全 文 ：药　物　生　物　技　术
Pharmaceutical Bio technology　2004 , 11(2):104 ～ 107
螺旋藻酸性多糖的电泳方法研究
郑震寰 ,尹鸿萍＊ ,叶波平 ,王　 ＊
(中国药科大学微生物教研室 ,江苏 南京 210009)
摘　要　利用琼脂糖凝胶电泳 、聚丙烯酰胺梯度胶电泳及等电聚焦电泳对从螺旋藻中分离出的酸性多糖进
行了研究。结果表明 ,螺旋藻酸性多糖的琼脂糖凝胶电泳呈单一斑点 ,与其他几种硫酸化多糖相比 ,迁移率有较
大差异;利用聚丙烯酰胺梯度胶电泳可按分子质量大小将其分成 3 个组分 ,该结果与高效液相检测结果比较 ,两
者基本吻合;螺旋藻酸性多糖的等电聚焦电泳呈单一条带 ,分布范围在 pH 值 6.67 ～ 7.72。
关键词　螺旋藻;多糖;电泳
中图分类号:Q539　　　文献标识码:A　　　文章编号:1005-8915(2004)02-0104-04
　　螺旋藻酸性多糖(Acidic Polysaccharide of
S pirulina Plantensis ,APSP)是从螺旋藻(Spiruli-
na Plantensis)中提取的水溶酸性多糖 ,是螺旋藻中
的主要活性成分。APSP 具有提高机体免疫 、抗肿
瘤 、抗辐射 、抗氧化 、抗衰老 、降血脂及提高造血功
能等作用[ 1] 。本研究采用几种不同的电泳方法对
APSP 进行了检测 ,希望能为电泳技术用于多糖分
析检测方面提供一定的参考。
1　实验试剂与仪器
琼脂糖 ,Spanish 进口分装;丙烯酰胺 、甲叉丙
烯酰胺 ,BBI 进口分装;过硫酸铵 ,(N ,N ,N′,N′)四
甲基乙二胺(TEMED)、甘氨酸 、三羟甲基氨基甲
烷(Tris),Amresco 进口分装;Ampholine(pH 值 3.
5 ～ 10),安玛西亚公司;肝素 、硫酸软骨素 、硫酸化
葡聚糖 DE-1(平均分子质量 10 000 u), Sigma 公
司;其他试剂均为国产分析纯 。
EPS604电泳仪 、EPS604水平电泳槽(胶板面
积7 cm ×9 cm),南京科宝仪器研究所;HL-2S 恒
流泵 ,上海沪西分析仪器厂;凝胶梯度混合仪 ,北京
科普仪器厂;DYY-Ⅲ24 型垂直电泳槽(胶板面积
10.5 cm×11.5 cm)、圆盘电泳槽 、DY1601 稳压稳
流电泳 ,南京大学南达生物技术开发公司;凝胶扫
描系统 ,Ultra-Violet Products 公司;高效液相层析
系统 ,Agilent公司 。
APSP供试品由本室制备 ,其糖含量经硫酸苯
酚法[ 2]测定均高于 85%。
2　实验方法
2.1　琼脂糖凝胶电泳
取 APSP 、盐藻多糖 、硫酸软骨素 、肝素及标准
硫酸化葡聚糖 ,加水溶解配成 10 mg/ml的供试品
溶液 ,按文献[ 3] 方法进行电泳。电泳结束后 ,计算
各供试品的电泳迁移率 。
2.2　聚丙烯酰胺梯度胶电泳
2.2.1　电泳方法　取 APSP10 mg 置微量离心管
中 ,加入甘油 0.1m l , 0.1%溴酚蓝溶液 50μl ,加双
蒸水至 1m l ,振荡至完全溶解后离心取上清即得供
试品溶液 。
按文献[ 4] 方法进行电泳 。凝胶梯度范围:
3.5%～ 10%;上样量 10 μl;电泳完毕后用凝胶扫
描系统对胶片进行分析 。
2.2.2　HPLC分析　将聚丙烯酰胺梯度胶电泳所
使用的 APSP 供试品进行 HPLC 分析 。
HPLC色谱条件:Agilent 高压液相层析系统;
柱为 Shodex 公司 KS-804和 KS-802两柱串联 ,
示差折光检测器检测;样品浓度为 4 mg/ml ,上样
量 20μl ,洗脱液为 0.01 mol/ L NaAc-HAc 缓冲液
(pH 值 6.0),柱温 25℃,流速 0.5 ml/min。
2.3　等电聚焦电泳
取 APSP 10 mg 置于微量离心管中 , 加入
Ampholine 20μl ,甘油 0.2 g ,震荡至完全溶解 ,离
104
收稿日期:2003-07-08　修回日期:2003-11-06
作者简介:郑震寰 , 1979年生 ,男 ,山东淄博人 ,硕士研究生 ,主要从事螺旋藻多糖理化性质的研究
　 ＊ 通讯联系人:尹鸿萍 ,副教授 , Tel:025-83271108　　王 ,教授,博导 , Tel:025-83271395
心取上清即得供试品溶液 。
采用文献[ 5] 所述方法进行电泳。分离胶浓度
为4%;上样量 10μl;于 200 V 进行电泳 ,待电流下
降至 0.2mA时 ,将电压增至 400V ,至电流不再变
化时结束电泳。剥出胶条 ,在 0.1%甲苯胺蓝中染
色 3 h ,再用水脱色 。
按文献[ 6]所述方法进行 APSP 电泳区带分布
范围的测定。
3　结　果
3.1　琼脂糖凝胶电泳
1.Indicator;2.The polysaccharides of D.Sal ina;3.APSP;4.
Chondroi tin sulfated;5.Heparin;6.Sulfated dextran(M r 10 000).
F ig 1　Agarose gel electrophoresis
肝素 ,硫酸软骨素 ,标准硫酸化葡聚糖 ,盐藻多
糖 、APSP 的电泳结果见图 1 ,结果显示 APSP 在琼
脂糖凝胶上呈单一斑点 ,且斑点位置与标准硫酸化
葡聚糖等其他几种酸性多糖的斑点位置有明显区
别 ,与指示剂相比 ,各组分电泳迁移率依次为1.08 ,
0.82 ,1.20 ,1.16 ,1.38。
3.2　聚丙烯酰胺梯度胶电泳
APSP的聚丙烯酰胺梯度胶电泳结果见图 2。
APSP 电泳后在凝胶上呈现 3 条色带 ,这表明利用
该法可将 APSP 按分子质量大小分成 3个组分;图
3为 APSP 的凝胶图谱经图像扫描分析软件处理
后的数字化图谱 。利用凝胶扫描分析软件对峰面
积进行计算 ,得出各电泳条带所对应组分在 APSP
中所占的百分含量 ,结果见表 1 。
Four APSP samples were assayed in lane 1～ 4
Fig 2　Gradient po lyacry lamide gel electrophoresis
Fig (1)～ (4)Above w ere corresponding to lane 1～ 4 in Fig 2.The three peaks in all figures w ere corresponding to the th ree zones in the
elect rophotograms of gradient PAGE.
Fig 3　Results of gel scanning
105郑震寰等:螺旋藻酸性多糖的电泳方法研究
Tab 1　Results of Quantitative analysis with Gel Scanning System
No. Content(%)
Peak 1 Peak 2 Peak 3
Lane 1 2.63 63.88 33.49
Lane 2 2.67 60.14 37.59
Lane 3 2.16 66.27 31.57
Lane 4 2.20 67.16 30.64
　　图 4是用 HPLC 对第 1泳道的 APSP 样品进
行检测的结果。结果显示 ,HPLC 亦可将 APSP 分
成 3个组分 ,各组分的出峰时间为 17.372 min 、20.
735 min 、22.830 min;含量分别为 1.21%、
67.84%、31.31%。
3.3　等电聚焦电泳
根据等电聚焦结果 ,绘制的 APSP pH 值—胶
段曲线图见图 5 ,求得线性回归方程为 y=0.4026x
+3.2502 , r=0.994 。根据线性回归方程及条带所
对应的区带份数 ,计算出 APSP区带的分布范围在
pH 值 6.67 ～ 7.72。
The APSP sam ple in lane 1 was analyzed by HPLC.The th ree peaks in this f igu re w ere corresponding to the three zones in the elect rophotograms
of gradient PAGE.
Fig 4　Result of HPLC analysis
F ig 5 　The pH value— fractions curve of isoelectric focusing
electrophoresis
4　讨　论
4.1　琼脂糖凝胶电泳
以琼脂糖凝胶作为电泳介质 ,一般按供试品的
电荷量进行分离 ,供试品自身所带电荷的多少决定
了其电泳迁移率的大小 。从实验结果中可以看出 ,
APSP 供试品在凝胶中呈现单一斑点 ,表明 APSP
分子自身所带电荷在一定范围内呈均匀连续分布;
APSP 的电泳迁移率与其他酸性多糖相比有较大
差异 ,提示可利用琼脂糖凝胶电泳对其进行定性鉴
别。
4.2　聚丙烯酰胺梯度胶电泳
在琼脂糖凝胶电泳中呈现单一斑点的 APSP
样品 ,利用聚丙烯酰胺梯度胶电泳又可将其分成 3
个组分 ,这 3个组分所对应的条带较为接近 ,表明
它们具有近似的分子质量;HPLC 图谱也显示出同
样的结果:3个组分的出峰时间差别不大 ,其中第
2 、3组分的色谱峰发生重叠。
为了能更好对电泳结果进行考察 ,用凝胶扫描
系统对APSP 的凝胶图谱进行了处理 ,经处理后所
得到图谱与APSP 的 HPLC 图谱进行比较 ,两者基
本吻合 ,各组分的含量分析结果也基本一致 ,提示
本法可用于APSP 的纯度检测及定量分析 ,但该法
106 药 物 生 物 技 术 第 11 卷第 2 期　
相对 HPLC 来说操作更为简便 ,快速 。在测定 AP-
SP 相对分子质量的大小及分布方面 ,拟用标准分
子质量的硫酸化葡聚糖作为 Marker对 APSP 的分
子质量进行测定;但对Sigma公司的一系列标准硫
酸化葡聚糖进行电泳考察后发现 ,该硫酸化葡聚糖
在梯度胶电泳图谱中根本不能形成范围较窄的单
一色带 ,无法用其作为 Marker 对 APSP 进行分子
质量大小及分布的测定 ,由于上述原因 ,在测定相
对分子质量的大小及分布方面 ,本法不及HPLC 。
对于该法 ,凝胶浓度范围的选择最为重要 ,过
大或过小 ,都不能对 APSP 进行很好的分离 ,为此
考察了 3.5%～ 7.5%、3.5%～ 10%、3.5%～
12.5%,3.5%～ 15%及 3.5%～ 20%等 5 个不同
的梯度范围 ,结果发现 3.5%～ 10%分离效果最
好 ,因此最终选取 3.5%～ 10%的梯度胶作为分离
胶。
4.3　等电聚焦电泳
APSP 的等电聚焦结果显示 ,APSP 的等电聚
焦电泳区带较宽 ,主要分布在中性偏酸的 pH 值范
围内;同时在胶条酸性端还有一较窄区带 ,估计可
能为带酸性基团较多的小分子糖类物质 。将该结
果与琼脂糖凝胶电泳的结果进行比较 ,可以看出两
种电泳的检测结果基本一致 ,APSP 在这两种电泳
介质上均呈单一斑点(区带),说明 APSP 分子自身
所带电荷在一定范围内呈均匀连续分布 , 然而
APSP经聚丙烯酰胺梯度胶电泳分离后又可分成 3
个组分 ,这表明电荷分布均一的多糖 ,并不一定是
单一组分 ,很有可能是由自身所带电荷量近似但分
子质量不同的多个组分组成;至于酸性端的窄区
带 ,前面已经推断该区带可能是带酸性基团较多的
小分子糖类物质 ,由于其自身所带电荷较多 ,分子
质量又小 ,因此很有可能在琼脂糖凝胶电泳过程中
逸出了凝胶 ,故在琼脂糖凝胶电泳图谱上未曾显
示。
参考文献
[ 1] 　左绍远 ,田兴亚.螺旋藻多糖生物学活性研究进展[ J] .时珍
国医国药 , 2001 , 12(6):553.
[ 2] 　张惟杰.糖复合物生化研究技术[ M] .杭州:浙江大学出版
社 , 1994.17.
[ 3] 　郑震寰 ,尹鸿萍 , 张芳 ,等.螺旋藻多糖的琼脂糖凝胶电泳鉴
别[ J] .中国生化药物杂志 , 2003 , 24(1):34.
[ 4] 　Edens R E , Al-Hakim A ,Weiler J M , et a l.Gradient polyacry-
lamide gel elect rophoresis for determinat ion of molecular weigh ts
of heparin preparations and low-molecular-weight heparin deriva-
t ives[ J] .J Pharm Sci ,1992 , 81(8):823.
[ 5] 　夏其昌.蛋白质化学研究技术与进展[ M] .北京:科学出版
社 , 1997 , 112.
[ 6] 　徐秀兰.生物化学实验与指导[ M] .北京:中国医药科技出版
社 , 1994 , 197.
Studies on the Electrophoretic Methods of Acidic Polysaccharide from
Spirulina Plantensis
ZHENG Zhen-huan , YIN Hong-ping ,YE Bo-ping ,WANG Min
(Department of Microbiology , China Pharmaceut ical Universi ty , Nanjing 210009 , China)
Abstract　Using agarose gel elect rophoresis(AGE), g radient polyacrylamide gel electropho resis(PAGE)and
isoelect ric focusing electropho resis(IEF), the elect rophoretic behaviors of acidic polysaccharide f rom S piruli-
na Plantensis(APSP)were studied.The results showed that in AGE elect rophotog ram APSP had one spot
and compared w ith other kinds of sulfate polysaccharides , it s migration rat io w as different , then in g radient
PAGE elect rophotogram APSP was further separated into three zones , which w ere identical with the results of
HPLC.Finally the results of IEF indicated that on the gel APSP had one zone , which w as located betw een
pH6.67 and 7.72.
Key words　Spirulina Plantensis , Poly saccharide ,Elect rophoresis
107郑震寰等:螺旋藻酸性多糖的电泳方法研究