全 文 ：药　物　生　物　技　术
Pharmaceutical Bio technology　2004 , 11(6):381 ～ 384
等电点除蛋白的 pH值对螺旋藻酸性多糖硫酸基团含量的影响
陈　昕 ,尹鸿萍＊ ,王　 ＊
(中国药科大学微生物教研室 ,江苏 南京 210009)
摘　要　考察等电点除蛋白对螺旋藻酸性多糖的硫酸根含量的影响。采用热碱水提取 , 乙醇沉淀 , CPC 络
合得螺旋藻酸性多糖。硫酸苯酚法测定糖含量 ,聚丙烯酰胺凝胶电泳和氯化钡明胶法检查硫酸根 , 200 ～ 400 nm
紫外扫描及水解氨基酸检测蛋白。结果表明 ,不同酸化条件对螺旋藻酸性多糖的硫酸根含量有明显的影响 , 以
pH 值 4.0 去除蛋白效果最佳 ,硫酸根保留相对较多 。
关键词　螺旋藻;多糖;硫酸根
中图分类号:Q539　　　文献标识码:A　　　文章编号:1005-8915(2004)06-0381-04
　　硫酸化多糖(Sulfated Polysaccharides , SP),或
称多糖硫酸酯 ,是多糖大分子链中单糖分子上的羟
基被硫酸根所取代而形成的一类多功能生理活性物
质。SP具有广泛的生物学活性 ,包括抗肿瘤 、对免
疫系统作用和抗凝活性等 ,近十几年来人们又发现
SP具有抗病毒活性。美国国家癌症研究所对海洋
无脊椎动物筛选发现 ,其水相提取物显示了高百分
率(23%)的抗HIV活性 ,而这些活性组分基本是硫
酸化多糖 ,而且许多提取物显示出类似硫酸葡聚糖
和其他硫酸多糖的生物学特性。构效关系研究的结
果表明 ,这类多糖的抗病毒活性首先源于其聚阴离
子特性 ,而其聚阴离子特性又主要源于分子中的硫
酸基 。研究发现 ,有的自身无抗病毒活性的多糖经
硫酸化后 ,表现出抗病毒活性;而有抗病毒活性的硫
酸多糖脱去硫酸根后 ,失去抗病毒活性 ,足见硫酸根
对于多糖抗病毒活性的重要性[ 1] 。
螺旋藻酸性多糖(Acidic Polysaccharide of
S pirulina Plantensis , APSP )是 从 螺 旋 藻
(Spirulina Plantensis)中分离纯化的一种水溶性
酸性杂多糖 ,对人体无毒 ,具有显著的抗辐射 、抗突
变功能 ,可用于防癌 、抗衰老 、增强免疫功能等作
用 ,开发前景广阔 。螺旋藻粉中 ,螺旋藻粗多糖占
干重的 2.0%～ 3.0%,蛋白占 60%～ 70%,因此如
何去除蛋白类杂质 ,最大限度地保留活性必需的硫
酸根成为提取工艺的关键。由于螺旋藻中酸性蛋
白较多 ,因此本文对等电点除蛋白时的不同 pH 值
对多糖硫酸根含量影响进行考察 。
1　实验试剂与仪器
葡萄糖 ,Sigma进口分装;丙烯酰胺 、甲叉丙烯
酰胺 ,BBI进口分装;过硫酸铵 , N , N-四甲基乙二
胺(TEMED)、甘氨酸 、三羟甲基氨基甲烷(Tris),
Amresco进口分装;硫酸化葡聚糖 DE-1(平均分子
质量10 kD),Sigma公司;AmberliteIRA-900Cl强碱
型阴离子交换树脂 , Fluka 公司;其他试剂均为国
产分析纯 。
R-201 旋转蒸发器 、数显恒温水浴 ,上海申胜
生物技术有限公司;752-N 紫外光栅分光光度计 ,
上海精密仪器厂;循环水式真空泵 ,郑州长城科工
贸有限公司;可控硅控温水浴锅 ,江苏南通嘉程仪
器有限公司;真空干燥箱 , 上海实验仪器总厂 。
EPS604电泳仪 、DYCP-31A水平电泳槽(胶板面积
9.0 cm×9.0 cm),北京市六一仪器厂;DYY-Ⅲ24
型垂直电泳槽(胶板面积 10.5 cm ×11.5 cm)、
DY1601稳压稳流电泳 ,南京大学南达生物技术开
发公司;高效液相层析系统 ,Agilent公司。
螺旋藻原粉由云南施普瑞生物工程有限公司
提供 。
381
收稿日期:2004-04-29　修回日期:2004-07-09
作者简介:陈昕 , 1978年生 ,女 ,浙江鄞县人 ,硕士研究生 ,主要从事螺旋藻多糖理化性质的研究
　 ＊ 通讯作者:尹鸿萍 ,副教授 , Tel:025-83271108　王 ,教授 ,博导 , Tel:025-83271395
2　实验方法
2.1　分离纯化
取一定量螺旋藻粉加 6 倍体积水 ,调 pH 值
11.0 , 90℃水浴提取 4 ～ 6 h ,调 pH 值 3 ～ 5 ,离心
(3000 r/min×20min),上清液调至 pH 值 6.0 ～ 8.
0 ,减压浓缩至 1/5体积 ,加 4倍 95%乙醇沉淀 ,抽
滤得粗多糖。粗多糖用 2.5 倍 CPC 络合[ 2] , 5%
NaCl盐解 ,5倍树脂吸附 ,上清液加 3倍 95%乙醇
沉淀 ,60℃～ 70℃真空干燥 8 h ,得 APSP。
2.2　糖含量检测
取一定量 APSP ,配成 40 μg/ml的供试品溶
液 ,依照文献[ 3]测定糖含量。
2.3　硫酸根检测
2.3.1　聚丙烯酰胺凝胶电泳　取 APSP 10 mg置
微量离心管中 ,加入甘油 0.1 ml ,0.1%溴酚蓝溶液
50μl ,加双蒸水至 1 ml ,振荡至完全溶解后离心取
上清即得供试品溶液 。按文献[ 4]方法进行电泳 。
凝胶浓度为 6.5%,上样量 10μl。
2.3.2　硫酸根含量测定　取 APSP 10 mg ,加2 ml
2mol/ L盐酸溶解 ,移至安瓿中熔封 ,105℃～ 110℃
水解 4 h。取水解液按文献[ 5]方法测定硫酸根含
量。
2.4　蛋白质检测
2.4.1　紫外全波段扫描　取 APSP 10 mg ,加水配
制成 1mg/ml溶液 ,进行 200 ～ 400 nm全波段扫描。
2.4.2　磺基水杨酸反应　取 APSP 50 mg ,加生理
盐水配成 10 mg/ml溶液 ,照文献[ 6]进行检测 。
2.4.3　水解氨基酸测蛋白组成　取APSP 1 mg溶
于0.5 ml 6.0 mol/L的 HCl溶液 ,封管后 110℃水
解 24 h ,开封后抽干进行氨基酸分析。
2.5　高效液相色谱法检测
HPLC色谱条件:Agilent 高压液相层析系统;
柱为 Shodex 公司 KS-804和 KS-802 两柱串联 ,示
差折光检测器检测;样品浓度为 4 mg/ml ,上样量
20μl ,洗脱液为 0.01mol/ L NaAc-HAc缓冲液(pH
值 6.0),柱温 25℃,流速 0.5 ml/min。
3　实验结果
3.1　硫酸苯酚测糖含量
pH值 3.0 , pH 值 4.0 , pH 值 5.0条件获得的
APSP(以下分别称为 APSP3 ,APSP4 , APSP5),测
定结果见表 1。
Tab 1　Content of APSPs from different pH value conditions
(x±s , n=5)
Sample APSP3 APSP4 APSP5
Content(%) 84.64±0.06 84.32±0.05 83.66±0.06
3.2　硫酸根检测
3.2.1　聚丙烯酰胺凝购电泳　APSP 的聚丙烯酰
胺凝胶电泳结果如图 1 ,各样品均显示两个条带 ,
着色深浅有明显差异。
1.APSP5;2.APSP4;3.APSP3;4.Sulfated dext ran(10000)
Fig 1　PAGE electrophoresis of APSPs of different extraction
conditions
3.2.2　硫酸根含量测定　氯化钡-明胶法测定
APSP 的硫酸根含量 ,测定结果见表 2 ,标准曲线为
y=0.0007x - 0.0062 ,R2=0.997
Tab 2　Content of sulfate of APSPs(x±s , n=5)
Sample APSP3 APSP4 APSP5
SO 2-4(%) 4.28±0.05 7.91±0.08 11.47±0.09
3.3　蛋白质检测
3.3.1　紫外全波段扫描　200 ～ 400 nm紫外扫描
结果显示是 3 个 APSP 样品在 260 ～ 280 nm均有
吸收峰 ,峰高差别不大。
3.3.2　磺基水杨酸检测　APSP3 ,APSP4 ,APSP5
的磺基水杨酸反应分别为阴性 、阴性和阳性 。
3.3.3　水解氨基酸组成分析　氨基酸组成分析显
示 ,APSP3 ,APSP4 ,APSP5中均含 11种氨基酸 ,总
氨基酸含量分别为 1.72%,2.51%和 4.42%。
3.4　调节不同 pH 值 , 等电点法除蛋白提取的
APSP 的含量 、硫酸根含量 、磺基水杨酸反应和水
382 药 物 生 物 技 术 第 11 卷第 6 期　
解氨基酸含量结果见表 3。
Tab 3　Content of sulfate and amino-acids of APSPs
Content APSP3 APSP4 APSP5
Polysaccharide(%) 84.64 84.32 83.66
SO2-4(%) 4.28 7.91 11.47
Amino acid(%) 1.72 2.51 4.56
Sulfosalicy lic acid - - +
3.5　高效液相色谱法检测
APSP3 ,APSP4 ,APSP5 的 HPLC 检测结果见
图 2 ～ 4 ,图中是不同条件提取多糖的示差折光检
测和紫外 280 nm检测结果 。
F ig 2　Result of HPLC Analysis of APSP3
F ig 3　Result of HPLC Analysis of APSP4
F ig 4 　 Result o f HPLC analysis of APSP 5(APSPs of
different ectraction conditions were essayed by HPLC with
RID and UVD)
HPLC 的示差折光检测器(RID)结果显示 ,不
同条件提取 APSP 的出峰时间相差不大 ,分别为
10.68 ～ 10.77 min ,峰形相似 ,表明不同酸化条件
对多糖的分子量影响不大。在主峰前边有一个肩
峰 ,根据 HPLC凝胶柱的分离原理 ,该组分比主峰
的分子量略高 ,与聚丙烯酰胺凝胶电泳结果相似 。
紫外 280 nm检测结果在与 RID主峰相对应的出峰
时间有很强吸收 ,表明所提取的多糖可能为糖肽 。
在主峰后的峰可能为游离蛋白峰 ,以 pH5.0最大 ,
与磺基水杨酸反应结果和水解氨基酸结果一致。
4　讨　论
螺旋藻多糖提取过程中 ,除蛋白的方法现在多
采用等电点法 , Sevag 法 , 三氯乙酸法[ 7] 及酶法 。
其中等电点法 ,简便易行 ,污染小 ,成本低 ,有利于
工业化大生产 ,为此实验室对提取过程中的酸化去
蛋白步骤进行考察 ,发现不同等电点去蛋白效果不
同 ,对目的多糖的硫酸根含量有明显影响。因此应
选取与硫酸化多糖特征紧密相关的检测手段 ,跟踪
硫酸化多糖的存在状态 ,同时检测杂蛋白含量 ,达
到去伪存真的目的 。
从表 3中可以看出 , pH 值 3.0 和 pH 值 4.0
去除杂蛋白效果较好 ,可能是杂蛋白等电点集中在
此pH 值 3 ～ 4 附近。根据注射用药品要求 ,样品
的磺基水杨酸反应为阴性 ,因此 pH 值 5.0条件提
取的 APSP 不能使用。曾经尝试 Sevag 法和三氯
乙酸法进一步去除蛋白 ,但效果甚微 ,可能是由于
糖链上缀合的肽不易除去。
现在对多糖的分级分离多采用 DEAE-纤维
素[ 8]或 DEAE-Sepharose[ 7]层析方法 ,但鉴于实验
中使用静态吸附已足以除去小分子杂质 ,且纤维素
和琼脂糖作为骨架的机械强度不高 ,因此实验室选
取聚丙烯酰胺作为骨架的强碱型阴离子交换树脂 ,
树脂再生损失小 ,操作方便。
甲苯胺蓝常作为酸性多糖的染色剂 ,可以与多
糖分子中的硫酸基团结合 ,着色越深含酸性基团越
多。由于 APSP 含硫酸基团 ,因此着色深浅可以部
分表示硫酸根含量的多寡。实验室曾使用过琼脂
糖作为电泳分离介质 ,但多糖在高浓度琼脂糖条件
下拖尾严重 ,而低浓度时分辨率低 ,在琼脂糖凝胶
中显示为单一斑点的多糖样品 ,在聚丙烯酰胺介质
中又被分成两个条带 ,因此实验用聚丙烯酰胺凝胶
383陈　昕等:等电点除蛋白的 pH 值对螺旋藻酸性多糖硫酸基团含量的影响
作为支持介质 。不同提取条件的 APSP 样品的聚
丙烯酰胺凝胶电泳结果显示 ,样品均被分成两个条
带 ,各条件 APSP 的条带位置一致 ,pH 值 5.0条件
的APSP 着色最深 ,硫酸根含量最高 ,而 pH 值 3.0
条件提取的 APSP 着色很浅 , 表明其硫酸根含量
低 ,可能是等电点除蛋白的 pH 值过低 ,糖链上的
硫酸酯键水解断裂 ,与氯化钡-明胶法测定趋势一
致。由于聚丙烯酰胺凝胶电泳的分离机理除了与
多糖带电荷多少有关外 ,还与其分子质量密切相
关 ,因此电泳行为靠后的条带为分子质量较大的组
分 ,与高效凝胶渗透色谱结果相似 。这两种组分在
HPLC中未能分离 ,但在聚丙烯酰胺凝胶电泳中分
离效果较好 ,可能是因为这两个组分的分子质量相
似 ,但所带电荷有明显差别。丙烯酰胺的浓度对电
泳的分离效果影响很大 ,因此先进行胶浓度的梯度
(3%～ 10%)考察 ,发现在 5%胶浓度左右分离效
果较好 。胶浓度太低(4%),样品扩散 , 且不易操
作;胶浓度太大(7.5%),样品泳动过慢 ,并且无法
很好的分离。因此 ,实验采用 6.5%的胶浓度。
pH值 5.0条件提取的APSP 的硫酸根含量最
高 ,推断其生物活性最强 ,但由于此条件除蛋白效
果不佳 ,限制了其应用 。因此可在 pH 值4.0 ～ pH
值 5.0的范围内继续摸索 ,找到最佳去伪存真的条
件。
硫酸化多糖的生物活性除了必需的硫酸根外 ,
还跟硫酸基团的数目 、分布和空间构象有关[ 10] 。
因此在提取过程中如何保持多糖的高级结构 ,仍需
要进一步的研究。
参考文献
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素分册 , 2001 , 22(3):97.
Effect on Sulfate Content of Acidic Polysaccharides from Spirulina
Platensis at Different pH Values
CHEN Xin ,YIN Hong-ping ,WANG Min
(Department of Microbiology , China Pharmaceut ical Universi ty , Nanjing 210009 , China)
Abstract　To study the ef fect on sulfate level of acidic polysaccharides from Spirul ina Platensis(APSP)at
different pH values.The polysaccharide w as ex t racted f rom the powder of Spirul ina Platensis by basic hot
w ater.After precipitation by alcohol the crude polysaccharide w as obtained.Then polysaccharide w as
complexed by CPC and precipi tated by alcohol.After absorption by AmberliteIRA-900Cl APSP w as obtained.
The contents of the poly saccharide , sulfate and protein w ere assayed by sulfuric acid-phenol , BaCl2-gelatin
and amino acid analysis respectively.Different pH values influence the content of sulfate of APSP .At pH4.0
proteins could be better removed and sulfated polysaccharides could be kept well.
Key words　Spirulina Plantensis , Poly saccharide ,Sulfate
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