全 文 ：R箫黯白
螺旋藻的系统分类学及基因工程研究进展 “
A D VA N E S I N S Y CS T E M A T I CS A N D GE N E E N I N E E GRI N GO F
民两厂“ l ina
徐 虹 柯珍 恋 章 军
(厦门大学生命科学学院 36 1 05 )
肚螺旋藻 (枷门戒二 )是众所周知的优良天然营养
源 , 因其具有较高的营养价值和独特的药理作用而受
到人们的广泛关注 。 在过去的 20 a 中 , 螺旋藻在营养
学和药理学方面的研究取得了较大进展 , 工业化生产
也具有了相当的规模 , 但其在分子生物学和基因工程
方面的研究却相对滞后 。 令人欣慰的是 , 虽然螺旋藻
遗传学和基因工程方面的研究起步较晚 , 但世界各地
的研究者仍在该领域取得了显著成果 。
螺旋藻系统分类学研 究
螺旋藻在分类学 L属于蓝藻门 , 颤藻目 , 颤藻科 ,
螺旋藻属 。 这个属的学名是 “ S阿八“ i an ” , 取 “ 卷曲” 一
意 , 但有的文献中也写成 “月洲六m俩 ra ” (节旋藻 ) , 把这
两个属名混用 。 其实 , 关于 枷耐 ina 和 八认阳俩m 是
属于同一个属 . 还是分别成为独立的属 , 一直存在争
议 。 著名蓝藻分类学家 eG i决 r 在其所著《蓝藻纲 ) 中 ,
将这两个属并为一属即 导向汉ian 。 以后这种划分一直
被广泛应用 。 但现在研究表明 , 虽然二者形态极为相
似 , 都由单列细胞组成不分枝的丝状体 , 都呈有规则
的螺旋弯曲 , 但其显微形态和细胞亚显微结构仍有差
别 :前者细胞横壁不明显 , 横壁处不收溢 ;后者横壁清
晰可见 , 有收溢 。 同时 , 二者在基因碱基组成等遗传背
景方面也存在较大差异 , 户月坛刀脚护视 的 G / C 含量为
4 4
.
3 %
, 而 S加翔左。 的 G C/ 含量可达 53 . 6% 川。 在遗
传学研究中 , 常以保守性很高的核糖体蛋白和 r l补认
作为可靠的分子分类依据 。 不同地理起源的螺旋藻 ,
即使 16 s r RNA 完全相同 , 165 r RNA 与 23 s r RN A 的间
隔序列也不一样 , 可通过分析它们的基因序列加以
区分 。 N iel se n 等人 19 94 年对 争耐 ina 和 为认川确沁
的 16s r砂叭 基因序列进行比较考证后 , 发现二者关
系并不密切 , 而 16 5 和 2 3 , r RNA 基因之间的插入序
列也有所不同 , 前者只有 t砂叭 ( n e )基因 , 后者则包括
了 tR州A ( n e ) 和 tR NA ( lA a ) 基 因 。 据此他们认为 ,
举耐i na 和 J如六用彩八 2 分属于颤藻科不同的属 , 它们
是有区别的 。 根据大量的研究成果 , 现在人们普遍认
为八艺六功俩m 应从 5坏八汉ina 中独立出来 , 自成一属 。 目
前 , 国内外广泛用于工厂化生产的钝顶螺旋藻和极大螺
旋藻经 K山 . r e l 等人的仔细研究认为 , 它们有薄的细
胞横壁 , 横壁处可见收溢 , 应划归节旋藻属 , 学名应更改
为钝顶节旋藻 (庵艺人阳彩八2 脸枷 i、 ) 和极大螺节旋藻
(月月六。脚八2 、 ~ ) 。 但由于螺旋藻这个名称沿用 己久 , 考虑到应用的方便 , 仍暂保留过去的名称川 。
正是由于核糖体蛋 白在进化上的高保守性 , 螺
旋藻的许多核糖体蛋 白基 因才能根据其他生物相应
的 已知序列顺利地得到克隆 。 通过对它们的同源性
比较 , 可以进一步确证螺旋藻与其他生物的进化关
系 , 探索螺旋藻的进化地位 。 下场 in 等人所在的实验
室在这方面做了较深入的工作 。 他们发现 , 螺旋藻的
许多核糖体蛋白基因 , 如 srP Z 、 sft 和包括 rP S 12 、 : p s7 、
fu
s
、
:
of 4 个基因的 str 的操纵子 , 在基因序列和排列
方式方面与大肠杆菌有很高的同源性 ; 另外 , 螺旋
藻 str 操纵子 与烟草 、 玉米等高等植物叶绿体基因同
样具有很高的同源性 (表 1 ) 。 这一发现为认为叶绿
体是由光合自养蓝藻演化而来的内源共生学说提供
了一个有力证据 。 值得一提的是 , 螺旋藻另一个核糖
体蛋白基因 r’sP l0 的排列方式和大肠杆菌的不同 , 但
这种排列方式却存在于 目前所分析过的所有古生物
基因 以及 〔扮z n `洲“湘 加八动 u 反 内的共生体 (蓝色小
体 ) 中 , 作者认为螺旋藻中 rsP ol 的这种排列方式可
能代表一种原始的基因水平 。
2 螺旋藻基 因克隆研 究进展
螺旋藻因其较高的蛋白质含量 , 合理的氮基酸组
成及含有多种生物活性物质 , 而成为最具开发潜力的
基因组 。 但由于遗传学背景及分子生物学基础不足 ,
* 国家 8 63 计划资助项 目 81 9 (阵0 3 号。
收稿 日期 : 21洲洲目】-70 ;2 修 回日期 : 2 J 洲月琅20
国 海洋科学 2/ 0 1 年 /第 25 卷 /第 9 期
R器黯画
表 l 螺旋藻 s t r 操纵子表达产物与其他生物相应蛋白同
源性的比较
基因来源 15 2 75 E F一 G E F一 T u
Es c h
er i,h i a f
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之
7 3
.
2 5 2
.
2 5 7
.
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5 4 8
.
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.
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.
9
E嗒 l f n u e h lo or p la s t 7 5 . 8 4 4 . 9 / 7 7 . 5
从co t i a n a e h l o r o p l a s t 8 1 . 3 5 1 . 5 / /
人铂 cr 儿a , , t i a 加沙 n o rP h a
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h l o or p l a
s t 7 9
.
7 5 2
.
3 / /
八」甘i二 e e h lo r o P la s t 8 1 · 3 4 8 . 7 / /
螺旋藻的基因工程研究 只能从单基因突破 。 螺旋藻基
因的克隆和功能鉴定主要有以下几种方法 : ( 1) 根据
与特定的大肠杆菌突变株功能互补测定 。 ( 2) 利用其
他生物的同缘 I )N A 探针杂交 , 从基因文库中分离筛
选基 因。 ( 3) 根据 已知的高保守性基因序列设计引物 ,
通过 代 {R 扩增 目的基因 。 ( 4) 通过目的基 因自身表达
的一些容易筛选或检测的蛋白质来鉴定 。
螺旋藻的研究大部分以钝顶螺旋藻为材料 , 到 目
前为止 , 已有 30 余种钝顶螺旋藻的结构基因被鉴定 、
克隆和测序 (表 2) 。
随着 人们对钝顶螺旋藻遗传背景的逐渐 了解和
螺旋藻重组系统建立 , 相信不久钝顶螺旋藻的基因组
图谱就能建立起来 。 这样 , 人们便能更好地利用其遗
传学重组机制 , 研究螺旋藻基因的调控机理 , 发展螺
旋藻的基 因工程 。
3 螺旋藻的遗传转化研 究
只需光 、 无机盐和适当的温度既能满足生长需要 , 并
且适于静止 、 连续等多种方式培养 。 螺旋藻正是以其
自身的优势 , 向人们展示 了它作为生物反应器的广阔
应用前景和 巨大潜力 。
但是 , 尽管有不少研究者在螺旋藻基因工程方面
开展了大量的工作 , 进行了不懈的努力 , 但其进展依
然缓慢 。 迄今为止 , 还未见有外源基因成功转化螺旋
藻的报道 。 其原因除了研究者们公认的 , 由于螺旋藻
基因组自身的完美性和复杂性而对外源基因产生强
烈的排斥作用外 , 还有如下几点 :
( l) 螺旋藻细胞内存在多种限制性内切酶 , 阻止
r 外源 l》 叭 的转入和整合。 目前已发现螺旋藻细胞
中至少存在 4 种限制性核酸内切酶 : 印 a l 、 5 1〕 a l 、
SP
a
m
、 印 a w , 分别是 tT h 1 1 1 1 、 1、 a l 、 1、 a l 、 H in d
m的同裂酶 3I] , 它们在 25 一 37 ℃ 均保持较高的内切
酶活性 。 对螺旋藻来说 , 这是一种自我保护机制 , 能防
止外源 f别 A 的侵入 。 但对研究者而 言 , 这却成了螺旋
藻基因转化的一 个重要障碍 。 当外源基因刚转入细
胞 , 还未来得及整合即被内切酶降解 , 根本无法在细
胞内稳定存在和表达 。
( 2) 缺乏 良好的重组系统 。 外源基因要在螺旋藻
中稳定存在和表达 , 必须整合到螺旋藻染色体或内源
质粒上 , 随它们的复制而复制 。 蓝藻基因工程中常用
的表达载体为穿梭质粒和同源重组质粒 。 穿梭质粒的
构建需要内源质粒的复制起始子 , 同源重组质粒的构
建则需要螺旋藻染色体 I )NA 或质粒的同源片段 , 外
源基因通过同源片段 间的交换重组而定位整 合到染
色体或内源质粒 仁。 螺旋藻缺乏内源质粒 , 到 目前为
螺旋藻作为一种基
因转化受体 , 与大肠杆菌 、
酵母 、 植物和动物相比 , 它
除了具有高安全性 、 高营
养性和高药用价值外 , 还
有许多独到之处 : ( l) 基因
组结构简单 , 除了裸露的
染色体 〔则A 外 , 不含叶绿
体 1》 IA 和线粒体 D NA , 便
于基 因分析 。 ( 2) 细胞内具
有使蛋白质高效表达的机
制 , 能容受高浓度的单一
蛋白 , 内源蛋白更新速度
慢 , 对外源蛋白质容受力
高。 ( 3) 繁殖迅速 , 再生快 ,
培养条件简单 , 成本低廉 ,
表 2 螺旋燕 SP i r ul ian lP a ten is : 已克隆的部分基因及其功能
基因名称 编码功能
A h s
a P e A
,
B
,
C
a t P C
e p e A
,
e p e B
e P e H
.
I
,
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e y e A
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乙酞轻基酸合成酶
别藻蓝蛋白 。 、 p 、 ,
A T P
a s e下 亚基
c
一藻蓝蛋白 。 、 俘亚基基 因
C
一藻 蓝蛋 白连接多肤
c A M P
a s e
△ 12 , △ 9 , △ 6 脂肪酸脱饱和酶
2 3 -kD 丝氨酸酷酶
谷氨酸胺合成酶
日一异丙基苹果酸脱氢酶
八氢番茄红素合成酶
R ub p 梭化酶大 、 小亚基
重组蛋白酶
D N A 结合反应调节因子
核糖体小亚基蛋白 s2 , s7 , 51 2
16 5 r R N A
t R N A ( Il
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)
、
2 3 5
r
R N A
延伸因 户 E F T s , E F 一 T u , E F 一 G
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仁2 ]
随 In n e 段 i e n e e s /V 6 1 . 2 5 . 从 〕 . 9 / 2 00 1 自
R器黯回
止还没有见到关于螺旋藻质粒的报道 。 本实验室也曾
用多种方法试图发现和提取螺旋藻质粒 , 但均未成
功 。 这就使得外源基因很难以质粒的形式存在于螺旋
藻中 。 构建同源重组质粒所选择的同源片段一般为宿
主的非看家基因 , 以免破坏宿主细胞基因的正常表
达 。 但由于 目前螺旋藻遗传背景资料相当匾乏 , 已知
的基因较少且均为功能基因 , 因而同源重组缺乏好的
靶位 。
( 3) 未建立有效的筛选标记系统 。 螺旋藻对基因
工程常用的筛选标记 Eh l (卡那霉素 ) 、 N氏 〕 (新霉素 ) 、
AP (氨节青霉素 ) 等抗生素具有很高的抗性 , 只对 卜肠1
(潮霉素 ) 、 〔h l (氯霉素 )比较敏感 110 ’。 这样 , 遗传转化
中用于筛选转化藻的抗生素就局限于 片 11 、 Ch l , 或者
只能另辟蹊径 。
虽然螺旋藻遗传转化存在种种困难 , 但也并非不
能克服 。 ( )心 等发现用无地 , 十的 乙拭〕u k 培养基培养螺旋藻 , 能大大降低其胞内和胞外 〕 劝场 se 活性 ’川。
本实验室的研究结果也表明 . 采取高浓度 Em人 (l . 0
n 刃 x ) l / I 以上 )或低温处理螺旋藻 , 也能显著抑制其胞
内 「r 心、 s e 活性 。 虽然螺旋藻遗传转化缺乏行之有效
的手段和方法 , 但秦松等 19 % 年 , 章军 14 等用溶菌酶
和超声波等方法相继制备了螺旋藻等丝状蓝藻原生
质体 , 为基因转移系统及细胞融合育种研究创造了条
件 。 外源基因能否在螺旋藻细胞内稳定遗传和表达 ,
一直是研究者们关注的问题 。 要解决这一难题必须建
立可靠的 I别A 重组系统 。 根据蓝藻质粒具同源性的
特点 , 可尝试用其他蓝藻质粒构建螺旋藻的穿梭表达
载体 。 本实验室曾利用织线藻 (月` ` ot n ~ 八〕。 ` n二 )的小质粒 p PRS I 构建的穿梭表达载体成功地转化聚
球藻 5州“ 丙。 ` 。 “ us s p . R I : 7942 , 目前正尝试用该质粒
转化螺旋藻 。 另外 , 依据同源重组机制 , 将外源基因整
合到染色体上 , 是使外源基因稳定遗传和表达的最好
方式 。 但该方式的实现还有待于螺旋藻分子遗传学研
究的进展 , 如更多基因的克隆测序及功能的鉴定等 。
4 螺旋藻基因工 程研 究展望
综上所述 , 螺旋藻基因工程的研究任重而道
远 , 要在该领域取得较大进展和突破 , 仍需广大研究
者的不断努力 。 目前 , 螺旋藻基因工程的研究主要面
临两大任务 :
( l) 加强螺旋藻分子遗传学的研究 , 分离克隆更
多的基因 , 完成基因组全序列的测定和功能鉴定 , 以
加强对其遗传背景和重组机理的了解 , 获取更多的优
质基因 。 螺旋藻本身就是很有价值的基因库 , 其优质
基因转入其他生物 (如植物和其他海藻 )中 ,可望显著
提高其他生物的品质和抗逆性 , 如将螺旋藻的脂肪酸
脱饱和酶基因转入植物 , 可能提高植物的抗寒性 。 另
外 , 以其他生物作为反应器可大量生产螺旋藻的一些
生物活性物质和重要产物 。 如秦松等 19% 年把钝顶
螺旋藻的别藻蓝蛋白转入大肠杆菌 , 获得了高效表
达 、 具生物学活性的基因工程产物 。 加强螺旋藻分子
遗传学的研究还可为螺旋藻遗传转化的研究提供理
论基础和依据 。
( 2) 加强螺旋藻基因工程的研究 。 通过 1)闪A 重组
技术 , 将外源基因转入螺旋藻 , 有目的地改良藻种品
质 , 培育更优质 、 高产的藻株 ;或利用螺旋藻作为高效
廉价的生物反应器大量生产一些生物活性物质或昂
贵的药物 , 如胰岛素 、干扰素 、 白细胞介素 、胸腺素等 ,
这对于开发利用螺旋藻食品资源和发展可供口服的
海洋药物都有着极为重要的意义。
当前 , 我国的 86 3 计划已开始大力支持转药物基
因藻的研究开发工作 、 目标是构建获得具有某种药物
功能的 、 可供口服的转基因藻 。 作者所在的实验室正
在进行人胸腺素 al 基因在蓝藻中的高效表达研究 ,
该项目是 863 计划的项目之一 (项 目号 : 81 9 0-4 0 3) 。 目
前转化系统已建立起来 , 构建了高效表达载体 , 成功
地筛选到了转基 因蓝藻 , 并检测到了胸腺肤 。 1 的表
达 , 表达量高达蓝藻可溶性蛋白的 18 % 。 现在采用的
转化藻株是聚球藻 S翔创六。 ` 1〕“ us S p . 1犯C 7 9 42 , 也希望
利用螺旋藻作为受体蓝藻 , 使外源药物基因在其中高
效表达 , 以大量生产多肤药物 , 若能选育出可口服的 、 培
养简单 、营养价值高 、 含有特定药物基因的螺旋藻 。四
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血 海洋科学2/ 0 1年 /第 25 卷 /第 9 期