5%。初步建立应用傅里叶变换红外光谱
法快速、无损评价螺旋藻粉品质的方法。
Table 3 Data of spirulina powder with different amount of protein
样品 蛋白质含量/% 峰高测定值A/1 657~1 658cm-1 峰高测定值B/1 079~1 080cm-1 峰强度比A/B
a 14.86  0.254 7  0.439 8  0.429 4  0.586 9  0.866 1  0.830 4  0.486 3
b  20.39  0.420 5  0.681 8  0.519 9  0.740 4  1.135 3  0.872 0  0.588 1
c  28.27  0.652 0  0.621 4  0.834 7  0.821 9  0.800 1  1.063 3  0.785 0
d  31.25  1.006 1  0.645 2  0.854 1  1.154 3  0.812 2  1.025 3  0.833 0
e  41.30  1.026 5  0.724 4  0.774 1  0.894 3  0.638 6  0.771 1  1.095 4
f  50.91  0.822 3  0.702 8  1.123 5  0.613 3  0.524 0  0.626 9  1.310 5
g  56.52  0.581 8  0.787 3  1.219 7  0.613 3  0.524 0  0.857 3  1.416 5
h  59.09  1.318 1  0.877 5  0.725 6  0.895 8  0.592 0  0.512 2  1.476 9
i  64.03  0.707 7  1.360 7  0.914 3  0.428 5  0.849 8  0.562 2  1.626 4
j  69.58  0.825 0  0.999 8  1.215 6  0.465 1  0.576 7  0.670 2  1.773 8
  Note:Take 1 700and 900cm-1 as endpoints to correct baseline.Peak heights are the result of three paralel experiments
References
[1] ZHOU Xi-hua(周希华).Food and Nutrition in China(中国食物与营养),2006,8:23.
[2] LIU Li-chuang,HU Zhi-he,ZHANG Yan(刘立闯,胡志和,张 艳).Journal of Food Science(食品科学),2009,30(19):276.
[3] ZHANG Xin,LI Jian-yong,GONG Xing-guo(张 昕,郦剑勇,龚兴国).Journal of Zhejiang University(浙江大学学报),2010,37(3):
319.
[4] ZHANG Tang-wei,LI Tian-cai(张唐伟,李天才).Chinese Biotechnology Bulietn(生物技术通报),2010,1:9.
[5] YIN Hong-ping,ZHENG Zhen-huan,ZHENG Heng,et al(尹鸿萍,郑震寰,郑 珩,等).Chinese Journal of Pharmaceuticals(中国医
药工业杂志),2009,40(12):907.
[6] Zhou Q,Sun S Q,Lin Z.Vibrational Spectroscopy,2004,36(2SPEC.ISS.):207.
089 光谱学与光谱分析                    第33卷
[7] Zhou Q,Sun S Q,Yu L,et al.Journal of Molecular Structure,2006,799(1-3):77.
[8] SUN Su-qin,ZHOU Qun,CHEN Jian-bo(孙素琴,周 群,陈建波).Analysis of Traditional Chinese Medicine by Infrared Spectroscopy
(中药红外光谱分析与鉴定).Beijing:Chemical Industry Press(北京:化学工业出版社),2010.
[9] LEI Yu,ZHOU Qun,ZHANG Yan-ling,et al.Journal of Molecular Structure,2010,96:88.
[10] Standardization Administration of the Reoplie’s Rupublic of China,GB/T 16919—1997,Food Grade Spirulina Powder(食用螺旋藻粉).
[11] Zhang Y L,Chen J B,Lei Y,et al.Journal of Molecular Structure,2010,974(103):144.
[12] XIE Jing-xi,CHANG Jun-biao,WANG Xu-ming(谢晶曦,常俊标,王绪明).Appliation of IR Spectral in Organic Chemistry and Medici-
nal Chemistry(红外光谱在有机化学和药物化学中的应用).Beijing:Science Press(北京:科学出版社),2001.77.
[13] YANG Jie,SONG Ji-mei,FANG Fang(杨 捷,宋继梅,方 芳).Journal of Anhui University Science Edition(安徽大学学报·自然科
学版),2009,33(1):87.
Analysis of Spirulina Powder by Fourier Transform Infrared Spectroscopy
and Calculation of Protein Content
LIU Hai-jing1,2,XU Chang-hua3,LI Wei-ming1,2,WANG Feng1,2,ZHOU Qun3,LI An1,2,ZHAO Yue-liang1,2,
HA Yi-ming1,2*,SUN Su-qin3*
1.Institute of Agro-food Science &Technology,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100193,China
2.Key Laboratory of Agro-product Processing,Ministry of Agriculture,Beijing 100193,China
3.Key Laboratory of Bioorganic Phosphorous Chemistry and Chemistry Biology(Ministry of Education),Department of Chem-
istry,Analysis Center,Tsinghua University,Beijing 100084,China
Abstract Spirulina,Spirulina powder and dextrin standard were analyzed and identified by Infrared(IR)spectroscopy.The
main components,protein(1 657and 1 537cm-1)and carbohydrate(1 069and 1054cm-1),had distinct fingerprint characteris-
tics of IR spectra.By comparing the IR spectra of Spirulina,Spirulina powder and dextrin standard,the dominant nutrition in
Spirulina powder was identified as protein and carbohydrate.The dominant accessory added in Spirulina powder was dextrin.
Comparing the IR spectra of Spirulina powder from 28different factories and figuring out the correlation provides the information
about the amount of accessory.A standard curve of the ratio of absorption peak intensities to protein content was constructed to
accurately determine the amount of protein in Spirulina powder.
Keywords Infrared spectroscopy;Spirulina;Protein;Fingerprinting
(Received Jul.23,2012;accepted Oct.30,2012)  
*Corresponding author
189第4期                    光谱学与光谱分析