全 文 ：　收稿日期:2006-11-19
基金项目:北京新星科技资助项目(B05);新疆生产建设兵团博士基金(2006JC07)
作者简介:赵　锋(1979-),硕士生 , 从事植物基因工程研究。电话:010-62753062 , e-mail:zhf9821144@tom.com。
通讯作者:胡鸢雷 ,女 , 博士 ,工程师 , 从事植物基因工程研究。电话:010-62759652 , e-mail:yuanleihu@pku.edu.cn。
第 25卷　第 1期
2007年 2月
石河子大学学报(自然科学版)
Journal of Shihezi University(Natural Science) Vol.25　No.1Feb.2007
文章编号:1007-7383(2007)01-0001-04
厚叶旋蒴苣苔 BcWRKY2基因 5′端调控区
的克隆及功能元件分析
赵　锋1, 2 , 胡鸢雷1 , 祝建波2 , 林忠平1 , 2
(1 蛋白质工程及植物基因工程国家重点实验室 , 北京大学生命科学学院 , 北京 100871;
2 新疆兵团绿洲生态农业重点实验室 , 石河子大学 , 新疆石河子 832003)
摘要:在克隆厚叶悬蒴苣苔干旱诱导表达转录因子 BcWRKY2 基因的基础上 ,利用接头介导的 PCR(LM-PCR)技术 ,
从基因组 DNA中克隆了 908bp 的 BcWRKY2 基因的上游调控区序列。序列分析显示 , 该启动子中存在多种非生物
胁迫反应元件 , 如 ABA 反应元件 ABRE、干旱反应元件 DRE/C-repeat以及 MYB 结合位点 MBS(MYB binding site in-
volved in drought-inducibility)等。
关键词:厚叶悬蒴苣苔;BcWRKY2 转录因子;调控序列;LM-PCR;序列分析
中图分类号:Q785　　　　文献标识码:A　　　　
　　转录调控因子 WRKY 基因家族是植物特有的
超级基因家族 ,其涉及多方面生理机能的调控[ 1] ,并
参与生物[ 2]和非生物胁迫应答反应[ 3] 、信号分子传
递[ 4] 、植物衰老[ 5]以及器官发育[ 6]等一系列生理活
动 ,相关研究很多 ,但关于 WRKY转录因子与非生
物胁迫下产生的信号分子的关系的研究则很少[ 7] 。
厚叶悬蒴苣苔(Boea crassifolia)是我国特有的一
种耐旱植物 ,其 BcWRKY 2基因启动子具有逆境诱导
表达的特性 ,这种诱导型表达启动子在提高植物抗
逆性的基因工程中 ,可以避免了组成型强启动子过
量表达抗逆基因对植物生长的负面影响[ 8] 。在获得
其中干旱诱导表达的 BcWRKY2基因全长 cDNA 之
后[ 9] ,我们克隆该基因的 5 端调控序列 ,以用于研
究植物WRKY 基因家族对逆境胁迫的反应 。
1　材料与方法
1.1　材料
厚叶旋蒴苣苔(Boea crassifolia Hemsl.)由中国科
学院植物研究所的李振宇教授从广西野外采集并惠
赠 ,经无菌培养和繁殖后所得材料 。
LA Taq酶 、PMD-18 Vector、T4 DNA 连接酶购于
TaKaRa公司;限制性内切酶购于 Promega公司;琼脂
糖凝胶 DNA回收试剂盒购于北京 TIANGEN公司。
1.2　方法
根据TaKaRa 公司的 LA PCR Cloning Kit及蛋白
质工程及植物基因工程国家重点实验室克隆的
BcWRKY2转录因子全长序列 ,由北京生工生物公司
合成了接头 、接头引物以及 2个巢式特异引物序列:
BcWRKY2-Gsp1:5 -CGCACTTGTTCACTCAGTTT
CGGCAG-3 ;
BcWRKY2-Gsp2:5 -ATCGAGCAGAGTCAAAGCA
TTATC-3 。
接头 、及接头引物均根据 LA PCR Cloning Kit说
明书中的方法合成 。
采用 SDS 法提取厚叶旋蒴苣苔叶片总 DNA[ 10] ;
取 5μg 厚叶旋蒴苣苔叶片总 DNA ,按照TaKaRa公司
产品说明书 , 分别用 Hind Ⅲ、EcoRI、Pst I 、Sal I 和
Xba I 完全酶解 ,氯仿抽提 ,无水乙醇沉淀 ,溶于无菌
水中;用 50μmol/L 合成 的寡 聚接 头 DNA 在
1250mmol/L Tris-HCl 、pH7.5缓冲液中分别建立如下
退火体系:
95℃变性5min ,转入 70℃的水中 ,使其在 1h内
逐渐降到室温 ,室温保持 1h ,转入 4℃,使其在 1h内
逐渐降到 4℃并在 4℃保持 12h ,制备好的各接头贮
存于-20℃备用;取 0.5μg 酶解 DNA 和相应的 2μL
接头分别在10μL 体系中用1U T4 DNA连接过夜;将
连接产物稀释 10倍 。在 0.2mL PCR管中建立 50μL
PCR反应体系 ,反应条件为:预变性 94℃5min;加入
2.5U LA Taq plus II;94℃ 30s;55℃ 2min;72℃1min
30个循环;延伸:72℃10min。用 1%琼脂糖电泳检
测(图 1)。
将以上所得PCR产物稀释 100倍取2.0μL作为
模板 ,在 0.2mL PCR管中建立 50μL 反应体系 ,反应
条件为:预变性 94℃ 5min;94℃ 30s ;55℃ 2min;
72℃1min;30个循环;延伸:72℃10min 。用 1%琼脂
糖电泳检测(图 2)。
琼脂糖电泳将克隆到的专一性扩增片段回收 ,
克隆到 PMD-18载体上由 Invitrogen 英俊北京分公司
测序。
2　结果与分析
2.1　PCR产物的克隆及测序结果
厚叶旋蒴苣苔总 DNA分别用 Hind Ⅲ 、EcoR I、
Pst I 、Sal I和Xba I 酶切 ,分别与相应的接头连接 , 2
轮 PCR后 Hind Ⅲ 、EcoRI 和 Xba I 酶解的厚叶旋蒴
苣苔总 DNA能扩增出特异片断(图 2)。
由于Hind Ⅲ酶切产物染色体步行距离短 ,故将
EcoRI和 Xba I酶切产物扩增片段琼脂糖凝胶电泳回
收连接到PMD-18载体上 ,筛选阳性克隆并测序。
　　
M:λDNAHind Ⅲ+EcoR I;
A:Xba I;B:EcoR I;
C:Pst I;D:Sal I;E:Hind Ⅲ
　　　　　　　　　　　　　　　　　　
M:λDNAHind Ⅲ+EcoR I;
A:Xba I;B:EcoR I;
C:Pst I;D:Sal I;E:Hind Ⅲ
　　图 1　第 1次 PCR扩增　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　图 2　第 2次 PCR 扩增
　　将克隆到的约 564bp 的片段进行测序 ,结果证
实获得了 420bp的 BcWRKY2基因 5′调控区的部分
序列 。
为了获取更长的调控区序列 ,我们又在此基础
上进行了第 2次染色体步行 ,根据所获的 420bp 的
BcWRKY2启动子区序列 ,设计 2条反向巢式特异引
物 BcWRKY2-1-Gsp1:5 -ATAGGAGATGTTTCTGCACT
AC-3 和 BcWRKY2-1-Gsp2:5 -ACCACTTCAAAGCGC
CACCACATC-3 。
再次实验 ,结果又获得488bp的 BcWRKY2基因
5′调控区序列。将 2次染色体步行所得到的片段进
行拼结 ,最终获得了 1个 908bp的 BcWRKY2基因 5′
调控区序列(图 3)。
2.2　BcWRKY 2基因启动子序列分析
把 BcWRKY 2启动子序列在NCBI中 EST 数据库
中检索发现 ,目前无与其同源的启动子序列的相关
报道 。因此 ,该启动子很可能是一新的启动子 。
同时 ,将 BcWRKY 2启动子序列在植物启动子数
据库 PlantCARE 和 PLACE 中进行搜索 , 发现在
BcWRKY2启动子中存在多个与非生物胁迫相关的
顺式元件:BcWRKY2启动子区域在 514bp处有 1个
ABA元件(ABA-responsive element , ABRE), ABRE 存
在于许多 ABA反应基因的启动子中[ 11] ;在 550bp和
750处各有 1 个 MBS (MYB binding site involved in
drought-inducibility ), 此元件可能与干旱诱导有关;
此外 ,在 BcWRKY2启动子中还含有 3个乙烯响应元
件(ethylene-responsive element ,ERE),1个水杨酸响应
元件(TCA-element),在-408和-523处各有 1个干旱 、
冷胁迫响反应元件(dehydration-responsive element /C-
repeat ,DRE/C-repeat),在很多脱水胁迫响应基因的
启动子中包含 DRE/C-repeart元件 ,它可能在干旱 、
低温和高盐胁迫条件下的快速应答反应中起作用 ,
而其功能与ABRE不同 ,因此在胁迫响应过程中不
需要ABA参与。
2　　　　　　　　　　　　　　　　　　　石河子大学学报(自然科学版)　　　　　　　　　　　　　　　　第 25卷
-908 TTTTGAATTA TGTTCTAATG ATTTTGTATA TATTTCTATA TTAAATAAAG GAAAAGAGAA
AAAACTTAAT ACAAGATTAC TAAAACATAT ATAAAGATAT AATTTATTTC CTTTTCTCTT
CAAT-box
-848 GCCCGGCAGA TACAAA AATT ACGAGATCGC AAGTTTGGAT TGAAGGTCAC AAGAAAAAAA
CGGGCCGTCT ATGTTTTTAA TGCTCTAGCG TTCAAACCTA ACTTCCAGTG TTCTTTTTTT
-788 ATGGAGAGCC TAGTACTCAA GCTGTTGGAG AGAAAATGGT AATAATTAGA TTAACTTCGC
TACCTCTCGG ATCATGAGTT C GA CAAC CTC TCTTTTACCA TTATTAATCT AATTGAAGCG
MBS
-728 ATCATTTTTC TTGTATAAGG TAATGTGTAA TTGGGAAAAT GGAATTAACA CATTTATTTA
TAGTAAAAAG AACATATTCC ATTACACATT AACCCTTTTA CCTTAATTGT GTAAATAAAT
-668 TTTAAAAAGG ATAATTAAAA TTATAAAGCG TCGT TATTGG TTTTATAGAT CCTTTGTTTC
AAATTTTTCC TATTAATTTT AATATTTCGC AGCAATAACC AAAATATCTA GGAAACAAAG
ERE ARE
-608 GACTAATTTA ACAATTTCAA AATTCAAAAG ACAGCTCTCG TAGTACACAA GTGTTGTTTC
CTGATTAAAT TGTTAAAGTT TTAAGTTTTC TGTCGAGAGC ATCATGTGTT CACAACAAAG
CAAT-box MBS
-548 TTTGAAATTT TAGGCTAAGA AAATGTAGTG CAGAAACATC TCCTATTTTT CGTTTGAAGC
AAACTTTAAA A T CCGAT TCT TTTACATCAC GT CTTTGTAG AGGATAAAAA GCAAACTTCG
ERE C-Repeat ABRE　　
-488 ATAGTAGGTA AATTATTGTT GATTGATCCA CCATCTCTCT AATAATTTAC TTGCGATGGA
TATCATCCAT TTAATAACAA CTAACTAGGT GGTAGAGAGA TTATTAAATG AACGCTACCT
-428 TGGCCTAGAA ATTATGGGCT TGGGTGTAAT TTCAATCTGT TTCGTTAATA TATTTTGTAA
ACCGGATCTT TAATAC CCGA ACCCACATTA AAGTTAGACA A AG CAATT AT ATAAAACATT
C-Repeat CAAT-box
-368 AAAAAAATAC AATTTGGATA ACCACAAAGC TAAGATGTGG TGGCGCTTTG AAGTGGTCAG
TTTTTTTATG TTAAACCTAT TGGTGTTTCG ATTCTACACC ACCGCGAAAC TTCACCAGTC
CAAT-box
-308 CTTGTCTTTG ATCCATAATT CTCCCACCAC CATTTTCATA CTAAAATCCA ACCCTCCTTT
GAACAGAAAC TAGGTATTAA GAGGGTGGTG GTAAAAGTAT GATTTTAGGT TGGGAGGAAA
P-box
-248 TCCACACCTT TTGTTCTTTA TAAAATCACT CTTCCCCCCT CTTTCCACTT ATCGTTCAGA
AGGTGTGGAA AACAAGAAAT ATTTTAGTGA GAAGGGGGGA GAAAGGTGAA TAGCAAGTCT
CAAT-box TCA-element　　　
-188 AAATCTTTCG CCATCTCCAC TCCCAATTCC CACATTTATT AGGAAAAAAG AAGAAGATAA
TTTAGAAAGC GGTAGAGGTG AGGGTTAAGG GTGTAAATAA TCCTTTTTTC TTCTTCTATT
-128 TTTGTATTTT CATTTTATTA TTGATGTGAT CTGGAATCAA GAAAGGTTCA GGAAAGTCCT
AAACATAAAA GTAAAATAAT AACTACACTA GACCTTAGTT CTTTCCAAGT CCTTTCAGGA
-68 TTACTCCAAA TTCTTGAACG GGATCAAGAG TTGAGCCCAA AAACTTGTAT TTCTATTCGT
AATGAGGTTT AAGAACTTGC CCTAGTTCTC AACTCGGGTT TTTGAACATA AAGATAAGCA
G-box
-8 TATTTG AAATGGAGAA AGCG G
A TAAACTTTACC TCTTTCGC C
ERE
下划线处为各元件的保守碱基;粗字体为 BcWRKY2 基因起始密码子
图 3　BcWRKY2启动子的序列及其调控元件
3　讨论
植物中受干旱 、低温和高盐胁迫诱导表达的基
因大体上可以分为两大类:被外源ABA诱导表达的
基因和不被外源 ABA诱导表达的基因 ,其中前者的
部分基因虽然被外源 ABA所诱导 ,但它们的转录表
达并不依赖于 ABA 的存在[ 12] 。依赖 ABA 的途径
中 ,起作用的顺式元件有 ABRE ,它的核心序列为
PyACGT ,存在于各种ABA反应的基因的启动子。该
序列是在小麦 Em 基因中首次发现的 , 被命名为
ABRE。ABRE是 ABA响应基因中 1个主要的顺式
元件[ 13] 。它能有效地参与 ABA反应基因的表达调
控[ 14] 。通过对 BcWRKY2 基因启动子序列的分析 ,
我们发现该序列中存在有很多胁迫响应元件 ,如
ABRE 、DRE/C-repeat(CRE)、MBS 、ERE等 。其中和干
旱响应有关的元件共发现 2类(C-repeat 、MBS)共 4
处 ,这些元件分布于 BcWRKY2启动子中 。该启动子
中 ,含有 1个 ABRE ,因此 , BcWRKY2 基因对干旱等
胁迫反应的调控机制可能是依赖于 ABA的作用。
DRE/CRE是含有 1个A/GCCGA序列 ,常见于干旱 、
3第 1期　　　　　　　　赵　锋 ,等:厚叶悬蒴苣苔 BcWRKY2基因 5 端调控区的克隆及功能元件分析　　　　　　　　
冷胁迫响应基因的启动子中。MBS元件也是干旱胁
迫响应基因中常见的元件 。植物对于干旱胁迫的应
答反应 ,很可能是依赖于启动子中存在 ABRE 、CRE
和MBS等多种元件[ 15] 。
BcWRKY2基因的 EST 最初是通过干旱诱导获
得的。这些元件的存在说明了 BcWRKY 2启动子是
1个具有干旱诱导性的启动子 。
特定启动子中不同元件和转录因子之间的组合
调控方式的研究是植物基因表达调控研究的重要方
面 ,这方面还有很多问题值得深入研究 。我们对
BcWRKY2启动子的功能的研究实验还正在进行中 。
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of Boea crassifolia BcWRKY2 Gene
ZHAO Feng
1 , 2 , HU Yuan-lei1 , ZHU Jian-bo2 , LIN Zhong-pin1 , 2
(1 The National Laboratory of Protein Engineering and Plant Genetic Engineering , College of Life Sciences , Peking University ,
Beijing 100871 , China;2 The Key Laboratory of Oasis Ecology Agriculture of Xinjiang BINGTUAN , Shihezi , Xinjiang 832003 , China)
Abstract:BcWRKY 2 gene′s expression can be induced by the dry signal.In order to analysis the regulation of the gene′
s expression ,we cloned the 908bp upstream promoter sequence of BcWRKY2 transcription factor from the Genomic DNA
of Boea crassifolia by ligation-mediated PCR.The result of the sequence analysis suggested that many kinds of nonbiologi-
cal stress response elements are contained in the promoter , such as ABRE , DRE/C-repeat ,MBS(MYB binding site in-
volved in drought-inducibility), and so on.
Key words:Boea crassifolia;BcWRKY2 transcriptional factor;ligation-mediated PCR;promotor;sequence analysis
4　　　　　　　　　　　　　　　　　　　石河子大学学报(自然科学版)　　　　　　　　　　　　　　　　第 25卷