全 文 ：　第 60 卷　第 11 期　 　化　工　学　报　　　 　　　　Vo l.60　No.11
　 2009年 11 月　 　CIESC　Journal　 　　November　2009
研究简报 响应面法优化螺旋藻中叶绿素的
超声提取工艺
童　洋 , 肖国民 , 潘晓梅
(东南大学化学化工学院 , 江苏 南京 211189)
关键词:螺旋藻;叶绿素;超声提取;响应面法
中图分类号:TQ 95　　　　　　文献标识码:A 文章编号:0438-1157 (2009)11-2813-07
Optimization of ultrasonic extraction of chlorophylls from
Spirulina platensis by response surface methodology
TONGYang , XIAO Guomin , PANXiaomei
(S chool o f Chemistry and Chemical Engineering , S outheast University , Nanj ing 211189 , J iangsu , China)
Abstract:Chlo rophy lls we re ext racted by using ult rasonic f rom S pirul ina p latensis.Sing le factor
examination and response surface analy sis experiments w ere adopted to invest igate the effects o f ex t raction
t ime , ex t raction so lvent , solvent concentration , ratio of liquid to solid and ext raction g rade.The results
showed that the optimal pro cess parameters for this me thod we re:ext ract ion time of 56.5 min , ethanol
concentration of 48.3%(vol)o f ethanol/acetone so lvent , and ratio of liquid to solid o f 7.9 m l·g-1 .The
optimized chlorophylls ex t raction y ield w as 1.28%.The comparison experimental resul ts indicated that the
yield of chlorophylls by ult rasonic ext raction w as higher than that obtained from conventional solvent extraction.
Key words:S pirulina platensis;chlo rophyl ls;ult rasonic ex t raction;response surface methodolog y
　　2009-07-13收到初稿 , 2009-08-20收到修改稿。
联系人:肖国民。第一作者:童洋 (1986—) , 男 , 硕士研
究生。
基金项目:国家高技术研究发展计划项目 (2009AA03Z222 ,
2009AA05Z437);江苏省六大人才高峰资助项目 (2008028)。
　
引　言
螺旋藻 (S pirul ina platensis)是一种丝状原
核藻类 , 富含藻蓝蛋白 、叶绿素 、胡萝卜素及不饱
和脂肪酸等多种生物活性成分[ 1-3] 。
叶绿素是绿色植物进行光合作用的主要色素 ,
常见的有叶绿素 a 、叶绿素 b等 。叶绿素广泛应用
于食品 、医药等领域。近年来 , 以叶绿素为起始原
料 , 利用其降解产物焦脱镁叶绿酸甲酯 (methy l
pyropheophorbide a , MPPa)进行结构修饰 , 合成
并筛选叶绿素类第三代光动力疗法 (pho todynamic
therapy , PDT)抗癌靶向药物的研究见诸报道[ 4-5] 。
　　Received date:2009-07-13.
Corresponding author: Prof. XIAO Guomin , xiaogm
@seu.edu.cn
Foundation items:suppo rted by the Hig h-tech Research and
Development Program of China (2009AA03Z222, 2009AA05Z437) and
th e “S ix Talen ts Pinnacle Program” of Jiang su Province of Chin a for
Fin ancial (2008028).
　
叶绿素提取主要采用有机溶剂提取法[ 6-7] 、 超
声提取法[ 8-9] 和超临界 CO 2 萃取法[ 10-11] 等 , 提取原
料一般为绿色植物叶片[ 12] 、 蚕沙[ 13-14] 、 海藻[ 15-16]
等。有机溶剂提取法存在溶剂消耗大 、 提取率低等
缺点;本课题组采用美国 Thar 设备公司的 SFE-
100-2-base 型号的超临界萃取装置进行螺旋藻中叶
绿素的提取时发现 , 提取过程须在很高压力下进
行 , 且叶绿素提取率低。而超声提取法则具有提取
率高 、 溶剂用量少 、不需加热 , 适于热敏性物质提
取的优势。
本文利用超声提取法从螺旋藻中提取叶绿素 ,
该法目前尚未见报道 , 且叶绿素提取率明显高于其
他提取原料。同时 , 以叶绿素的提取率为响应因子 ,
在单因素实验的基础上对超声提取过程中的各主要
因素采用响应面法 (response surface methodology ,
RSM)进行了优化 , 为产业化提供理论保障 。
1　仪器与材料
1.1　材料及试剂
螺旋藻 (食用级)购于江苏东方农物化学公
司 。乙醇购于国药集团化学试剂有限公司 , 分析
纯 。丙酮购于国药集团化学试剂有限公司 , 分
析纯。
1.2　实验仪器
JA2003N 型电子天平 , 购于上海精密科学仪
器有限公司;KH5200B 型数控超声波清洗器 (超
声功率 200 W , 超声频率 40 kHz), 购于昆山市超
声仪器有限公司;UV-2450 型紫外可见分光光度
仪 , 购于日本岛津公司 。
2　实验方法
2.1　叶绿素提取
准确称取螺旋藻粉 5.00 g , 加入一定量的提取
溶液 , 在超声波条件下提取叶绿素 , 然后抽滤 , 收
集滤液 , 将滤液稀释 50倍 , 进行吸光度检测。全
部实验在避光或弱光条件下进行 。
2.2　叶绿素提取率测定
准确吸取 1 m l叶绿素提取液 , 稀释至 50 ml ,
分别测定 645 、 663 nm 处的吸光度。
叶绿素 a 浓度 (mg ·L-1)
Ca = 12.7A663 -2.69A645 (1)
叶绿素 b浓度 (mg ·L-1)
Cb =22.9A645 -4.68A663 (2)
叶绿素提取率 (%)
y =(Ca +Cb)Vn
m
×100% (3)
式中　A645 、 A663分别为叶绿素提取液在 645 、 663
nm 处的吸光度;V 为提取液的体积 , L;n为稀释
倍数 , 本文为 50倍;m为螺旋藻质量 , mg 。
2.3　单因素实验
分别以不同的超声提取时间 、 提取溶剂 、溶剂
浓度 、料液比和提取级数等为因素 , 考察各因素对
叶绿素提取工艺的影响。
2.4　响应面法优化实验
在单因素实验的基础上 , 以超声提取时间 、 乙
醇浓度和料液比等因素作为考察对象 , 以叶绿素提
取率为响应值 , 采用 Design Expert 7.0.0 统计分
析软件的响应面法安排实验 , 以获取最优化工艺
参数 。
3　结果与讨论
3.1　单因素实验结果
3.1.1　超声提取时间对叶绿素提取率的影响　准
确称取 5.00 g 螺旋藻粉 6份 , 分别置于 100 m l锥
形瓶中 , 然后分别加入无水乙醇 40 m l , 超声提取
10 、 20 、 30 、 40 、 50 、 60 min , 抽滤 , 收集滤液 。
将滤液稀释 50倍 , 进行吸光度检测。
不同超声提取时间对螺旋藻中叶绿素提取率的
影响如图 1所示 。由图可知 , 随着超声提取时间的
增加 , 叶绿素提取率逐渐升高 , 当达到 50 min时 ,
叶绿素提取率达到最大;再延长超声提取时间 , 叶
绿素提取率有所下降 , 这可能是因为随着超声提取
时间的增加 , 超声的热效应变大 , 使得热敏性物质
叶绿素发生一定的降解。
图 1　超声提取时间对叶绿素提取率的影响
F ig.1　Effect o f ext raction time on
ex traction y ield o f chlorophy lls
　
因此 , 选用 50 min 作为超声提取时间的最优
值 , 同时 , 超声提取时间选择在 40 ～ 60 min 做进
一步优化 。
3.1.2　超声提取溶剂对叶绿素提取率的影响　准
确称取 5.00 g 螺旋藻粉 5份 , 分别置于 100 m l锥
形瓶中 , 然后分别加入无水乙醇 (A)、无水丙酮
·2814· 化　工　学　报　 　第 60 卷　
(B)、乙醇/丙酮 (体积比为 1∶1)(C)、 乙醇/水
(体积比为 1∶1)(D)、 丙酮/水 (体积比为 1∶1)
(E)40 ml , 超声提取 50 min , 抽滤 , 收集滤液。
将滤液稀释 50倍 , 进行吸光度检测 。
不同超声提取溶剂对螺旋藻中叶绿素提取率的
影响如图 2所示。由图可知 , 乙醇/丙酮 (体积比
为 1∶1)作为超声提取溶剂时 , 叶绿素提取率最
高 , 无水乙醇次之 。可能的原因是混合溶剂的协萃
效应使得叶绿素的溶解性能优于单一溶剂 , 同时 ,
叶绿素是一种双羧酸酯 , 不溶于水 , 从而使得含水
溶剂的提取率相对较低 。
因此 , 选用乙醇/丙酮混合溶剂作为超声提取
溶剂。
图 2　提取溶剂对叶绿素提取率的影响
Fig.2　Effect o f ex traction solvent on
extr action yield of chlo rophylls
　
3.1.3　乙醇浓度对叶绿素提取率的影响　准确称
取 5.00 g 螺旋藻粉 5份 , 分别置于 100 ml锥形瓶
中 , 然后分别加入乙醇体积分数为 10%、 30%、
50%、 70%、 90%的乙醇/丙酮溶液 40 m l , 超声
提取 50 min , 抽滤 , 收集滤液。将滤液稀释 50
倍 , 进行吸光度检测。
不同乙醇浓度对螺旋藻中叶绿素提取率的影响
如图 3所示。由图可知 , 随着乙醇体积分数的增
加 , 叶绿素提取率逐渐升高 , 当达到 50%时 , 叶
绿素提取率达到最大;再增加乙醇体积分数 , 叶绿
素提取率下降 , 这可能是因为混合溶剂中乙醇体积
分数很大时 (如 90%), 混合溶剂接近单一溶剂 ,
使得混合溶剂的协萃作用减弱。
因此 , 选用乙醇体积分数为 50%作为混合溶
剂配比的最优值 , 同时 , 乙醇体积分数选择在
40%～ 60%做进一步优化。
3.1.4　液料比对叶绿素提取率的影响　准确称取
5.00 g 螺旋藻粉 5份 , 分别置于 100 m l锥形瓶中 ,
然后分别加入乙醇体积分数为 50%的乙醇/丙酮溶
图 3　乙醇浓度对叶绿素提取率的影响
F ig.3　Effec t o f ethano l concent ration on
ex traction y ield o f chlorophy lls
　
液 20 、 30 、 40 、 50 、 60 ml , 超声提取 50 min , 抽
滤 , 收集滤液。将滤液稀释 50 倍 , 进行吸光度
检测 。
不同液料比对螺旋藻中叶绿素提取率的影响如
图 4所示 。由图可知 , 随着液料比的增加 , 叶绿素
提取率逐渐升高 , 当达到 8 m l· g-1时 , 叶绿素提
取率达到最大;再增加液料比 , 叶绿素提取率下
降 , 这可能是因为提取溶剂量加大时 , 有利于叶绿
素的溶出 , 使得叶绿素的提取率增加 , 但当提取溶
剂量太大时 , 叶绿素的溶出已基本达到平衡 , 再加
入溶剂 , 提取效果并不明显;同时 , 大量的溶剂会
影响提取体系的传热和传质 , 反而不利于叶绿素的
提取 。此外 , 溶剂量过大 , 还会导致生产成本和溶
剂回收成本的增加。
因此 , 选用 8 m l· g-1作为叶绿素提取中液料
比的最优值 , 同时 , 液料比选择在 6 ～ 10 m l· g-1
做进一步优化。
图 4　液料比对叶绿素提取率的影响
F ig.4　Effect o f ratio of liquid to so lid on
ex traction y ield o f chlorophy lls
　
3.1.5　提取级数对叶绿素提取的影响　准确称取
5.00 g 螺旋藻粉 , 置于 100 ml锥形瓶中 , 然后加
入乙醇体积分数为 50%的乙醇/丙酮溶液 40 ml ,
超声提取 50 min , 然后抽滤 , 滤渣再加入 40 ml提
·2815·　第 11 期　 　童洋等:响应面法优化螺旋藻中叶绿素的超声提取工艺
取溶剂进行第二级提取 , 提取方法同第一次。如此
反复 , 直至萃取液的颜色接近无色 , 可以认为已完
全提取 。收集各次的滤液。分别将滤液稀释 50倍 ,
进行吸光度检测。
不同提取级数对螺旋藻中叶绿素提取率的影响
如表 1所示。
表 1　提取级数对叶绿素提取率的影响
Table 1　Ef fect of extraction grade on
extraction yield of chlorophylls
Ext ract ion g rade Ext raction yield/ %
1 1.23±0.02
2 0.20±0.01
3 0.04±0.01
由表 1可知 , 随着提取级数的增加 , 叶绿素的
提取率逐次降低。将前 3次提取的总回收率设定为
100%, 则第 1次的回收率为 84%;前两次的累积
回收率在 97%左右。考虑到增加提取级数 , 会增
加生产成本和溶剂回收成本 , 提取级数选择 1次较
合理。规模生产时亦可考虑提取 2次 , 第 2次的提
取液作为下一批次的提取溶剂使用 , 以降低成本。
3.2　响应面分析法优化工艺条件
3.2.1　响应面分析因素水平的选取　综合单因素
实验结果 , 选取超声时间 (a)、乙醇体积分数 (b)
和液料比 (c) 3 个因素进行中心组合设计
(central composi te design , CCD)(取中心点为 6),
利用 Design Expert 7.0.0 软件进行数据拟合 , 以
+1 、 0 、 -1分别代表自变量的高 、 中 、 低水平 ,
因子编码及水平见表 2。
表 2　响应面分析因素水平实验设计
Table 2　Experiment design of three factors
and five levels of RSM
Level
Extraction time
(a)/min
Ethanol
concentration(b)/ %
Rat io of liquid to
solid(c)/ml· g-1
-1.68 33.2 33.2 4.6
-1 40.0 40.0 6.0
0 50.0 50.0 8.0
+1 60.0 60.0 10.0
+1.68 66.8 66.8 11.4
3.2.2　响应面分析方案及结果　以 A=(a-50)/
10 , B=(b-50)/10 , C =(c-8)/2为自变量 , 以
叶绿素提取率为响应值 (Y), 进行响应面分析实
验 。表 3给出由中心组合设计的实验结果及其预
测值。
表 3　响应面分析方案及实验结果
Table 3　Experiment design and results of
response surface methodology
No. A/min
B
/ %
C
/m l· g -1
Y/ %
Actual
value
Predicted
valu e
1 -1 -1 -1 0.92±0.02 0.90
2 1 -1 -1 1.13±0.01 1.21
3 -1 1 -1 0.97±0.02 1.02
4 1 1 -1 1.18±0.03 1.17
5 -1 -1 1 0.98±0.02 1.00
6 1 -1 1 1.21±0.02 1.18
7 -1 1 1 1.17±0.03 1.11
8 1 1 1 1.09±0.01 1.13
9 -1.68 0 0 0.87±0.03 0.89
10 1.68 0 0 1.20±0.04 1.17
11 0 -1.68 0 1.14±0.01 1.12
12 0 1.68 0 1.18±0 1.18
13 0 0 -1.68 1.13±0.01 1.08
14 0 0 1.68 1.10±0.02 1.13
15 0 0 0 1.20±0.02 1.23
16 0 0 0 1.23±0.01 1.23
17 0 0 0 1.22±0.01 1.23
18 0 0 0 1.24±0.01 1.23
19 0 0 0 1.23±0.02 1.23
20 0 0 0 1.23±0.01 1.23
对实验数据进行多项拟合回归 , 建立回归方程
Y = 1.23 +0.082 A +0.017B +0.015C-0.039AB -
0.034AC -3.75 ×10-3BC-0.070A2 -
0.026B2 -0.042C2
对模型进行方差分析 , 结果见表 4。
表 4　回归模型方差分析
Table 4　Analysis of variance for response
surface quadratic model
S ou rce
Sum of
squares
Degree of
f reedom
M ean
square
F-valu e P-valu e
m odel 0.21 9 0.024 10.95 0.0004
A 0.093 1 0.093 42.74 <0.0001
B 0.004 1 0.004 1.90 0.19
C 0.003 1 0.003 1.35 0.27
AB 0.012 1 0.012 5.54 0.040
AC 0.009 1 0.009 4.20 0.068
BC 0.000 1 0.000 0.052 0.82
A2 0.071 1 0.071 32.83 0.0002
B2 0.010 1 0.010 4.52 0.059
C2 0.025 1 0.025 11.72 0.0065
residual 0.022 10 0.0022
lack of f it 0.021 5 0.0041 21.82 0.0021
pu re er ro r 0.00095 5 0.00019
cor total 0.24 19
R2 0.91
Ad j R 2 0.83
C.V./ % 4.12
·2816· 化　工　学　报　 　第 60 卷　
　　由表 4可知 , 本实验所选模型不同处理间差异
极显著 (模型的 P 值<0.05), 说明回归方程描述
各因子与响应值之间的关系时 , 其应变量与全体自
变量之间的线性关系是显著的 , 即这种实验方法是
可靠的;变异系数 (C.V.值 4.12%)较低 , 说明
实验有良好的稳定性;模型的相关系数 R2 =0.91 ,
说明该模型可靠性较好 。
从回归方程模型因变量的方差分析可知 , 模型
一次项 A (P <0.0001)差异极显著 , B (P =
0.19), C (P =0.27)差异不显著;交互项 AB
(P=0.040), AC (P=0.068)差异显著 , BC (P=
0.82)差异不显著;二次项 A2 (P =0.0002), C2
(P=0.0065)差异极显著 , B2 (P =0.059)差异
显著。表明超声时间对叶绿素提取率的主效应明
显 , 且在超声时间 、乙醇体积分数之间和超声提取
时间 、 液料比之间存在交互作用。依据系数值
A=0.082 , B=0.017 , C=0.015 , 可知因素的主
效应关系为:超声提取时间>乙醇体积分数 >液
料比。
图 5　超声提取时间和乙醇体积分数对
叶绿素提取率的响应面图
F ig.5　Three-dimensional plo t of effect of
ex traction time and ethano l concentration
on ex traction yield
3.2.3　响应面图分析　由回归方程绘制的响应曲
面分析图如图 5 ～图 7所示 。响应面可直接反映出
各因子对响应值的影响大小 。
从图 5结果可知 , 在实验范围内 , 乙醇体积分
数不变 , 随着超声时间的增加 , 叶绿素提取率增加
到最大值然后有所下降;超声提取时间不变 , 乙醇
体积分数增加 , 叶绿素提取率逐渐增大然后下降。
这与单因素实验分析时的结果相吻合 。叶绿素提取
率的变化速率显示超声提取时间主效应大于乙醇体
积分数 , 与统计结果相符 。
从图 6 结果可知 , 在实验范围内 , 液料比不
变 , 随着超声提取时间的增加 , 叶绿素提取率增加
到最大值然后有所下降;超声提取时间不变 , 液料
比增加 , 叶绿素提取率逐渐增大然后下降。这与单
因素实验分析时的结果相吻合 。叶绿素提取率的变
化速率显示超声提取时间主效应大于液料比 , 与统
计结果相符。
从图 7 结果可知 , 在实验范围内 , 液料比不
变 , 随着乙醇体积分数的增加 , 叶绿素提取率增加
到最大值然后有所下降;乙醇体积分数不变 , 液料
比增加 , 叶绿素提取率逐渐增大然后下降。这与单
因素实验分析时的结果相吻合 。叶绿素提取率的变
化速率显示乙醇体积分数主效应大于液料比 , 与统
计结果相符。
·2817·　第 11 期　 　童洋等:响应面法优化螺旋藻中叶绿素的超声提取工艺
3.2.4　最优工艺条件求取　为了进一步确证最佳
点的值 , 对回归方程取一阶偏导等于零 , 可以得到
曲面的最大点 , 求导方程整理得
0.082-0.039B -0.034C-0.140A =0
0.017 -0.039A -0.00375C-0.052B =0
0.015 -0.034A -0.00375B -0.084C =0
求解方程组得:A =0.647;B =-0.135;
C=-0.076。最后求得超声提取时间 、 乙醇体积
分数 、液料比的最适值分别为:a=56.5 min , b=
48.3%(体积), c=7.9 ml · g-1 。此时 , 叶绿素
的最大提取率为 1.26%。
经过中心组合设计优化提取条件 , 最佳的提取
工艺参数为:超声提取时间为 56.5 min 、 乙醇/丙
酮混合溶剂中乙醇体积分数为 48.3%、 液料比为
7.9 m l · g-1 , 此时叶绿素提取率理论值可达到
1.26%。验证实验表明 , 提取率为 1.28%, 与理
论值相符。因此 , 采用响应面法得到的提取条件参
数相对较为可靠 , 具有使用价值 。
3.3　超声提取法与常规溶剂提取法的对比实验
前面实验已确定了超声提取的最优工艺条件 ,
利用这些参数与常规溶剂提取法进行对比 。
准确称取5.00 g 螺旋藻粉 2份 , 分别置于 100
m l锥形瓶中 , 然后加入乙醇体积分数为 48.3%的
乙醇/丙酮混合溶液 39.5 ml (液料比为 7.9 m l·
g-1), 分别提取 56.5 min 和 10 h , 然后抽滤 , 收
集滤液 。将滤液稀释 50倍 , 进行吸光度检测。实
验结果见表 5。
表 5　超声提取法与常规溶剂提取法的对比实验结果
Table 5　Comparison of ultrasonic and conventional
solvent extraction technology
Ext raction techn ology E xt raction yield/ %
u lt ras onic ext ract ion 1.28±0.03
conven tional solvent ext raction 0.08±0.01①
0.74±0.03②
　　① Ext raction t ime=56.5 min.
② Ext raction t ime=10 h.
由表 5可知 , 超声提取螺旋藻中的叶绿素 , 其
提取率远远优于常规溶剂提取法 。可能的原因是超
声波的空化效应使得螺旋藻细胞被均匀破坏 , 叶绿
素较易溶出 , 而常规溶剂提取法尽管提取很长时间
(10 h), 但细胞结构没有遭到破坏 , 叶绿素传质阻
力较大 , 从而提取率较低。
4　结　论
(1)以螺旋藻为原料 , 采用超声提取的方法提
取叶绿素 , 叶绿素提取率可达 1.28%。
(2)通过单因素实验 , 得到较优的工艺条件:
超声提取时间为 50 min , 提取溶剂为乙醇体积分
数为 50%的乙醇/丙酮溶液 , 液料比为 8 m l·g -1 ,
提取级数为一级 。
(3)在单因素实验的基础上 , 选取超声提取时
间 、 乙醇体积分数和液料比 3个因素进行中心组合
设计 , 使用 Design Exper t 7.0.0软件进行数据拟
合 , 建立了超声提取螺旋藻中叶绿素的工艺数学模
型 Y =1.23 +0.082A +0.017B +0.015C -
0.039AB-0.034AC-3.75×10-3 BC-0.070A2 -
0.026B2 -0.042C2 。回归分析表明 , 该模型的稳
定性较好;通过模型系数显著性检验 , 得到因素的
主效应关系为:超声提取时间>乙醇体积分数>液
料比 。
(4)利用由响应面法得到的模型进行探讨 , 得
到螺旋藻中叶绿素的超声提取过程优化的工艺条
件:超声提取时间为 56.5 min 、 乙醇/丙酮混合溶
剂中乙醇体积分数为 48.3%、 液料比为 7.9 ml ·
g-1 , 此时叶绿素提取率理论值可达到 1.26%。验
证实验表明 , 提取率为 1.28%, 与理论值相符 。
因此 , 采用响应面法获得的螺旋藻中叶绿素的超声
提取工艺条件 , 数据准确 , 科学可行。
(5)超声提取法与常规溶剂提取法的对比实验
结果表明 , 采用超声提取工艺提取螺旋藻中的叶绿
素 , 提取率远远优于常规溶剂提取工艺 。
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