全 文 ： 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2013, 48 (11): 1665−1670 · 1665 ·



高硫代度红芪多糖硫酸酯的制备及体外抗凝血活性研究
郭 龙, 杨英来, 杨 涛, 刘子亨, 封士兰*
(兰州大学药学院, 甘肃 兰州 730000)
摘要: 通过氯磺酸−吡啶法对低硫代度的红芪多糖硫酸酯 (SHG) 硫酸化修饰, 控制硫酸化过程中反应温
度、时间及酯化剂比例成功制备出不同硫代度的 SHG; 紫外光谱 260 nm附近、红外光谱 1 240和 810 cm−1附近
出现特征吸收峰, 结合硫元素分析以及硫酸钡明胶比浊法共同计算出硫代度; 质量浓度相同条件下随硫代度增
大光谱中特征吸收峰强度也相应增强; 通过体外抗凝血实验以凝血酶原时间 (PT)、活化部分凝血活酶时间
(APTT)、血浆凝血酶时间 (TT) 值来评价抗凝血活性, 结果表明高硫代度的 SHG 具有较好的体外抗凝血活性,
并且在一定范围内随硫代度的提高抗凝血活性呈上升趋势。
关键词: 红芪多糖硫酸酯; 硫代度; 体外抗凝血活性
中图分类号: R916 文献标识码: A 文章编号: 0513-4870 (2013) 11-1665-06
Sulfated modification and anticoagulant activity in vitro of sulfated
glucan isolated from the aqueous extract of Hedysarum polybotrys
GUO Long, YANG Ying-lai, YANG Tao, LIU Zi-heng, FENG Shi-lan*
(School of Pharmmacy, Lanzhou University, Lanzhou 730000, China)

Abstract: SHG was sulfated by chlorosulfonic acid − pyridine method, and six samples which we got were
prepared in different reaction conditions. There is a characteristic absorption peak near 260 nm in UV spectra
and there are two characteristic absorption peaks near 1 240 cm−1 and 810 cm−1 in the FT-IR. Degree of
sulfation (DS) was calculated by elemental analysis and turbidimetry. Under the same conditions the absorption
peaks become strong with the DS increase. The anticoagulant activity of SHG and sulfated modification
samples was evaluated by the classic coagulant assays of prothrombin time (PT), activated partial thrombin
time (APTT) live enzymes, and plasma thrombin time (TT). Results show that sulfated SHG has a good
anticoagulant activity in vitro, and DS increased activity within a certain range.
Key words: Hedysarum polybotrys sulfated glucan; degree of sulfation; anticoagulant activities in vitro

红芪多糖硫酸酯 (SHG) 是一种由传统中药红
芪 (Hedysarum polybotrys Hand.-Mazz) 中提取分离
出的天然低硫代度的葡聚糖硫酸酯, 石义凯等[1]确定
其结构是由 α-D (1−4) 吡喃葡萄糖构成主链; 每隔 8
个糖残基在O-6位上有一个非还原末端分支; 每隔 38
个糖残基 O-6位上有一个硫酸基。
多糖硫酸酯又称作硫酸脂多糖, 广泛的存在于

收稿日期: 2013-04-22; 修回日期: 2013-07-01.
基金项目: 甘肃省科技计划资助项目 (1304FKCA101).
*通讯作者 Tel / Fax: 86-931-8915686, E-mail: fengshl@lzu.edu.cn
自然界中, 其作为多糖的一种衍生物, 它在分子识别,
细胞的生长、分化, 细胞间的相互影响上起重要作
用。大量的天然硫酸脂多糖研究表明这种多糖的衍生
物具有显著的生物活性[2−6], 如抗凝血、抗血栓、防
止血管增生、抗氧化抗炎、抗肿瘤、抗病毒等。这些
显著的生物活性引起人们寻求化学修饰或人工合成
的方法来扩大多糖的应用。化学修饰的方法对多糖进
行硫酸衍生化处理是得到高硫代度硫酸脂多糖重要
途径之一[7], 经典的方法有浓硫酸法、三氧化硫吡啶
法及氯磺酸吡啶法。有文献[8−12]报道, 多糖硫酸酯的
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硫代度与其抗凝血活性有着很大的关系, 一般随着
硫代度的升高其抗凝血活性也相应增加。
SHG 本身是一个低硫代度的多糖硫酸酯, 无抗
凝血活性。因此本文拟将 SHG 通过硫酸化修饰提高
其硫代度进而增加生物活性。本实验通过氯磺酸吡啶
法硫酸化 SHG 并首次制备出高硫代度的 SHG, 增加
了 SHG的抗凝血活性, 探讨了 SHG硫代度与抗凝血
之间的关系。

结果与讨论
1 不同条件下的 SHG硫代度
由表 1 可见, 氯磺酸吡啶法硫酸化 SHG 过程中
影响硫代度最大的 3个因素[13−15]为反应时间、温度和
酯化剂制备时氯磺酸与吡啶比例, 本实验通过改变
各因素水平制备出 SHG-1、SHG-2、SHG-3、SHG-4、
SHG-5和 SHG-6六种样品。由于 SHG的硫酸化修饰
是一个亲核取代的过程, -OH 被-OSO3Na 取代, 在
SHG 分子不发生降解的前提下分子量也相应增加,
这就导致产物与反应物的比率大于 1; 而比率的大小
在 SHG 未降解的前提下反映硫酸酯基取代程度, 因
此初步推断硫酸酯基取代程度的大小顺序可能为
SHG-3 > SHG-2 > SHG-4 > SHG-1 > SHG-6 > SHG-5。
2 硫酸化 SHG的紫外光谱
由图 1可以看出 6个硫酸化后的 SHG样品均在
260 nm 附近处出现特征吸收峰[12, 16], 此吸收峰归属
于 S=O 所引起的 n → π*跃迁; 而 SHG 在此处的吸收
值非常小, 这是由于同样质量浓度条件下, SHG硫代
度很低, 因此吸收峰响应值也相应较低。
同质量浓度条件下, 7 个样品 260 nm 附近吸收
值的强弱顺序为 SHG-3 > SHG-2 > SHG-4 > SHG-1 >
SHG-6 > SHG-5 > SHG; 因为 SHG在此处的吸收值强
Table 1 SHG and yield under different reaction conditions to
deal with
Reaction condition
Sample
t/h T/℃ Ratio
(chlorosulfonic acid∶pyridine)
Yield
/%
SHG-1 7 45 1∶3 1.21
SHG-2 7 45 1∶5 1.60
SHG-3 3 75 1∶5 1.75
SHG-4 3 45 1∶3 1.50
SHG-5 5 30 1∶4 1.05
SHG-6 5 60 1∶2 1.13

弱是由硫酸酯基的含量决定, 由此推断硫酸化 SHG
的硫代度大小顺序可能也如此, 而此顺序与产物与
反应物的比率分析结果相符。
3 硫酸化 SHG的红外光谱
一般情况下傅里叶转换红外光谱[2, 12, 16, 17] 3 450
cm−1 附近为 -OH 的伸缩振动峰; 2 930 cm−1 附近归
属为 -CH2- 的不对称伸缩振动峰; 对 SHG 及硫酸化
SHG-2、SHG-3、SHG-5样品的红外光谱图 (图 2) 分
析可见, 4个样品均在 1 240 cm−1附近和 820 cm−1附
近处出现两个特征吸收峰, 前者归属于 S=O 的伸缩
振动, 后者归属于 C-O-S的伸缩振动。由图 2对比可
见 1 240 cm−1 处特征吸收峰的吸收强度大小顺序为
SHG-3 > SHG-2 > SHG-5 > SHG , 因此判断样品中硫酸
酯基含量大小顺序也为此, 与紫外光谱分析结果及
产物与反应物的比率分析结果均一致。
对 α-D (1−4) 吡喃葡萄糖来说, C-6位上-OH更易
被取代。也易形成较稳定的优势构象即最大基团 (硫
酸酯基) 处于 e 键; 一般情况在 820 cm−1附近出现
吸收峰时, 硫酸基是位于单糖残基的平伏位置[16, 17];
图 2中数据表明硫酸化 SHG的硫酸酯基团大部分是
在 C-6位上的取代。


Figure 1 UV-vis spectra of SHG-3 (a), SHG-2 (b), SHG-4 (c), SHG-1 (d), SHG-6 (e), SHG-5 (f) and SHG (g)
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Figure 2 FTIR spectra of SHG (a), SHG-5 (b), SHG-2 (c) and SHG-3 (d)

由图 2中可见 3 450 cm−1附近 -OH的伸缩振动峰
强度相对减少但不是特别明显, 这可能主要是由于硫
酸基取代羟基引起的 -OH 数目减少的同时溴化钾压
片样品时不可避免的引入部分水所引起的; 2 930 cm−1
附近-CH2-的不对称伸缩振动吸收峰明显减小, 可能
主要是因为 C-6 位上发生硫酸基取代的同时增大了
-CH2-弯曲振动的空间位阻, 从而使其振动减少。
4 硫元素分析
氯化钡明胶比浊法测硫酸基含量、硫代度及样品
回收率, 结果见表 2。

Table 2 Sulfur and sulfate content, degree of sulfation and
recovery rate of SHG
Sample S/%
Degree of
sulfation
SO42− %
/μg·mL−1
Recovery
/%
SHG 0.47 0.025 14.4 −
SHG-1 10.74 0.82 322 91.9
SHG-2 13.12 1.2 396 94.7
SHG-3 14.66 1.4 441 92.4
SHG-4 12.05 0.98 360 93.7
SHG-5 6.70 0.43 201 96.5
SHG-6 8.02 0.55 240 94.8

由表 2 可见 SHG 及 6 个硫酸化 SHG 样品硫元
素含量、硫酸基含量大小顺序为: SHG-3 > SHG-2 >
SHG-4 > SHG-1 > SHG-6 > SHG-5 > SHG。硫元素含量分
析结合硫酸基含量测定结果得出硫代度大小顺序为
SHG-3 > SHG-2 > SHG-4 > SHG-1 > SHG-6 > SHG-5 >
SHG , 此分析结果与光谱分析结果和产物与反应物
的比率分析结果均一致。样品的回收率大于 90% , 这
同时说明硫酸化过程中 SHG 未因反应条件的剧烈所
降解, 主链结构未被破坏。
样品回收率大于 90%, 产物与反应物的比率大于
100% , 结合光谱分析结果和硫元素及硫酸基含量分
析结果, 表明本实验成功制备了高硫代度 SHG, 此衍
生物主链结构未降解, 硫酸基取代主要发生在C-6位
上。
5 抗凝血活性分析
体外抗凝血[12, 16]活性实验中, 凝血酶原时间 (PT)
值反应的是外源性凝血系统的凝血状况、活化部分凝
血活酶时间 (APTT) 值反应的是内源性凝血系统各
凝血成分总和的凝血状况, 而血浆凝血酶时间 (TT)
值则是评价内源性血浆纤维蛋白原转变为纤维蛋白
的凝血状况。
图 3中 A和 B分别为肝素钠和 SHG-1抗凝血活
性的量效曲线, 结果表明体外抗凝血活性试验中,肝
素钠和 SHG-1 对 APTT 值影响最大, 其次是 TT 值,
对 PT值没有影响。这表明两者在抗凝血途径上主要
是通过内源性途径综合影响而非外源性凝血途径 ;
由图 3可知 SHG-1浓度约在 50 μg·mL−1时与肝素钠
浓度为 16 μg·mL−1时等效, 这表明 SHG-1 的抗凝血
效果弱于肝素钠; 肝素钠和 SHG-1均表现出一定的量
效关系, 但 TT值变化趋势小于 APTT值。
表 3为不同取代度 SHG不同浓度下体外抗凝血
APTT和 TT测定值, 由于样品的所有浓度下 PT测定
值均在 6.5～6.8, 基本无影响故未列出; SHG对 APTT
和TT值没有表现出量效关系, 表明 SHG无抗凝血活
性; 而硫酸化后的高硫代度 SHG 的测试结果显示出
一定的量效关系。
图 4中 A和 B为质量浓度在 40 μg·mL−1下取代
度与抗凝血活性关系图。结果所示硫代度对 PT值均
没有影响, 而硫代度在 0.025～1.2内, TT值和 APTT
值随硫代度的增大也相应变长, 硫代度增加到 1.4 时
TT值和APTT值与硫代度为 1.2时无显著性差异, 再
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Figure 3 Anticoagulant activity of heparin sodium and SHG-1 at the different concentration. n = 3, x ± s

Table 3 Anticoagulant activities of different concentrations of SHG in vitro
Clotting time/s
SHG SHG-2 SHG-3 SHG-4 SHG-5 SHG-6
C/
μg·mL−1
APTT TT APTT TT APTT TT APTT TT APTT TT APTT TT
0 20.6 ± 0.02 16.7 ± 0.08 20.6 ± 0.02 16.7 ± 0.01 20.6 ± 0.02 16.7 ± 0.02 20.6 ± 0.02 16.7 ± 0.01 20.6 ± 0.02 16.7 ± 0.01 20.6 ± 0.02 16.7 ± 0.01
20 20.5 ± 0.08 17.1 ± 0.01 57.9 ± 0.02 30.3 ± 0.08 60.3 ± 0.02 29.9 ± 0.01 41.7 ± 0.02 25.7 ± 0.02 23.0 ± 0.02 18.3 ± 0.02 27.0 ± 0.08 19.5 ± 0.02
40 20.4 ± 0.08 17.0 ± 0.02 120.8 ± 0.08 35.6 ± 0.01 121.4 ± 0.08 35.3 ± 0.01 87.6 ± 0.01 31.9 ± 0.08 27.1 ± 0.08 20.6 ± 0.08 37.9 ± 0.01 22.0 ± 0.02
60 20.6 ± 0.02 17.2 ± 0.02 147.6 ± 0.02 57.6 ± 0.01 140.4 ± 0.02 59.3 ± 0.08 118.6 ± 0.02 45.2 ± 0.01 45.6 ± 0.08 23.1 ± 0.08 54.8 ± 0.08 33.9 ± 0.01
80 20.5 ± 0.01 16.9 ± 0.01 168.2 ± 0.01 71.9 ± 0.01 167.9 ± 0.08 72.3 ± 0.08 137.9 ± 0.02 60.1 ± 0.02 57.9 ± 0.01 34.3 ± 0.01 67.7 ± 0.08 43.2 ± 0.02


Figure 4 Anticoagulant activity of different SHG at the same concentration (40 μg·mL−1). n = 3, x ± s

结合表 3中其他浓度下 TT值和APTT值的变化趋势,
表明硫代度继续增加时抗凝血活性呈不规律变化。
由以上分析综合所有抗凝血数据表明: 经硫酸
化修饰后的 SHG 增加了抗凝血活性 ; 硫代度在
0.025～1.2 内, 抗凝血活性有量效关系, 并随硫代度
增加而增强。

讨论
为了探讨 SHG 硫代度与生物活性的关系, 本实
验通过控制硫酸化条件将 SHG 修饰得到不同硫代度
的 SHG。
化学修饰的方法提高多糖硫代度, 常因反应条
件剧烈导致多糖降解进而引起多糖结构的破坏, 造
成活性对比研究的复杂性及多变性; 本实验先单独
制备酯化剂, 再将多糖加入反应溶媒 DMF 中, 使多
糖很好的分散, 避免多糖直接与氯磺酸接触, 再选择
适当的温度降低反应条件, 从而达到保护多糖链结
构避免多糖结构破坏; 硫酸化修饰后的 SHG 在解决
了硫代度低的同时由于硫酸基团的引入, 水溶性也
相应增加。
郭 龙等: 高硫代度红芪多糖硫酸酯的制备及体外抗凝血活性研究 · 1669 ·

不同硫代度的 SHG 抗凝血活性研究表明, SHG
的抗凝血活性与硫代度有相关性, 在一定的硫代度范
围内生物活性随硫代度的增加而提高; 当硫代度超
过 1.2以后活性不再增强, 硫代度为 1.4的 SHG-3较
硫代度为 1.2的 SHG-2抗凝血活性呈不规律变化, 这
是因为多糖硫酸酯作为生物大分子多糖的衍生物 ,
其生物活性往往是由多糖分子量、链结构、溶解性、
硫酸基取代位置、硫代度等多方面综合作用的结果,
在某几个影响因素恒定的前提下硫代度的变化与生
物活性的变化一致, 起决定性作用, 而当 SHG 硫代
度达到 1.2时, 硫代度对 SHG抗凝血活性的影响达上
限, 即不随硫代度增加表现出抗凝血活性的增强。
本实验用化学修饰的方法成功制备出高硫代度
的 SHG , 提高了其抗凝血活性, 表明硫代度是影响
SHG抗凝血活性的重要因素。

实验部分
紫外扫描仪 (Lambda 25 UV/vis spectrometer,
美国 Perkin Elmer 公司); 傅里叶变换红外光谱仪
(EEXUS670, 美国 Nicolet 公司); 元素分析仪 (Vario
EC, 德国Elementar公司); 紫外分光光度计 (UV-1700,
日本岛津); 低温离心机 (Z36HK 德国 Hermle 公司);
全自动凝血仪 (CA-7000, 日本 sysmex corporation.
Kobe公司)。红芪多糖硫酸酯 (实验室自制); 抗凝血
试剂盒 (德国 Siemens公司); 肝素钠 (150 U·g−1, 上
海中泰); 戊巴比妥钠 (美国 sigma 公司); 透析袋
(截留分子量 3 500 Da, 美国科技发展公司); 分子筛
(5A 型, 上海山浦化工公司, 分析纯); 其他试剂均为
国产分析纯。
实验动物: 清洁级家兔 由兰州大学 GLP实验中
心提供, 实验动物合格证号: SCXK (甘) 2009-0004。
1 SHG制备
将中药红芪[1]粉碎, 乙醇脱脂, 水提醇沉, 除蛋
白脱色素以后, 经阴离子交换树脂及葡聚糖凝胶分
离后得到。
2 硫酸化
称取 6 份 SHG , 每份约 30 mg, 分别用 10 mL
DMF 充分分散。冰盐浴搅拌条件下缓慢滴加氯磺酸
至脱水吡啶中制备酯化剂。将制备好的酯化剂和
SHG 的 DMF 分散液混合, 搅拌, 反应, 酯化剂制备
和硫酸化条件见表 1。反应结束后加氢氧化钠调 pH
值至中性, 用分子截留量为 3 500 Da的透析袋透析,
袋内样品冷冻干燥, 得硫酸化 SHG。
3 硫酸化 SHG的光谱分析及硫元素分析
采用 Lambda25型紫外可见分光光度计进行紫外
区特征吸收峰扫描; 采用 EEXUS 670 型傅里叶变换
红外光谱仪对其进行红外光谱分析, 用 Varion EC型
元素分析仪对其进行硫元素分析。
4 氯化钡明胶比浊法测定硫酸基含量
采用 2 mol·L−1 TFA将硫酸基释放出来与钡离子
在明胶中形成浑浊, 于波长 360 nm处测定浊度。精密
称取 105 ℃干燥至恒重的硫酸钠 88.75 mg于 100 mL
量瓶中, 用 1 mol·L−1的盐酸溶液定容, 得 600 μg·mL−1
硫酸根标准液; 称取 2.5 g无水氯化钡于 250 mL量瓶
中, 用 3% 的明胶溶液定容, 得质量分数为 1% 的氯化
钡明胶溶液; 分别精密量取 0.02、0.1、0.2、0.4、0.8
和 1.0 mL的硫酸根标准液于试管中, 依次加入 1% 盐
酸 0.98、0.9、0.6、0.2、0 mL后再分别加入 2 mol·L−1
TFA 溶液 3 mL; 平行做 A、B 两组, A 组加上述制
备的氯化钡明胶溶液 1 mL, B 组加 3% 的明胶溶液
1 mL振荡后静置 15 min, 以 1% 的盐酸为空白对照,
以 B 组各试管为参比测 A 组各管吸收值。以硫酸根
浓度 (C/μg·mL−1) 为横坐标, 以吸收值 (A) 为纵坐
标做线性回归, 回归方程为 A = 0.001 3 C + 0.114 1, r =
0.999 1, 硫酸根在 12～600 μg·mL−1内线性关系良好。
5 硫酸基含量测定
精密称取硫酸化 SHG 配制成质量浓度为 1
mg·mL−1的样品溶液, 精密量取 1 mL 样品溶液至试
管中, 按照上述方法进行硫酸基含量测定。
6 硫代度及样品回收率分析
以硫元素分析结果及硫酸基含量测定结果共同
计算出样品硫代度[12], 除去硫酸基含量结合硫酸化
SHG的产量及投料计算出样品回收率。
7 抗凝血活性体外测试
肝素钠作为阳性对照, 用生理盐水作为空白对
照, 进行体外抗凝血实验, 采用 PT、APTT、TT值进
行评价。家兔静脉注射戊巴比妥钠麻醉, 心脏取血,
低温离心制得除血细胞血浆, 按试剂盒要求操作在
自动凝血仪上测定 PT、APTT和 TT值。
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