全 文 ：研 究 报 告
螺旋藻的纯化*
甘旭华　唐欣昀**　刘广金　史成颖　汪本凡
(安徽农业大学生命科学学院　合肥　230036)
摘要:观察了螺旋藻生长过程中藻丝和杂菌的生长规律 , 发现中性细菌和碱性细菌的数量
始终是藻丝的 105 ～ 106倍。采用常规的稀释平板法 、 毛细管法和挑单藻法均无法可靠地获
得无菌纯藻。设计用低速离心法洗涤下沉性藻丝 , 用过滤法洗涤上浮性藻丝 , 对藻丝进行
预处理洗去大量杂菌;对迁移性和非迁移性藻株分别采用夹层法和平板法纯化藻株 , 使得
单根藻丝在平板上形成藻落 , 获得无菌纯藻。
关键词:螺旋藻 , 纯化技术 , 单藻落
中图分类号:Q93-331　　文献标识码:A　　文章编号:0253-2654 (2005) 02-0001-04
　　*安徽省科技厅自然基金资助 (No. 99042130)
安徽省教育厅自然基金资助 (No. 97JL052)
**通讯作者　Tel:0551-2823795-3129, E-m ail:tangxinyun@21 cn. com.
收稿日期:2004-02-23, 修回日期: 2004-10-30
Purification ofSpiru lina sp.*
GAN Xu-Hua　TANG Xin-Yun**　LIU Guang-Jin　SH I Cheng-Ying　WANG Ben-Fan
(Anhu i Agricu ltura lUn iversity, L ife Science College, Hefei 230036)
Ab stract:G row th pattern s of trichome and con tam inat ive bacteria in Spiru lina sp. liquid cu lture were observed,
and itw as found that the number of neu tral and alkaloph ilic bacteria w as alw ays 10
5 ～ 106 times of that ofSpiru li-
na sp. trichom e. It wou ld be very d ifficu lt to get real pu re Sp iru lina sp. s train by classicalm ethods of d ilu tion
p late, capi llary and single trichom e selecting m ethods. A great deal of con tam inative bacteria w aswashed ou tby
tw o p retreatm ent p rocesses. Low speed centrifugation was designed to wash the strains wh ich usually deposi t at
bottom, and fi ltration m ethod was designed to treat the strain s usually floating at su rface. Sandw ich p late and d i-
lu tion p late w ere designed for the purification o f them ob ile strains and non-mob ile strain s, respectively. A lot of
strain sw ere pu rified by the above p rocesses and pu re single trichom e form ed pu re colon ies on p lates.
K ey words:Spiru lina sp. , Purification techn ique, Pure co lony
螺旋藻 (Spirulina)是具有重要开发应用价值的原核生物 , 由于一系列技术上的困
难 , 螺旋藻遗传学研究进展缓慢 , 困难之一就是藻的无菌纯化。实验室保存的很多单藻
是螺旋藻与大量异养及自养细菌的混合培养物 , 而混合物是无法进行分子生物学研究。
在一般情况下 , 藻丝浓度最大可达 105 /mL, 而杂菌数可达 109 ～ 1010 /mL, 无法采用普通
的稀释平板法纯化分离获得纯藻 。Ogawa等 [ 1]采用过滤洗涤 、 紫外线照射 、添加抗生素 、
稀释微量接种法等方法进行纯化 , 该法过于繁琐 , 工作量大 , 成功率仅为 1% ～ 2%, 而
且使用紫外线 , 易造成藻丝损伤和诱变 , 不能保证筛选自然状态的藻株。徐增富等 [ 2]采
用离心洗涤 , 辅以消毒剂杀死杂菌 , 获得纯藻 , 其成功也基于个别藻丝偶尔逃避了消毒
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剂的作用。龚小敏[ 3] 、秦　松等 [ 4]采用毛细管法或挑单藻法获得了单藻 , 江志平等 [ 5]采
用随机取样分离法纯化螺旋藻 , 但这些方法均无法去除可能附着在藻丝上的杂菌。需要
指出的是 , 到目前为止均无单根藻丝可以在平板上形成藻落的报道 , 很多研究者也没有
注意到不同螺旋藻藻丝在平板上存在迁移性和非迁移性的区别 , 而迁移性是造成纯化的
困难之一。本文报道了快速 、简便 、可靠的纯化螺旋藻的方法。
1　材料与方法
1.1　藻株
钝顶螺旋藻 (Spiru lina platensis) 90048, 中国科学院武汉植物研究所胡鸿钧先生惠
赠;HEP和 R藻株由意大利 Pav ia大学 C iffe ri教授惠赠;其余藻株本室保存 (表 1)。
表 1　参试藻株特性
藻株 上浮性 迁移性
90048 + -
HPE + +
R - -
C, D, E, F, N, W + +
1.2　培养基和培养条件
Zarrouk培养基[ 1] , NaHCO 3、 K 2HPO4与其他大量元素分开灭菌 , 微量元素溶液 A5、
B6分开灭菌 , 灭菌后定量混合 , 固体培养基中加 1.5%纯化琼脂粉 。光照培养箱 , 28℃ ～
30℃, 3,000 Lux。
1.3　生长的测定
将 90048藻株接进培养液 , 定时用微量取样器取 20 μL藻液至载玻片上 , 解剖镜下统
计藻丝根数 , 测定的螺旋藻生长。杂菌生长测定的方法如下:在 pH7.2 ～ 7.4的牛肉膏蛋
白胨平板上涂平板测定中性细菌数量;在添加 0.1%蛋白胨的 Zarrouk平板上涂平板测定
嗜碱性细菌数量 。按公式 G =(t /n) = ( t×lg2 ) / (lgN2-lgN1)计算代时 。 (G , 代时;
N 1 , t1时刻微生物数量;N 2 , t2时刻微生物数量; t =( t2-t1);n, 世代数 。)
1.4　藻丝预处理
用离心法洗涤下沉性藻株 , 方法如下:500 r /m in低速离心藻液 5 m in, 倾上请液 ,
加无菌培养液洗涤 , 重复 8 ～ 10次 , 以去除大量杂菌。用过滤法洗涤上浮性藻株:用
绸布或滤纸收集藻丝 , 用无菌培养液反复冲洗 8 ～ 10次 , 挑取少量藻泥 , 制成藻液。
1.5　藻株纯化
夹层平板法纯化迁移性藻丝:取预处理的藻液 , 调整藻丝浓度至 2 ×103根 /mL。
先用约 5 mL刚配好的固体培养基 , 覆盖平板底部;待凝固后 , 取 0.1mL藻液至平皿 ,
加入约 10mL 50℃的固体培养基混平板 , 凝固后再倒上约 5mL 50℃的固体培养基 , 制
成夹层平板 。非迁移性藻株的纯化采用稀释平板法:取 0.1 mL藻液 (约 200根藻丝 )
在 Zarrouk平板上涂布 。所有平板均用 parafilm封口保湿。用解剖镜逐日观察平板 , 待
藻丝明显卷曲生长 、 藻丝根数增加后 , 用微型接种环 (直径 0.5 mm)、 微型接种针在
解剖镜下无菌操作挑取微藻落 。
待挑取的单藻在培养液中充分生长后 , 将藻液分别在 Zarrouk 、 Zarrouk+0.1%蛋
白胨 、 Zarrouk +葡萄糖 、牛肉膏蛋白胨平板上划线检查纯化效果。
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2　结果
2.1　螺旋藻的生长
螺旋藻 90048藻株接进新鲜培养液 (103 /mL) 1.5 d内生长缓慢 , 处于延滞期 , 2
d后藻丝浓度才增加至约 2×103 /mL。 1.5 ～ 3.5 d内藻丝的数量呈对数增长 , 处于生长
最快时期 , 以这一段时间的参数计算得到该藻株的代时 (以藻丝数为指标)约为 14 h
(图 1)。显然这个数值与一般细菌的代时相比是太长了。 4 d后藻丝的增长速度显著降
低 , 至 15 d达到最大值 (1.3×105 /mL)。
图 1　螺旋藻和杂菌的生长曲线
　—◆——中性培养基中细菌数 , —■—— 碱性培养基中细菌数 , —▲——藻丝数
2.2　杂菌的生长
与螺旋藻一道接进培养基的中性细菌 (中性培养基上测定 )接种时浓度较低 (约
10
2
/mL), 但细菌数量迅速增加 , 12 h就增加到约 1.6×108 /mL;平均代时为 35 m in。
碱性细菌 (碱性培养基上测定 )接种时浓度较高 (5×105 /mL), 但生长速度稍慢 , 12
h后也增加到约 1.5×108 /mL, 平均代时为 87 m in。在接种初期 , pH值约为 8.0, 从藻
液中带进的中性细菌迅速增长 。随着 pH值逐渐上升 (数据未显示 ), 中性细菌数量迅
速下降 , 碱性细菌数量稳步上升 , 在长时间内维持在 109 /mL。藻液中的杂菌总数始终
约是螺旋藻藻丝数量的 103 ～ 106倍。显然在这样的体系中是无法采用常规的稀释平板
法来纯化螺旋藻 , 更无法用毛细管法或挑单藻法来纯化螺旋藻。
2.3　预处理的效果
接种 6 ～ 8 d (对数后期 )的螺旋藻活性最高 , 容易成活 , 而此时杂菌数约是藻丝
数的 104 ～ 106倍。因为下沉性的藻丝细胞内无气泡 , 低速 (500 r /m in)即可使藻丝快
速沉降 , 而细菌体积微小 , 仍悬浮在液体中 , 倾去上清液即可去除大部分杂菌 , 离心
洗涤效率见图 2。对上浮性的藻丝不能采用离心法 , 只能使用过滤法 。若每次离心洗涤
或过滤洗涤的效率是 90%, 处理 8 ～ 10次应该可以使得杂菌的数量降到和藻丝相仿的
数量级 。实际上本文设计的预处理方法经多次实践证明是可行的 , 取经过预处理的藻
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图 2　离心洗涤效率
液涂平板或倒夹层平板 , 平板上的
杂菌菌落数量将不超过螺旋藻藻丝
(藻落)的数量 。
2.4　螺旋藻的纯化
由于螺旋藻形成藻落的时间较
长 (7 ～ 15 d), 螺旋藻形成藻落之
前杂菌菌落 (1 ～ 2 d)已长得很大 ,
并可连片 , 同时时间过长也难免被
包埋的迁移性藻丝出现移动 , 此时
再来挑取藻落纯化难度很大。对非
迁移性的藻株 , 纯化难度较小 , 与
此相比 , 迁移性藻株的纯化较难 。
若包埋技术恰当 , 3 ～ 5 d的平板仍可用来进行纯化 , 但处理不恰当 , 1 ～ 2 d后藻丝即
可出现迁移 , 其后果是杂菌污染严重 , 使得预处理失去意义 , 无法纯化螺旋藻 。因此
技术的关键在于 , 平板制备后用解剖镜逐日观察 , 待藻丝明显卷曲生长 、 或藻丝根数
增加后 , 在超净台上用微型接种环 (直径 0.5 mm)、 微型接种针在解剖镜下无菌操作
挑取微藻落 。对于迁移性藻株 , 最好在杂菌刚形成微型菌落 (1 d), 藻丝活性尚未完
全恢复 , 没有出现迁移前 , 直接从平板上挑取单根藻丝进行纯化 。
图 3　90048藻株在平板上形成的纯藻落 (×15)
将挑取的大量样品分别在 Za rrouk 、
Zarrouk +0.1%蛋白胨 、 Za rrouk +葡萄
糖 、牛肉膏蛋白胨等 4种不同的平板上划
线检查纯化效果 , 去除少量 (试试验者熟
练程度而不等)带杂菌的样品 , 获得了所
有参试菌株的大量的无菌纯藻藻株。将无
菌纯藻稀释涂平板获得的单藻落见图 3,
使单根螺旋藻藻丝在平板上高效形成单藻
落的技术是对螺旋藻进行深入研究的重要
基础。
螺旋藻的遗传学研究一直徘徊不
前 [ 6] , 主要原因可能是很多实验室使用的
藻株不是无菌纯藻 , 也很难使得单根藻丝在平板上形成纯藻落 , 这种情况制约着研究
的进展 。本文针对螺旋藻的生理特征 , 报道纯化螺旋藻的详细技术方法 , 并获得了大
量的纯藻株 , 这将为螺旋藻的理论研究提供可靠的技术基础 。
参 考 文 献
[ 1] Ogaw a T , Teru iG. J Ferm ent Techno l, 1970, 48 (6):361～ 367.
[ 2] 徐增富 , 刘晓勤 , 曹吉祥 , 等 .中山大学学报 (自然科学版), 1997, 36 (5):123～ 126.
[ 3] 龚小敏 , 胡鸿钧 .武汉植物学研究, 1996, 14 (1):58 ～ 66.
[ 4] 秦　松 , 童　顺 , 崔　武 , 等 .海洋与湖泊 , 1994, 25 (5):560～ 562.
[ 5] 汪志平 , 贾小明 , 傅俊杰 , 等 .浙江农业学报 , 1998, 10 (5):275～ 277.
[ 6] 唐欣昀 .微生物学通报 , 1997, 24 (5): 300 ～ 302.
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