全 文 ：药　物　生　物　技　术
Pharmaceut ical Biotechno logy 　2006 ,13(2):119 ～ 122
低分子螺旋藻多糖的制备及其
硫酸酯化物体外抗肿瘤活性的初步研究*
乐晓桐1 ,尹鸿萍1* ,王　 1* ,徐士君2
(1. 中国药科大学 生命科学与技术学院 ,江苏 南京 210009;2. 南京中医药大学 药学院 ,江苏 南京 210046)
摘　要　运用盐酸控制解聚的方法 , 通过单因素考察和正交试验优化 , 得到了平均相对分子质量约为
10 000的低分子螺旋藻多糖(LNPSP), 用硫酸化试剂氯磺酸-吡啶合成 3 种不同取代度的 LNPSP硫酸酯(SLNP-
SP1 , S LNPSP2 , S LNPSP3),采用体外抗肿瘤实验测定 3 种硫酸酯化物对人肝癌细胞 SMMC7721 的活性。结果
显示:低分子螺旋藻多糖的硫酸酯化物具有良好的体外抗肿瘤活性 , 与未修饰的 LNPSP 相比有显著性差异 , 且
随着硫酸化程度的增高抗肿瘤活性也相应提高。
关键词　螺旋藻;多糖硫酸酯;降解;合成;体外抗肿瘤
中图分类号:Q539　　　文献标识码:A　　　文章编号:1005-8915(2006)02-0119-04
　　螺旋藻多糖(Poly saccha ride f rom Spirulina
Platensis , PSP)是从螺旋藻中分离纯化的一种水
溶性多糖 ,为一种白色粉末状物质 ,对人体无毒 ,
具有显著的抗辐射 ,抗突变功能 ,可用于防癌 ,抗
衰老 ,增强机体免疫力等方面 。对螺旋藻多糖进
行的研究表明 ,其中的带硫酸根的酸性多糖具有
较高生物活性[ 1] ;也对螺旋藻多糖进行人工硫酸
化修饰 ,可以显著提高其活性[ 2] 。多糖的生物活
性不仅与链中硫酸根的含量有关 ,其分子质量的
大小对多糖的生物活性也有重要的影响 ,多糖分
子质量越大 ,分子体积越大 ,不利于多糖跨越多
重细胞膜障碍进入生物体内发挥生物学活性。
一般来说 ,把较高分子质量的多糖降解为较低的
分子质量 ,能显著提高其活性 。因此 ,制备低分
子质量的多糖及其硫酸酯化物 ,成为新药筛选的
一个重要方向 。但关于低分子螺旋藻多糖及其
硫酸酯化物的研究还未有报道 。
作者对螺旋藻中分离纯化所得的螺旋藻多糖
(NPSP)进行酸降解 、硫酸化修饰并对修饰前后以
及不同取代度的硫酸酯化多糖的抗肿瘤活性进行
了初步研究。
1　材料与仪器
螺旋藻粉:云南施普瑞公司提供;螺旋藻多糖:
本实验室自制 。
旋转蒸发仪(上海申胜生物技术有限公司);循
环水式真空泵(郑州长城科工贸有限公司);可控硅
控温水浴锅(江苏南通嘉程仪器有限公司);真空干
燥箱(上海实验仪器总厂);Agi lent 高效液相色谱
系统;320-S 型 pH 计(METT LER TO LEDO)
2　方　法
2. 1　LNPSP 的制备
2. 1. 1　影响降解反应的因素　经单因素实验证
明 ,影响降解反应的因素主要有盐酸用量 ,反应时
间与反应温度 ,这 3个因素直接影响到降解产物的
分子质量 。
2. 1. 2　降解条件的优化　就盐酸浓度 ,反应时间 ,
反应温度和醇沉浓度采用 L9(34)正交表进行正交
试验 。称取 1. 8克的螺旋藻多糖 ,按 1∶30的比例
加入浓度在 0. 6%～ 1. 0%的盐酸 ,搅拌至均相 。
在 70℃～ 80℃的条件下于水浴锅中进行降解反
应 ,反应 1 ～ 2. 5 h ,降解液用 2 mol /L 的 NaOH 溶
液调节 pH 值至 7. 0 ,透析 2 d ,减压浓缩 ,浓缩液按
乙醇的终浓度为 70%, 75%, 80%进行醇沉 ,真空
干燥得成品 ,高效凝胶渗透色谱法测定分子质量 ,
称重计算得率 。
2. 1. 3 　分子质量测定[ 3] 　高效凝胶渗透色谱
119
* 收稿日期:2005-09-28　　修回日期:2005-10-31
作者简介:乐晓桐 , 1980年生 ,女 ,广西柳州人,硕士研究生 ,主要从事螺旋藻多糖分子修饰的研究
　 * 通讯作者:尹鸿萍 ,副教授 , Tel:028-83271108　王 ,教授 ,博导 , Tel:025-83271395
(HPGPC)检测 LNPSP 的分子质量。
Shodex sugar KS-804柱与 shodex sugar KS-
802柱串联 ,流动相为 0. 1 mol /L NaNO 3 , 流速
0. 5 ml /min ,柱温:40℃。样品用流动相溶解 ,浓度
10 mg /ml ,进样量 20 μl。标准分子质量的 Dex-
t ran作标准曲线 ,计算样品的分子质量。
2. 2　氯磺酸-吡啶法合成 SLN PSP
将附有冷凝管和搅拌装置的三颈烧瓶置盐
水-冰浴中 ,加入吡啶 10 m l ,搅拌 ,使之充分冷却 ,
用滴液漏斗慢慢加入氯磺酸 0. 67 ～ 1. 25 m l ,
30 ～ 40 min滴加完毕 ,烧瓶中出现大量淡黄色固
体 ,然后加入 LNPSP 粉末 0. 2 g ,迅速将三颈烧
瓶移入沸水浴中 , 恒温搅拌 1. 5 h ,冷至室温 ,将
反应液倾入冰水中 ,透析 72 h。滤液浓缩 , 乙醇
沉淀 ,真空干燥得成品 。硫含量分析用 BaSO4浊
度法[ 4] 。
2. 3　紫外和红外光谱测定
将少量低分子螺旋藻多糖及其硫酸酯溶解于
蒸馏水 ,在岛津紫外分光光度计 UV-260型仪器上
记录 200 ～ 400 nm 之间的紫外吸收。低分子多糖
及其多糖硫酸酯经溴化钾压片 ,用 Nico let360型
傅立叶变换红外光谱仪记录红外光谱。
2. 4　体外抗肿瘤试验
取对数生长期的肿瘤细胞用胰蛋白酶消化
后以含 10%FCS的 RPM I 1640 培养液调整细胞
浓度至 4×104 / m l。按每孔 0. 1 ml (4 000 个细
胞)加入 96孔培养板中 , 4 h 后加入不同稀释浓
度的药物各0. 1 m l , 使终浓度分别为 10 μg /m l ,
50μg /ml ,100μg /ml ,250μg /ml ,500 μg /m l ,对照
组加等体积的 RPM I 1640完全培养液 ,每个浓度
均设 4个复孔 ,置 37℃体积分数为 5% CO2孵箱
中连续培养 72 h。培养结束前 4 h 各孔加入
MTT (5 g /L)20 μl , 放置上述孵箱中继续孵育
4 h ,弃上清 ,每孔加入二甲基亚砜 150 μl ,充分振
荡混匀后于酶标仪 570 nm 处测 OD 值 ,计算抑制
率。抑制率(%)=(对照组 OD 值-药物组 OD
值) /对照组 OD 值×100%
3　结　果
3. 1　LNPSP 的制备
通过对盐酸浓度 ,反应温度 ,反应时间的考察 ,
发现随着浓度增大 ,温度升高 ,时间的延长 , NPSP
的分子质量先是急剧下降 ,而后达到一平台 ,分子
质量变化不明显(图 1 ～ 3)。降解条件经正交试验
后 ,表明反应时间是主要因素 ,其次是盐酸的浓度
和反应温度 ,影响最小的因素是醇沉浓度。综合考
虑收率和分子质量两项指标(图 4),确定当降解条
件为反应温度 80℃,盐酸体积分数为 0. 6%,反应
时间 2. 5 h ,经过 HPGPC 检测 ,Mr约为 10 000 ,峰
型对称 , 为单一峰 , 纯度最高(图 5), 收率为
29. 4%。因而选择此条件为最佳降解条件 ,制备得
到M r约为 10 000的 LNPSP。
Fig 1　The effect o f different concentration of HCl on the
deg radation o f NPSP
Fig 2 　The effect of differ ent reactiv e time on the
deg radation o f NPSP
Fig 3　The effect o f different reactiv e temperature on the
deg radation o f NPSP
3. 2　SLNPSP 的合成
以硫酸化试剂氯磺酸-吡啶对低分子螺旋藻多
糖进行化学修饰 ,改变氯磺酸-吡啶的试剂用量得
到了 3种不同的硫酸酯化产物 ,结果见表 1。
120 药 物 生 物 技 术 第 13 卷第 2 期　
1. 0. 6%HCl , 1. 5 h , 70℃;2. 0. 8%HCl , 2 h , 70℃;3. 0. 8%HCl , 1. 5
h , 80℃;4. 0. 6%HCl, 2. 5 h , 80℃;5. 1. 0%HCl , 1. 5 h , 75℃;6. 0. 6%
HCl , 2 h , 75℃;7. 0. 8%HCl , 2. 5 h , 75℃
Fig 4　The recover y and M r of LNPSP in the or thogonal
e xperiments　
Fig 5　The HPGPC spect rum o f LNPSP
Tab 1　Effect o f diffe rent r atio of chlo ro sulfonic acid and
py ridine on sulfation o f LNPSP
NO .
Sulfa ting
Reagenta
(mola r)
T ime
(min)
Sulfur
content
(%)
DSb
S LNPSP1 　8∶1 90 　3. 363 2 0. 190 7
S LNPSP2 10∶1 90 　4. 213 5 0. 249 4
S LNPSP3 15∶1 90 12. 159 8 1. 005 2
a. Molar ratio=m olar of reagent / m olar of m on osaccharide;b . De-
g ree of su lfu r , represen ts the num ber of sulfate g rou ps per g lucose
u nit;DS=[ 1. 62×S(%)] ÷[ 32-1. 02×S(%)] .
3. 3　LNPSP 和 SLNPSP 的光谱分析
S LNPSP的紫外光谱和红外光谱分析:紫外光
谱在 260nm处有-SO3的吸收 ,而 LN PSP 在 200 ～
400nm 范围内无吸收峰位 , 红外光谱显示除了
LN PSP 母体的特征吸收外 , 还有 SLNPSP 在
1 262. 46和816. 47 cm-1处硫酸酯键的特征吸收 ,都
证明了 SLNPSP 确实为硫酸酯。
3. 4　体外抑制肿瘤细胞生长作用
LNPSP 、SLNPSP1 , SLNPSP2 , SLNPSP3 体
外对 SMMC 7721细胞的生长抑制作用观察结果
见图 6。由结果可知 , LNPSP 对细胞的生长几乎
没有抑制作用 。SLNPSP 对细胞的生长抑制率较
LNPSP 显著提高 ,其中 SLNPSP3(250 μg /ml)的
抑制率最高为 51. 5%。
Fig 6　The Restrain r ate o f LNPSP , SLNPSP1 , SL-
NPSP2 , and SLNPSP3 on SMMC7721
4　讨　论
目前 ,制备低分子多糖主要有化学降解法 ,酶
降解法 ,氧化降解法和辐射降解法 ,这 4种方法各
有优缺点 。在实验中 ,我们从降低成本 ,简化工艺
着手 ,选择以盐酸为解聚剂 ,反应过程简单 ,操作性
强 ,所用的试剂无毒 ,对环境污染小 ,是一种较为理
想的获取低分子多糖的方法 。多糖硫酸化常用的
方法有三氧化硫-吡啶法 ,浓硫酸法 ,氯磺酸法 ,三
氧化硫-二甲基甲酰胺法[ 5 , 6] ,田庚元[ 7] 等通过比较
认为 ,氯磺酸-吡啶法是最理想的一种方法 ,反应条
件相应简单 ,产物回收方便 ,收率和取代度均较理
想 。体外抗肿瘤实验表明 ,修饰前的低分子螺旋
藻多糖对肿瘤细胞 SMMC 7721 几乎无抑制生长
的作用 ,这与很多文献报道天然多糖体外无直接
细胞毒作用相一致 ,但经硫酸酯化修饰后却表现
出显著的抑制肿瘤细胞增殖的作用 ,与剂量有良
好的相关性 。多糖硫酸酯的抗肿瘤作用还与其
取代度存在一定的关系 ,取代度增高其作用也增
强 。此外 ,不同分子质量段的低分子螺旋藻多糖
的筛选 ,及其硫酸酯抗肿瘤活性与机制等问题还
有待深入研究。
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Preparation of LowMolecular Weight Polysaccharide of Spirulina Plat-
ensis and Anti-tumor Activity of Its Sulfates Ester in vitro
LE Xiao-tong1 , YIN Hong-ping*1 , WANG Min*1 , XU Shi-jun2
(1. School o f L i f e Science and Technology , China Pharmaceut ical Universi ty , Nanj ing 210009 ,
China;2. S chool o f P harmacy , Nanj ing University of TCM , Nanj ing 210046 , China)　　
Abstract　Low molecular w eight po ly saccharide of Spirulina Platensis (LNPSP)was obtained by hydro-
chloric acid deg radation , and its average relative mo lecular mass w as 10ku. The SLNPSP1 , S LNPSP2 ,
and SLNPSP3 of sulfated po ly saccharides w ere synthesized by chloro sulfonic-py ridine method , and their
sulfur contents increased g radually. Their activit ie s we re determined through anti-tumor study in vit ro
on SMMC 7721. The results indicated that there w as a ve ry significant difference be tw een the activi ties
of SLNPSP and those o f LN PSP , and the anti-tumo r activity was increased wi th the sulfur content.
Key words 　Spirulina Platensis , Poly saccharide Sulfate , Deg radation , Synthesizat ion , Anti-tumor
in v it ro
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122 药 物 生 物 技 术 第 13 卷第 2 期