全 文 ：2 88微 生 物 学 通 报 20 00年 7 2 (4)
矛 ~的 ~ ~ ~树的 必 ~峋
; 专论与综述 ;
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螺旋藻遗传育种研究进展 `
怀 士 不 -甲- ` 中 产又盔, !
(浙江大学原子核农业科学研究所 杭州 3 10 0 2 9)
钱 凯
(浙江大学生命科学学院
先
杭州 3 10 0 2 7 )
关键词 : 螺旋藻 , 遗传育种
中图分类号 : Q 93 文献标识码 : A 文章编号 : 0 2 53一2 654 ( 200 0 ) 04一0 2 88一 04
螺旋藻 (今 ir ul in a) 属蓝藻门 、 颤藻科 , 是一种光合
放氧的丝状蓝细菌 。 因其富含优质蛋白 (60 % 一 70 % )和
多种生物活性物质 , 而受到了国内外的极大关注 , 近年
来已在大量研究的基础上形成了以工厂化养殖和深加
工为主体的螺旋藻产业 。 如何进一步降低养殖成本和
开发多种适合市场需求的产品 , 是 目前螺旋藻产业发
展中急需解决的重要问题 。 利用现代生物技术选育品
性兼优的新藻种是解决上述 问题的有效途径 , 也是当
前国际上螺旋藻领域的研究热点之一 。 本文概述了近
年来国内外有关螺旋藻原生质球制备与再生 、 基因工
程育种及诱变育种等方面的研究进展 。
1 原生质球 (s p h e r o p一a s t s )的制备与再生
植物原生质体 (p or ot p l as ts) 是遗传操作 的有力工
具 , 是育种工作中利用基因工程和诱发突变等现代生
物技术对种质进行遗传改良的理想材料 。 因此 , 制备高
质量且具再生能力的螺旋藻原生质球 , 对开展螺旋藻
的分子遗传学和育种研究都是至关重要的 。
19 82 年 oR ib ns on 首先提出了酶解制备钝顶螺旋藻
( .5 p al te ns is) 原生质球的方法 , 19 89 年 L a n if l lo hi 等 l1] 对
.5 p la et ns is 原生质球的制备和再生进行了研究 。 他们
先用 1 . s m of / L的 N 自C l溶液洗去藻丝表面的外鞘套 , 后
用溶菌酶进行酶解 , 再用牛血清蛋白梯度离心法从酶
解液 中分离出高纯度 的原生质球 , 活性率达 4 % 一
1 2%
。 并发现幼嫩细胞 比老化细胞更适用于制备原生
质球 , 由幼嫩细胞制得活性原生质球的再 生率高达
4 0% 一 70% , 而由老化细胞制得活性原生质球的再生率
仅为 10% 一 4 0% 。 19 94 年 P . S e ht u 等 [, ]以甘露醇为渗
透稳定剂 , 在 p H 6 . 8 的磷酸缓冲液中用溶菌酶酶解藻丝
2 8h
, 再用蔗糖密度梯度离心获得了原生质球 , 但以这
种原生质球的再生率未作报道 , 可 能是在甘露醇中酶
解时间太长 ,对细胞有毒害作用而不一定能再生 。 1 9 9 6
年彭国宏等 3[] 进一步证明甘露醇和高浓度的 Na a 或
K C I ( 1
.
2m ol / L以上 , 35 ℃ )对螺旋藻均有伤害作用 , 可
导致藻丝体大量断裂 , 并 因在甘露醇浓度为住 5一
l
.
s m o l / L
、 溶菌酶浓度为 0 . 5% 一 l% (w / v )及 p H 为
6一 8 的条件下做了多次实验均未能分离出原生质球 ,
而对上述有关螺旋藻原生质球分离的报道产生 了怀
疑 。 此后 , 他们先用机械法将藻丝打断 , 后用酸性溶液
洗去藻丝外层的胶状物 (分离原生质球的主要障碍之
一 ) , 再在渗透稳定剂为 .0 8m ol / L K C I的磷酸缓冲液
中 , 用 .0 5% 溶菌酶和 1% 果胶酶协同处理 2 ~ 6h , 获得
了大量活性率高达 98 % 的原生质球 , 并对它们的光合
作用特性作了研究 , 但也未报道其再生率 。 此外 , 秦松
等用超声波处理 汉 p la et ns is 藻丝制得了原生质球并再
生成功 , 但也因此法原生质球的得率太低而难以应用
于遗传育种研究 。
总之 , 国内外在螺旋藻原生质球的制备和再生方
浙江省 “九五 ” 重点项 目资助
收稿日期 : 19 9 9刃 8一 12 , 修回 日期 : 19 9 9一 10一 1 3
DOI : 10. 13344 /j . mi crobi ol . chi na . 2000. 04. 017
00 20 年 2 7( 4)微 生 物 学 通 报 · 8 2 9·
面虽然作了一些工作 ,但到目前为止 , 尚不能可靠地制 (al o p ll y c oc y翻n) 基因 , 作了序列分析 , 并已 通 过构成
备出质量高且具再生能力的螺旋藻原生质球 ,供遗传 融合蛋白的方式实现了在 .E oC il 中的高效表达 。 同时 ,
育种所需 。 在螺旋藻质粒研究方面也取得了一些进展 , 秦松等阁 已
2 基因工程育种 分别 从 S, p al ent is S 6和 只藻株 中分 离到 240 kb 和
基 因工程是改 良和创建生物技术 良种的有力武 1. 78 kb 的 C C C (共价闭合环状 )质粒 。 然而 , 至今还不能
器 。 有关螺旋藻的基因识别和克隆研究方面 已取得了 象高等植物那样 , 将基因工程这一先进技术应用于 螺
不少有意义的结果 4[] 。 光合作用过程中固定 C q 的关键 旋藻的品种改 良 , 原因主要有三 : (l ) 螺旋藻完整的基
酶 一 核 酮 糖 一 1 , 5一 二 磷 酸 梭 化 酶 (凡b ul os e一 1 , 5一 因 图谱尚未构建 , 对其整个基因组 尚缺乏 系统认识 ;
iB s p ll o s曲aet C abr ox y las e )大亚单位和小亚单位的基因 (2) 还没有找到合适的限制性 内切酶来对所发现的
已成功地从 .5 p la et ns is 中克隆出来 , 并在 .E oC il 中获 C C C 质粒进行深人研究 , 也未发现该质粒的功能 (隐秘
得 表达 ; 秦松 等 已 从螺旋 藻 中分 离出别 藻蓝蛋 白 型质粒 ) , 更未构建出理想的转基因载体 ; (3) 尚不能制
表 1 利用诱发突变技术获得的螺旋藻突变体
类 型
抗氨基酸类
似物的突变
体 (约3 0 0株 )
突变体特性 诱变因素 作者 文献
对氨基酸类似物有
抗性 , 某些氨基酸
含量增加 , 抗盐
1一甲基一 3一硝
基一 l 一亚硝基
肌 (M N N G )
所用材料
5 P la te n s is
藻丝体
斑e e a r d i G,
S o ar S
,
e t
.
al
.
时间
1 9 8 1
1 9 8 3
形态变异
突变体
藻丝变长 ,
上浮性好
Y一射线 5 P al te n s is
单细胞
胡天赐 ,
杨世杰等
1 9 9 0
耐低温突变
体 (2个 )
低温下能快速生
长 , 形态变异
甲基磺酸
乙酷 ( EM S )
5 P al te n s行 1 9 9 0
藻丝体
张学成 ,
谭桂英等
抗高光抑制
突变体 (2 株 )
藻丝变短 , 高光
合 、 低呼吸 、 生长快
丫一射线 5 P al te n s is
藻丝体
龚小敏 ,
胡鸿钧
19 9 6 [ 10 ]
形态变异
突变体
藻丝变长 , 螺旋加
长 , 螺旋数增多
E M S 5 P al te n s ls 崔海瑞 ,
汪志平等
19 9 7 [ 1 1 ]
藻丝体
富含藻蓝蛋
白的突变体
藻丝变长 , 藻蓝蛋
白和 S O D 含量提高
紫外线 S 州口 .幼 刀卫口
藻丝体
iL iJ
a xl】l o n g ,
Zh e gn W
e i
,
e .t al
.
19 9 7 112 ]
耐低温的
中温品系 更耐低温 , 蛋
白质高9 . 5%
亚硝基肌
(N T G )
5 P al te n s 行
单细胞
殷春涛 ,
胡鸿钧等
19 9 7 [ 1 3 ]
耐低温
突变体 细胞宽大 , 能在
低温下 良好生长
丫一射线 5 P al te n s is
藻丝体
汪志平 ,
徐步进等
1 99 8 [ 14 ]
高产 、 超
长突变体 藻丝长达 cI m , 采
收极方便 , 产量提
高 H . 7%
丫一射线 5 P al te n s is
单细胞或短
的藻丝片段
汪志平 ,
叶庆富等
1 9 9 8 [ 15〕
.29 0
· 微 生 物 学 通 报 2 000年7 2 (4)
备出外源 1〕 NA 易导入且具再生能力的原生质球 。 因
此 , 利用基因工程技术创建螺旋藻生物技术 良种的前
景虽然十分诱人 , 但还需要做大量的基础研究工作 。
值得庆幸的是 , 近年来在外源 D N A 导人螺旋藻细
胞 的方 法上 已 取 得 了 一些 有 意 义 的 结果 。 eZ ng
J l lnZ hi[ 6] 等 分别 利 用超 声波 处 理 和 电击 法将 质粒
p B 3R 25 导人到螺旋藻细胞 内 , 并得到 了 表达 ; K Ll l l l盯
T A 等用溶菌酶和 E l汀A 处理螺旋藻细胞 , 制得了能实
现 外 源 1〕N A 导 人 且 能 再 生 成 藻 丝 体 的 透 性 体
(pe ~ alP
as st
. 相对原生质球而言 , 残 留更多的胞壁 ) ,
并将 p sR l 二℃1l l xL 质粒 导人其 中 , 获得 了表达 。 最近 ,
oKj im
a H 等发现螺旋藻中存有转座因子 (antr sP os ab le
ge ne ict el e m en s)t
, 并提出了先将外源基因整合到转座
因子上 , 再通过转座因子的转座作用实现 1) N A 重组的
新构想 。
3 诱变育种
诱发突变技术及相关生物技术是改良和创建生物
技术良种的另一重要手段 。 国 内外在螺旋藻诱变育种
方面进行了较深人的研究 , 并 已获得了一些有价值的
突变体 [,一 ’ 4 ] 。 由表 1可见 , 物理诱变因子 (丫一射线 、 紫外
线等 )和化学诱变因子 (E M S 、 M N N G 等 )均能使螺旋藻
藻丝或细胞发生变异 , 产生高产 、 耐低温 、 耐盐 、 富含某
种氨基酸或藻蓝蛋白及藻丝超长等突变体 。 这些突变
体不仅是基础理论研究的好材料 , 而且也是应用于螺
旋藻养殖和深加工的理想品系 。
选择适宜的诱变材料和诱变因子及其剂量是诱变
育种成败的关键 。 研究表明 , 以超声波或组织匀浆破碎
等机械方法制得的单细胞或短的藻丝段为诱变材料 , 与
直接以多细胞的螺旋藻藻丝相 比 , 不仅诱变敏感性和诱
变率大为提高 , 而且更有益于突变体的筛选 8[, ” , ’ 5] 。 其
主要原因可能在于 : 螺旋藻完整的 D N A 修复系统及细
胞壁所含的抗辐射多糖 ,使其对电离辐射和化学诱变剂
均有较强的抗性 , 而机械作用具有去除细胞壁 , 甚至可
能破坏 D N A 修复系统的生物学效应 ; 螺旋藻藻丝中即
使有个别细胞发生了有益突变 , 也会因与大量的非突变
细胞混杂在一起而难以得到表达并被筛选出来 间 。 同
时 , 笔者发现用几种诱变因子对螺旋藻藻丝或细胞进行
复合处理 , 比用单一诱变因子处理更能提高诱变敏感性
和诱变率 (待发表 ) 。 一般认为 , 利用不同性质的诱变因
子处理生物体 , 可在减轻损伤的同时 , 使各种诱变因子
的特异作用相互配合 ,从而提高产生有利突变的频率 。
虽然诱发突变技术对遗传物质 D N A 的操作不具有
基因工程那么强 的针对性 , 但诱变育种具有所需仪器
设备简单 、 操作简便 、 成本低 、 效率高等优点 。 因此 , 在
当前开展螺旋藻基因操作所需的技术和条件还不完备
的情况下 ,诱变育种仍不失为一种创建螺旋藻生物技
术良种的有效而实用的重要手段 。
4 展望
近年来 , 植物基因工程和诱变技术有了很大发展 ,
并在改良植物品种 、 创建新型种质和发展育种新技术
等方面发挥 了重要作用 , 产生 了巨大的经济和社会效
益 26[ ] 。 相 比之下 , 有关螺旋藻等经济微藻的分子遗传学
和育种学 , 则一直缺乏系统而深人的研究 。 随着螺旋藻
应用领域的不断扩大和开发层次的逐渐深入 , 目前国
内外许多学者都投身于有关螺旋藻分子遗传学和育种
学及相关领域的研究 。 如秦松等正在构建双向载体 , 欲
将蓝藻植物型脂肪酸脱饱和酶基因导人螺旋藻 , 培育
抗冷新品种 , 以扩大养殖的地理范围 , 使其生产在我国
从南向北发展 。 同时 , 现代分子遗传学和基因工程及相
关科学技术极大地推动了诱变技术的迅猛发展 ,使在
分子水平上揭示突变的发生机理 、 突变体的快速鉴定
及实现定向诱变成为可能 。 因此 , 螺旋藻育种虽然起步
较晚 , 但 已有一个 良好的开端 , 预计在不远的将来 , 有
关螺旋藻的遗传特性会得到更全面而深人的了解 , 并
能在建立和完善螺旋藻育种学理论 与方法的基础上 ,
育出 品性兼优的生物技术 良种 , 给螺旋藻产业带来新
的发展机遇 。
参 考 文 献
川2[]
【3 ]
[ 4 j
[ 5 〕
[ 6 ]
[ 7 ]
L a n af 】o in L , O i af n it in 凡 eP itr s A e t a l . FE M S
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6 4 5一 6 4 8 . 12 ( 3 ) : 14 6一 15 0 .
微生物发酵农作物秸秆生产蛋白饲料的研究与应用
陈翠微 刘长江
(沈阳农业大学 沈阳 1 1 0 1 6 1 )
郭文洁 张博润
(中国科学院微生物研究所 北京 10 0 0 8 0)
关键词 : 微生物 , 发酵 , 秸秆 , 蛋白饲料
中图分类号 : 0 93 文献标识码 : A 文章编号 : 0 2 5 3一2 654 (2 00 0 ) 04一02 9 1一 3
我国是一个农业大国 , 据粗略统计 , 每年约产农作
物秸秆 6 亿吨 , 但 目前用作饲料的仅 占巧 % 左右 , 绝大
部分农作物秸秆仍直接还田或作燃料用 , 既造成资源
浪费 , 又污染环境 。 而开展利用微生物发酵农作物秸秆
生产蛋白饲料的研究 , 不仅可 以解决蛋白饲料的严重
不足 , 缓解人畜争粮的矛盾 , 促进畜牧业发展 ; 还可促
使我国的畜牧业结构从 “精料型 ” 向 “节粮型 ” 发展 , 既
有重要的理论指导意义和社会效益 , 又有巨大的经济
效益 。 本文将对这方面的研究概况作一简要介绍 。
1 微生物发酵农作物秸秆生产蛋 白饲料的研
究进展
微生物发酵农作物秸秆生产蛋 白饲料的研究是一
个世界性的研究课题 , 目前 已取得重大进展 。 据 日本 、
美国 、 俄罗斯等 国的研究 , 农作物秸秆经高温 、 高压蒸
煮 , 或以酸碱处理后 , 能有效地破坏木质素和蜡质对纤
维素的包裹 , 消除木质素 、 蜡质等对微生物发酵的负
效应 1[] 。 美国农业部下属研究所的研究人员从 20 多种
细菌中筛选出既可固定空气中的氮 , 又能利用农作物
秸秆的纤维作为唯一碳源的菌种 , 可使秸秆经发酵后
所含蛋白质 比原来提高 3一 4 倍闭 。 英国 iA ot n 大学的
研究者从农作物秸秆中筛选出一种真菌 , 属于白腐菌
属 。 这种真菌能降解木质素 , 但不能降解纤维素 。 用这
种真菌发酵农作物秸秆 , 能最大限度地提高农作物秸
秆的消化率 , 使农作物秸秆的消化率从 9 . 63 % 提高到
41
.
13 %
, 效果极为显著 , 目前已在进行中试实验 3[] 。 美
国科学家把木质素解聚糖酶基因和纤维素酶基因克隆
到酵母细胞中 , 构建成含有木质素解聚糖酶基 因和 纤
维素酶基因的酵母工程菌 , 这种酵母工程菌可 以直接
利用稻草和麦秸等农作物秸秆生产单细胞蛋白饲料叫 。
吉增福等人对秸秆的营养转化做了较详尽的研究和实
验 , 发现将纤维分解菌用于对玉米秸秆的营养转化 , 能
使营养水平低的秸秆的营养成分得到明显改善 。 其中 ,
粗蛋 白由 5 . 2 % 提高到 2 4 . 62 % , 粗脂肪由 0 . 67 % 提高
到 12 . 52% ,成为可替代 巧% 一 20 % 的混合 日粮用于猪
的饲料 { , ] 。
* 联系作者 。
收稿日期 : 1 99 9 { 5一 13 , 修回日期 : 19 9 9司 8一 2 8