全 文 ：94　　　 2009 No.9SerialNo.210 ChinaBrewing ResearchReport
响应面法优化灰树花发酵培养条件研究
孙金旭1, 2 ,朱会霞 1, 2
(1.衡水学院 生命科学系 ,河北 衡水 053000;2.工业微生物教育部重点实验室 天津科技大学 ,天津 300457)
　
　　　　　收稿日期:2009-03-01
　　　　　作者简介:孙金旭(1975-),男 ,河北景县人 ,在读博士研究生 ,讲师 ,主要从事微生物 、发酵工程 、食品等方面的研究。
摘　要:借助于 SAS8.0软件 ,采用 Placket-Burman试验设计法及响应面法分析, 对灰树花进行了发酵工艺条件的优化研究 , 用
最陡爬坡路径逼近最大响应区域 ,再利用 Box-Behnken试验设计及响应面分析法进行回归分析。结果表明, 接种量与灰树花多
糖产量存在极显著的相关性 , 优化的发酵条件为:接种量 10%、培养温度 26℃、葡萄糖添加量 4%。灰树花多糖产量可达到 1.
91g/L。
关　键　词:灰树花;响应面;多糖;优化
中图分类号:Q93-335　　　文献标识码:A　　　文章编号:0254-5071(2009)09-0094-04
optimizationofincubationconditionsofGrifolafrondosafermentationbyresponsesurfacemethod
SUNJinxu1 , 2 , ZHUHuixia1 , 2
(1.DepartmentofBiologyHenshuiColege, Hengshui053000 , China;2.KeyLaboratoryofIndustrialMicrobiology,
MinistryofEducation, TianjinUniversityofScienceandTecnology, Tianjin300457 , China)
Abstract:WithSAS8.0 software, Plackett-Burmanexperimentaldesignmethodandresponsesurfacemethodwereappliedtooptimizethecondi-
tonsofGrifolafrondosafermentation.Firstusingthepathofsteepestascentteststoapproachthelargestresponseregion, thenusingBox-Behnken
andresponsesurfacemethodtodoregressionanalysis.TheresultsshowedthatinoculumconcentrationandtheyieldofGrifolafrondosapolysaccha-
rideweresignificantrelevance;theoptimizedfermentationconditionswereasfollows:inoculumconcentration10%, culturetemperature26 ℃,
addingthe4% glucose.Undertheoptimumconditions, theyieldofGrifolafrondosapolysaccharidecouldbeupto1.91g/L.
Keywords:Grifolafrondosa;responsesurface;polysaccharide;optimization
　　灰树花是食 、药兼用覃菌 ,属担子菌亚门层菌纲 、非褶
菌目多孔菌科树花菌属。野生灰树花分布于日本 、欧洲 、
北美 ,我国主要集中于浙江与福建。灰树花具有松覃样芳
香 ,肉质柔嫩 ,味如鸡丝 ,脆似玉兰等特点 ,是极其珍贵的
高档食用覃菌 [ 1] 。
灰树花具有突出的医疗保健功能 [ 2] 。由于富含铁 、铜
和维生素 C,能预防贫血 、坏血病 、白瘫风 ,防止动脉硬化
和脑血栓的发生 ,具有抑制高血压和肥胖症的功效。
日本学者通过对灰树花发酵液成分的研究发现 ,灰树
花多糖是其主要的生物活性成分 [ 3] 。大量的药理药效研
究证明 ,灰树花多糖具有显著的抗肿瘤 [ 4] 、降血糖 、抗肝
炎 、抗 HIV病毒及改善免疫系统功能等功效 [ 5] 。
灰树花培养过程中 ,由于天然子实体生产周期长 ,劳
动强度大 ,受气候影响大 ,产量及质量不稳定 ,且子实体木
质化程度高 ,多糖提取利用率较低。与之相反 ,采用生物
发酵技术生产菌丝体 ,周期短 、成本低 、产量大 ,且有工业
化生产前景。当前利用生物发酵技术生产灰树花菌丝体
及对多糖的研究是研究的热点。本试验根据灰树花的生
长特点 ,探发酵条件对灰树花生长产多糖的影响。
1材料与方法
1.1材料
供试菌种:灰树花菌种由本实验室保藏。
1.2试验方法
1.2.1培养基制作及培养
(1)母种培养基及培养
斜面培养基(PDA培养基 ):20%的土豆 , 2%葡萄糖 ,
2%的琼脂 , pH值自然。从母种试管中切取蚕豆大小的菌
丝块接种于斜面中央 28℃恒温培养 10d。
(2)种子基础培养基及培养
种子培养基:马铃薯 20%,葡萄糖 2%,蛋白胨 0.2%,
KH2PO4 0.2%, MgSO4· 7H2O0.1%, pH值自然。
种子培养:斜面菌种经平板活化后 ,切成菌块 ,接入装
有 75mL种子液的 300mL三角瓶中 ,置于 28℃、转速为
140r/min的恒温摇床上振荡培养 ,待菌丝旺盛生长并形成
较多菌丝球后 ,转接入新的种子液中继续培养。
(3)液体发酵培养基及培养方法
液体发酵培养基:玉米浆 10%,葡萄糖 2%,蛋白胨
0.3%,酵母膏 0.7%, KH2PO4 0.3%, MgSO4·7H2O0.05%,
pH值自然。
摇瓶培养方法:将种子液按 10%的接种量 ,接入发酵
培养基中 ,在 28℃、转速为 130r/min的恒温摇床上振荡培
养 10d。
研究报告 中　国　酿　造 2009年第 9期总第 210期 95　
1.2.2多糖测定方法
采用硫酸—苯酚法。
1.2.3 Placket-Burman设计筛选灰树花发酵条件的
Placket-Burman(PB)设计法是一种 2水平的试验设
计方法 ,其试图用最少的试验次数达到使因素的尽可能精
确的估计 ,适用于从众多的考察因素中快速有效地筛选出
最为重要的几个因素供进一步研究 [ 6] ,根据灰树花所需营
养要素和发酵影响因素的一般规律 ,结合相关的文献报道
和前期的试验 ,选用试验次数 N=12的试验设计 ,对接种
量(X1)、培养温度(X2)、葡萄糖用量(X3)、玉米浆(X4)、
酵母膏(X5)、蛋白胨(X6)、摇瓶转速(X7)、摇瓶装液量
(X8)8个因素进行考察 ,分别对应于表中的 8列 ,每个因
素取 2个水平 ,响应值为灰树花多糖产量(Y)。对试验结
果进行分析 ,得出各因素的 t值和可信度水平。一般选择
可信度超过 90%的因素作为重要因素。
1.2.4 Placket-Burman设计因素水平表
表 1 Plackett-Burman设计因素水平表
Table1.LevelsandfactorsofthePlacket-Burmandesign
水平 X1接种量 /% X2培养温度 /℃ X3葡萄糖 /% X4玉米浆 /% X5酵母膏 /% X6蛋白胨 /% X7摇瓶转速 /(·rmin-1) X8装液量 /(mL·500mL-1)
-1 8 26 2 20 0.5 0.3 130 100
1 10 28 4 30 0.7 0.5 150 150
1.2.5响应面分析试验设计优化灰树花发酵条件
正交设计仅能从试验预先设定的几个水平中优选组
合得到的最佳工艺条件 ,并非真实意义的最佳条件 ,只能
说是理想条件 ,所以无法给出整个区域上因素的最佳组合
的最优值。响应面分析法(RSM)是一种寻找多因素系统
中最佳条件的数学统计方法。由于采用了合理的试验设
计 ,能以最经济的方式 ,用很少的试验数量和时间对试验
进行全面研究 ,能在整个考察区域上确定各个因素的最佳
组合及最优响应值。所以试验将通过 Placket-Burman
试验设计筛选的对灰树花发酵的主要因素进一步采用响
应面法进行优化 ,得到最佳的发酵条件 ,以提高灰树花多
糖产量 ,并且为将来的发酵罐高密度发酵提供理论基础。
采用 Box-Benhnken试验设计对灰树花发酵条件进
行 3因素 3水平的响应面分析试验 ,包括 12个析因试验
和 3个中心试验。试验设计见表 2。
表 2 响应面实验因素水平表
Table2. LevelsandfactorsoftheBox-Behnkendesign
水平 X1接种量 /% X2培养温度 /℃ X3葡萄糖用量 /%
-1 8 24 2
0 10 26 4
1 12 28 6
2结果与讨论
2.1 Placket-Burman设计筛选灰树花发酵条件的因素
根据灰树花生长所需营养要素和发酵影响因素的一
般规律 ,结合相关的文献报道和前期试验 ,选用试验次数
N=12的试验设计 ,对接种量 (X1)、培养温度(X2)、葡萄
糖用量(X3)、玉米浆(X4)、酵母膏(X5)、蛋白胨(X6)、摇
瓶转速(X7)、摇瓶装液量 (X8)进行考察 ,每个因素取 2
个水平 ,响应值为灰树花多糖产量。运用 StatisticalAnaly-
sisSystem(SAS)8.0软件分别计算各因素的多糖产量 ,并
对各因素多糖产量进行 t检验 ,选择置信度较高的因素作
为显著因素作进一步考察。试验设计及试验结果见表 3,
各因素主效应分析结果见表 4。
表 3 Placket-Burman实验设计与结果
Table3. DesignsandresultsofPlacket-Burmanexperiment
试验号 X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 Y1
1 1 -1 1 -1 -1 -1 1 1 1.42
2 1 1 -1 1 -1 -1 -1 1 1.38
3 -1 1 1 -1 1 -1 -1 -1 0.94
4 1 -1 1 1 -1 1 -1 -1 1.27
5 1 1 -1 1 1 -1 1 -1 1.16
6 1 1 1 -1 1 1 -1 1 1.12
7 -1 1 1 1 -1 1 1 -1 0.92
8 -1 -1 1 1 1 -1 1 1 1.15
9 -1 -1 -1 1 1 1 -1 1 1.2
10 1 -1 -1 -1 1 1 1 -1 1.52
11 -1 1 -1 -1 -1 1 1 1 1.36
12 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 1.28
表 4 各因素的主效应
Table4. Mainefectofthefactors
因素 效应 t Pr> t 显著性
接种量 0.17 3.384989 0.042933 ＊
培养温度 -0.16 -3.18587 0.049869 ＊
葡萄糖用量 -0.18 -3.58411 0.037178 ＊
MgSO4· 7H2O -0.09333 -1.85843 0.16008 Ns
KH2PO4 -0.09 -1.79205 0.171036 Ns
蛋白胨 0.01 0.199117 0.854903 Ns
酵母膏 0.056667 1.12833 0.341264 Ns
摇瓶装液量 0.09 1.792053 0.171036 Ns
　　注:“＊”表示显著;“＊＊”表示高度显著;“Ns”表示无显著性。
由表 3、表 4可以看出 ,接种量 、培养温度和葡萄糖用
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量这 3个因素在 α=0.05水平上灰树花的多糖产量具有
显著影响 ,其 p值分别为 0.0429、0.0499和 0.0372,其他
因素在 α=0.05的水平上对其表达量的影响不显著。所
以将接种量 、培养温度和葡萄糖用量这 3个因素进一步采
用响应面法进行优化 ,以确定最佳发酵培养条件 ,而其他
因素的取值则根据各因素效应的正负和大小 ,正效应的因
素均取较高值 ,负效应的因素均取较低值。
2.2最陡爬坡试验
响应面拟合方程只在考察的紧接邻域里才充分近似
真实情形 ,要先逼近最佳值区域后才能建立有效的响应面
拟合方程。最陡爬坡法以试验值变化的梯度方向为爬坡
方向 ,根据各因素效应值的大小确定变化步长 ,能快速 、经
济地逼近最佳值区域 [ 7] 。由 Placket-Burman试验结果
设计主要因素的最陡爬坡路径 ,其中接种量有显著正效
应 ,应增加;培养温度和葡萄糖用量有显著负效应 ,应减
小。根据这 3个因素效应大小的比例设定其变化方向及
步长进行试验 ,设计及结果见表 5。
表 5 最陡爬坡实验设计及其实验结果
Table5. Designsandresultsofthepathofsteepestascenttests
试验号 X1接种量 /%
X2培养温度 /
℃
X3葡萄糖用量 /
%
Y多糖产量 /
(g·L-1)
1 6 22 2 1.09
2 8 24 4 1.35
3 10 26 6 1.70
4 12 28 8 1.57
5 14 30 10 1.46
　　由表 5可见 ,最优发酵条件可能在试验 3与试验 4之
间 ,故以试验 3的条件为响应面试验的中心点。
2.3响应面分析试验设计优化纤灰树花发酵条件
2.3.1响应面设计及结果分析
依据 Placket-Burman试验和最陡爬坡试验确定的
试验因素与水平 ,采用 Box-Benhnken试验设计对产灰树
花发酵条件进行 3因素 3水平的响应面分析试验 ,包括 12
个析因试验和 3个中心试验。运用 SAS软件的 RSREG
(Responsesurfaceregresion)程序对 15个试验点的响应值
进行回归分析。 15个试验点可分为 2类:一是析因点 ,自
变量取值在各因素所构成的三维顶点 ,共有 12个析因点;
二是零点 ,为区域的中心点 ,零点试验重复 3次 ,用以估计
试验误差 ,以灰树花多糖产量为响应值 ,经回归拟合后 ,确
定函数表达式。试验结果见表 6。
该试验回归方程为:
Y1=1.86+0.07X1+0.03625X2+0.05125X3-0.5025X12 -0.0075X1X2
+0.0275X1X3-0.205X22 +0.01X2X3-0.28X32
表 6 Box-Behnken试验设计及相应结果
Table6.DesignsandresultsofBox-Behnkendesign
试验号 X1 X2 X3 Y1多糖产量 /(g·L-1)
1 -1 -1 0 1.03
2 -1 1 0 1.1
3 1 -1 0 1.22
4 1 1 0 1.26
5 0 -1 -1 1.31
6 0 -1 1 1.35
7 0 1 -1 1.38
8 0 1 1 1.46
9 -1 0 -1 0.98
10 1 0 -1 1.03
11 -1 0 1 1.07
12 1 0 1 1.23
13 0 0 0 1.85
14 0 0 0 1.83
15 0 0 0 1.9
表 7 回归方程中回归系数的估计值及方差分析
Table7.Estimatedvalueoftheregressioncoeficientand
varianceanalysis
方差来源 自由度 平方和 均方 F值 Pr>F
X1 1 0.0392 0.0392 21.13208 0.005856
X2 1 0.010513 0.010513 5.667116 0.06312
X3 1 0.021013 0.021013 11.32749 0.019985
X1X1 1 0.932331 0.932331 502.6042 0.0001
X1X2 1 0.000225 0.000225 0.121294 0.74182
X1X3 1 0.003025 0.003025 1.630728 0.257689
X2X2 1 0.155169 0.155169 83.64918 0.000262
X2X3 1 0.0004 0.0004 0.215633 0.661905
X3X3 1 0.289477 0.289477 156.0522 0.0001
模型 9 1.306058 0.145118 78.23051 0.0001
线性 3 0.070725 0.023575 12.70889 0.008929
平方 3 1.231683 0.410561 221.3267 0.0001
交互 3 0.00365 0.001217 0.655885 0.613176
参差 5 0.009275 0.001855
失拟项 3 0.006675 0.002225 1.711538 0.389471
纯误差 2 0.0026 0.0013
总离差 14 1.315333
　　注:Pr>F的值小于 0.05为影响显著;Pr>F的值小于 0.01为影响
极显著。
采用 SASRSREG程序对表 5数据进行 ANOVA分析 ,
结果见表 7。该方程回归显著 ,模型的复相关系数的平方
即 R2 =0.9929,说明回归方程的拟合程度良好 ,失拟较
研究报告 中　国　酿　造 2009年第 9期总第 210期 97　
小 ,可以用该方程代替真实试验点进行分析。由表 6中的
p值可知道 ,方程中 X3对 Y值的影响达显著水平 ,而方程
中 X1、X1X1、X2X2和 X3X3对 Y值的影响达极显著水平 ,
表明试验因子对响应值不是简单的线性关系 ,二次项对响
应值也有很大的关系 ,这和模型回归中的线性和平方项影
响显著相对应。交互项系数均不显著 ,所以交互作用的
影响相对较小。失拟项的 p=1.712,没有显著性影响 ,
说明数据中没有异常点 ,不需要引入更高次数的项 , 模
型适当。 　　
2.3.2响应面直观分析
附图 接种量 、培养温度 、葡萄糖添加量对灰树花发酵产多糖的响应面分析
Attachedfigure.Responsesurfaceanalysisofefectsofinoculum concentration, temperatureandamountofglucoseonyieldofGrifola
frondosapolysaccharide
　　附图直观地给出了各个因子交互作用的响应面的 3D
和等值线分析图。从响应面的最高点和等值线可以看出 ,
在所选的范围内存在极值 ,既是响应面的最高点 ,同时也
是等值线最小椭圆的中心点。
附图 A显示了当葡萄糖添加量位于中心水平时 ,接
种量和培养温度对灰树花多糖产量影响的响应面和等高
线图。从附图 A可以直观地看出接种量 、培养温度的交
互作用较强 ,因为等高线的形状反映交互效应的强弱大
小 ,圆形表示 2因素交互作用不显著 ,而椭圆形则与之相
反。并发现培养温度轴向等高线变化密集 ,而接种量轴向
等高线的变化相对稀疏 ,故接种量对响应值峰值的影响较
培养温度影响大。
附图 B显示了当培养温度位于中心水平时 ,接种量
和蔗糖葡萄糖添加量对灰树花多糖产量影响的响应面和
等高线图。由附图 B可知 ,接种量与葡萄糖添加量的交
互作用不大。
附图 C显示了当接种量位于中心水平时 ,培养温度
和蔗糖添加量对灰树花多糖产量影响的响应面和等高线
图。结果表明 , 培养温度和蔗糖添加量的交互作用
也不大。 　　
通过软件分析 ,得到灰树花液体发酵工艺最佳条件为
接种量 10%,培养温度 26℃,葡萄糖添加量 4%。此条件
下 ,灰树花多糖产量最大为 1.89g/L。为检验响应曲面法
所得结果的可靠性 ,采用上述优化发酵条件进行发酵培
养 ,实际测得的灰树花多糖产量为 1.91g/L,与理论预测
值相比 ,其相对误差约为 1%,因此 ,基于响应曲面法所得
的灰树花发酵条件参数准确可靠 ,具有实用价值。
3结论
试验证明响应面方法是优化发酵条件非常有效的工
具 , Placket-Burman试验设计能对影响灰树花多糖的各
因素进行评价并能有效地找出主要原因 ,最陡爬坡法能充
分接近最大响应面区域 , Box-Behnken试验设计能建立
主要因素影响灰树花效价的二次多项数学模型 ,并利用统
计学方法对该模型进行了显著性检验 ,优化了内在因素水
98　　　 2009 No.9SerialNo.210 ChinaBrewing ResearchReport
　
　　　　　收稿日期:2009-05-06
　　　　　作者简介:陈　超(1983-),男 ,山东临沂人 ,在读硕士研究生 ,研究方向为现代酿酒技术;王君高＊ ,教授 ,通讯作者。
平 ,找出最佳值。研究经响应面方法优化 ,得出产灰树花
多糖的最佳发酵条件为接种量 10%,培养温度 26℃,葡萄
糖添加量 4%,在优化条件下经 3批摇瓶培养试验验证 ,
预测值与验证试验平均值接近 ,此培养条件下灰树花多糖
产量可达到 1.91g/L。
参考文献:
[ 1] 邵　伟 ,吴　炜 ,仇敏 ,刘世玲.灰树花胞外多糖液体发酵动力学模
型的构建及应用 [ J] .食用菌, 2006(3):6-7.
[ 2] 汪维云 ,吴梧桐.灰树花深层培养的生长动力学与计算机模拟 [ J].
生物数学学报 , 2003, 17(4):494-498.
[ 3] 魏红福 ,王志江.灰树花菌丝体深层发酵条件研究 [ J] .湖南农机 ,
2007(5):160-162.
[ 4] 彭　红.灰树花的栽培和开发现状 [ J].食用菌 , 1998, 20(4):2-4.
[ 5] 黄幸纾.灰树花多糖及其抗癌作用 [ J].中国食用菌 , 1994, 13(1):
41-43.
[ 6] AHUJASK, FERRIRAGM, MOREIRAAR.ApplicationofPlacket
-Burmandesignandresponsesurfacemethodologytoachieveexponen-
tialgrowthforaggregatedshipwormbacterium[ J] .BiotechnolBioeng,
2004, 85:666-675.
[ 7] 赵国华 ,胡惠康 ,李　楹, 等.氧化物修饰电极降解有机污染的电催
化特性 [ J] .中国环境科学 , 2003, 23(4):385-389.
响应面法优化黄原胶发酵培养基
陈　超 ,王君高＊ ,周喜燕 ,李环宇
(山东轻工业学院 食品与生物工程学院 ,山东济南 250353)
摘　要:用响应面分析法优化黄原胶发酵培养基, 通过测定发酵液黏度、粗胶含量 ,利用部分因子分析法研究发酵培养基各成分对
响应值的影响程度 ,经最陡爬坡实验和中心组合实验确定玉米浓度和豆饼粉的浓度。得出玉米淀粉 5.78%, 豆饼粉 0.52%时, 黄
原胶的产量达到 27.325g/L, 产量比优化前提高了 15.7%, 黏度达到 5734mPa·s。
关　键　词:黄原胶;野油菜黄单胞菌;响应面分析
中图分类号:文献标识码:　　　文章编号:0254-5071(2009)09-0098-04
Optimizingxanthangumfermentationmediumbyresponsesurfacemethod
CHENChao, WANGJungao＊ , ZHOUXiyan, LIHuanyu
(CollegeofFoodandBioengineering, ShangdongInstituteofLightIndustry, Jinan250353 , China)
Abstract:Responsesurfacemethodologywasusedtooptimizexanthangumfermenationmedium.Theviscosityoffermentationbrothandcrudexan-
thangumyieldweredeterminedthefermentationmedium.Theimpactofinitialmediumconstituentsonxanthangumyieldwasstudiedbyfractional
factorialdesign.Cornstarchandbeancakepowderconcentrationwereoptimizedbythepathofsteepestascentdesignandcentralcompositedesign.
Whencornstarchconcentrationwas5.78% andconcentrationofbeancakepowderwas0.52%, thexanthangumyieldwasupto27.325g/L, in-
creased15.5%;viscosityoffermentationbrothwasupto5734cP.
Keywords:xanthangum;Xanthomonascampestris;responsesurfaceanalysis
　　黄原胶又称汉生胶 、黄杆菌胶 、黄杆菌多糖等 ,是
1962年发现的一种细菌胞外多糖 ,由野油菜黄单胞菌
(Xanthomonascampestris)产生。其分子组成主要有 D-葡
萄糖 、D-甘露糖和 D-葡萄糖糠醛 ,比例为 2∶2∶1。此外 ,
还有 2%～ 6%的丙酮酸和 4.5%的乙酸。相对分子质量
为(100×104u～ 1000×104u)[ 1] 。黄原胶具有独特的理化
性质 ,可以溶于冷水和热水中 ,低浓度时就有很高的黏
度 ,有良好的剪切稀释恢复能力 ,有很好的乳胶稳定性
能和悬浊液稳定性能 ,其粘性非常稳定 ,具有高黏度 、高
耐酸碱 、耐盐特性 ,高耐热稳定性 、触变性 、悬浮性等 ,常
被用作增稠剂 、乳化剂 、悬浮剂 、稳定剂 ,在化工 、食品 、
陶瓷 、医药 、纺织 、采油 、印染 、涂料 、炸药 、冶金 、造纸 、灭
火 、农药和化妆品等 20多个领域中有广泛应用 ,具有广
阔的市场前景 ,是目前世界上生产规模最大且用途极为
广泛的微生物多糖 [ 2] 。本研究对黄原胶的发酵培养基
进行了研究。
1材料与方法
1.1菌种
野油菜黄单胞菌菌株(Xanthomonascampestris):本实
验室保藏。
1.2设备
GNP-9080型隔水式恒温培养箱 , HZQ-QX全温振荡
器 , LDZX-50KB立式电热压力蒸汽灭菌器 , DV-E黏度计 ,
烘箱 , FA1004电子天平 , SW-CJ-IC净化工作台等。