全 文 ：书植物资源与环境学报，2015，24(4) :1 － 9
Journal of Plant Ｒesources and Environment
荷花 NnγGCS基因的克隆及表达分析
张阿慧1，刘兆磊1，①，顾春笋2，陈发棣1，蒋甲福1，陈素梅1
〔1． 南京农业大学园艺学院，江苏 南京 210095;2． 江苏省·中国科学院植物研究所(南京中山植物园) ，江苏 南京 210014〕
摘要:以荷花品种‘台城拂翠’(Nelumbo nucifera‘Taicheng Focui’)嫩叶为材料，采用简并引物 PCＲ 和 ＲACE 技术
得到荷花 γGCS基因的全长 cDNA序列，命名为 NnγGCS。序列分析结果表明:NnγGCS基因 cDNA序列的全长为
1 801 bp，其开放阅读框(OＲF)长度为 1 569 bp，编码 522 个氨基酸残基。NnγGCS 蛋白质的理论相对分子质量为
59 159． 0，理论等电点为 pI 6． 27，稳定指数为 39． 60;该蛋白质无跨膜结构域，但具有 1 个保守的 GCS2 结构域，并被
定位于细胞质和叶绿体中，说明 NnγGCS蛋白质较稳定，并属于谷氨酰半胱氨酸连接酶家族。系统进化分析结果
表明:荷花 NnγGCS氨基酸序列与龙眼(Dimocarpus longan Lour．)和黄瓜(Cucumis sativus Linn．)等双子叶植物 γGCS
氨基酸序列的亲缘关系较近，与水稻(Oryza sativa Linn．)等单子叶植物 γGCS氨基酸序列的亲缘关系较远。实时荧
光定量 PCＲ扩增结果显示:NnγGCS基因在荷花各器官中均能表达，且在嫩叶中的相对表达量最高、在茎中的相对
表达量最低。不同浓度镉胁迫条件下，NnγGCS 基因在荷花嫩叶和须根中的相对表达量及表达趋势差异较大;
NnγGCS基因的相对表达量在嫩叶中总体表现为随胁迫时间延长先下降后上升，在须根中表现为 200 μmol·L －1镉
胁迫 1 h和 400 μmol·L －1镉胁迫 12 h时显著高于初始水平、而在其他胁迫时间与初始水平差异不明显。亚细胞
定位结果显示:NnγGCS基因能够在洋葱(Allium cepa Linn．)表皮细胞的细胞质中表达，说明该基因编码的蛋白质在
细胞质中发挥作用。研究结果显示一定浓度的镉胁迫能够诱导 NnγGCS基因的表达。
关键词:荷花;NnγGCS基因;克隆;相对表达量;镉胁迫;亚细胞定位
中图分类号:Q943． 2;Q786;Q682． 32 文献标志码:A 文章编号:1674 － 7895(2015)04 － 0001 － 09
DOI:10． 3969 / j． issn． 1674 － 7895． 2015． 04． 01
Cloning and expression analysis of NnγGCS gene from Nelumbo nucifera ZHANG Ahui1，LIU
Zhaolei1，①，GU Chunsun2，CHEN Fadi1，JIANG Jiafu1，CHEN Sumei1 (1． College of Horticulture，
Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China;2． Institute of Botany，Jiangsu Province and
Chinese Academy of Sciences，Nanjing 210014，China) ，J． Plant Ｒesour． ＆ Environ．，2015，24(4) :
1 － 9
Abstract:Taking tender leaf of Nelumbo nucifera ‘Taicheng Focui’as materials，full-length cDNA
sequence of γGCS gene from N． nucifera was obtained by degenerate primer-PCＲ and ＲACE
technologies，the cDNA sequence is named as NnγGCS． The results of sequence analysis show that full-
length of cDNA sequence of NnγGCS gene is 1 801 bp，its open reading frame (OＲF)length is 1 569
bp，which encodes 522 amino acid residues． Theoretical relative molecular mass of NnγGCS protein is
59 159． 0，theoretical isoelectric point is pI 6． 27，and stability index is 39． 60． The protein has no
transmembrane structure domain but with one conserved GCS2 domain and the protein is localized in
cytoplasm and chloroplast，indicating that NnγGCS protein is stable and belonging to glutamate cysteine
ligase modulatory family． The phylogenetic analysis result shows that NnγGCS amino acid sequence of N．
nucifera has a close relationship with γGCS amino acid sequence of dicotyledon including Dimocarpus
longan Lour． and Cucumis sativus Linn．，etc，and has a distant relationship with γGCS amino acid
sequence of monocotyledon including Oryza sativa Linn．，etc． The amplification results of real-time
fluorescence quantitative PCＲ show that NnγGCS gene can be expressed in various organs of N． nucifera，
收稿日期:2015 － 03 － 17
基金项目:国家教育部新世纪优秀人才支持计划项目(NCEI － 11 － 0669) ;江苏省科技支撑计划项目(BE2011325)
作者简介:张阿慧(1988—) ，女，安徽阜阳人，硕士研究生，主要从事荷花耐重金属的分子生物学研究。
①通信作者 E-mail:lzl@ njau． edu． cn
and the relative expression in tender leaf is the highest，that in stem is the lowest． Under cadmium stress
with different concentrations，differences in relative expression and expression trend of NnγGCS gene in
tender leaf and fibrous root of N． nucifera are great． Ｒelative expression of NnγGCS gene in tender leaf
generally appears firstly decreasing and then increasing with prolonging of stress time，that in fibrous root
appears significantly higher than original level when 200 μmol·L －1 Cd stress for 1 h and 400 μmol·
L －1 Cd stress for 12 h，while without obvious difference with the original level at other stress times．
Subcellular localization result shows that NnγGCS gene can express in cytoplasm of epidermal cells of
Allium cepa Linn．，meaning that the protein encoded by this gene plays a role in cytoplasm． It is
suggested that Cd stress with a certain concentration can induce NnγGCS gene expression．
Key words:Nelumbo nucifera Gaertn．;NnγGCS gene; cloning; relative expression;Cd stress;
subcellular localization
荷花，学名莲(Nelumbo nucifera Gaertn．) ，为中国
十大传统名花之一，花大色艳，且地下茎和莲子均能
够食用［1］，观赏价值和经济价值具佳;此外，荷花还具
有降低水体污染［2］和积累重金属［3 － 4］的潜能。
γ －谷氨酰半胱氨酸合成酶(γGCS)是谷胱甘肽
(GSH)合成过程中的限速酶，能够调节 GSH的合成并
受 GSH 的反馈调节［5］，编码该合成酶的基因即为
γGCS基因。GSH 能够参与调节植物的多种抗逆过
程［6］，γGCS 基因在植物的抗逆过程中也有所响应，例
如受干旱、低温和过氧化胁迫等非生物胁迫诱导后
γGCS基因的表达水平发生明显变化［7 － 9］;过量表达
γGCS基因的芥菜〔Brassica juncea (Linn．)Czern．〕较其
野生型具有更强的镉积累能力，而且对重金属胁迫的
耐受力也有所增强［10］;镉胁迫下番茄(Lycopersicon
esculentum Miller)［11］和玉米(Zea mays Linn．)［12］植株
的 γGCS酶活性分别增强 2 和 8 倍，且随着镉浓度升
高 γGCS酶活性逐渐增强。
植物螯合素(phytochelatins，PC)又称植物螯合
肽，是 GSH 衍生的金属离子结合肽，能够螯合环境中
的重金属离子，有效降低重金属对植物的毒害作
用［13］。冯保民等［14］将从荷花中克隆获得的植物螯合
素基因 NnPCs 转化到拟南芥〔Arabidopsis thaliana
(Linn．)Heynh．〕中进行异源表达，结果显示镉胁迫下
转 NnPCs基因的拟南芥中该基因的表达增强，且其生
长状况优于野生型，体内的镉积累量也显著高于野生
型，说明 NnPCs基因能够提高拟南芥植株的重金属耐
受能力和镉积累能力。
GSH是 PC合成的前体，因此，明确荷花 γGCS 基
因的结构和功能对于研究该基因在积累重金属和解
除重金属毒害中的作用具有重要意义。鉴于此，作者
以荷花品种‘台城拂翠’(‘Taicheng Focui’)的嫩叶为
实验材料，采用简并引物 PCＲ和 ＲACE技术获得荷花
γGCS基因的全长 cDNA序列，并对该基因进行序列特
征、表达模式和表达定位分析，以期为进一步阐明在
荷花积累重金属的过程中 γGCS基因的作用提供参考
依据。
1 材料和方法
1． 1 材料
供试荷花品种‘台城拂翠’来源于南京艺莲苑有
限公司;实验于 2013 年 4 月在南京农业大学花卉遗传
与育种实验室内进行。取长约 15 cm 的根状茎，用等
量沙土种植于长 50 cm、宽 38 cm、高 29 cm 的周转箱
中，每个周转箱种植 1 株;注入自来水，直至水面超过
沙土表面 15 cm;将周转箱置于避雨温室内培养，当水
面低于沙土表面时及时补充水分。
实验用 ＲNA快速提取试剂盒购自北京原平皓生
物技术有限公司，DNA 片段纯化回收试剂盒(Agarose
Gel DNA Purification Kit Ver． 2． 0)、Ｒeal － Time PCＲ
Kit(SYBＲ Green)、DNaseⅠ、Sal Ⅰ、Not Ⅰ、Pvu Ⅰ、T4
DNA连接酶、LＲ 重组酶和 pMD19 － T 载体均购自宝
生物工程(大连)有限公司，cDNA 合成试剂盒
(SuperScript Ⅲ Ｒeverse Transcriptase)、5ＲACE 试剂
盒(5 ＲACE System for Ｒapid Amplification of cDNA
Ends Kit Version 2． 0)、pENTＲ1A 载体和 pMDC43 载
体均为美国 Invitrogen公司产品，大肠杆菌 DH5α购自
天根生化科技(北京)有限公司;所有引物的合成和测
序均委托上海捷瑞生物工程有限公司完成。
1． 2 方法
1． 2． 1 总 ＲNA 提取及 cDNA 合成 培养 7 至 8 周
后，任意选取 1 株具 7 或 8 枚叶片的健康荷花植株，采
2 植 物 资 源 与 环 境 学 报 第 24 卷
集鲜嫩叶片并包于锡纸内，液氮速冻后于 － 80 ℃保
存、备用。称取 0． 1 g 嫩叶样品，参照 ＲNA 快速提取
试剂盒说明书上的操作流程提取获得总 ＲNA 样品，
并用 DNaseⅠ去除总 ＲNA中残留的少量 DNA;用质量
体积分数 1%琼脂糖凝胶电泳检测总 ＲNA 样品的完
整性。按照 cDNA合成试剂盒说明书上的操作流程合
成 cDNA，并使用荷花内参基因 NnActin 检测 cDNA 质
量。
1． 2． 2 荷花 γGCS 基因全长 cDNA 序列的克隆 根
据 GenBank数据库中登录的洋葱(Allium cepa Linn．)、
黄瓜(Cucumis sativus Linn．)、拟南芥和百脉根(Lotus
corniculatus Linn．)等植物的 GCS氨基酸序列的保守序
列设计 1 对简并引物 GCS － F和 GCS － Ｒ，引物序列分
别为 5 － CCCTCTGGAGACCCTCAYCAＲACNTG － 3和
5 － GAAGATGGTGGTCAGGTGGTTYTCCCAＲTC － 3;
以荷花叶片 cDNA为模板进行 PCＲ扩增反应，反应体
系总体积 25 μL，包括 1． 0 μg·μL －1 cDNA 模板 1． 0
μL、10 × PCＲ buffer 2． 5 μL、10． 0 mmol·L －1 Mg2 + 1． 5
μL、2． 5 mmol·L －1 dNTPs 2． 0 μL、10． 0 mmol·L －1正
向和反向引物各 1． 0 μL及 5． 0 U·μL －1 rTaq DNA聚
合酶 0． 2 μL，用灭菌双蒸水补足体积。扩增程序为:
94 ℃预变性 5 min;94 ℃变性 30 s、50 ℃退火 30 s、72
℃延伸 30 s，共 35 个循环;最后于 72 ℃延伸 10 min。
回收扩增产物并将其连接到 pMD19 － T 载体上，
转化大肠杆菌 DH5α感受态细胞，37 ℃振荡培养 1．
5 h;将感受态细胞涂布在含有 50 μmol·mL －1氨苄青
霉素(Amp)的 LB 固体培养基上，37 ℃过夜培养;挑
取单克隆菌落，接种至含有 50 μmol·mL －1氨苄青霉
素的 LB 液体培养基中，37 ℃振荡培养 2 h;对菌液
DNA进行 PCＲ检测，选取含有目的条带(即 γGCS 基
因保守序列)的单个阳性克隆进行测序。
根据上述克隆获得的荷花 γGCS 基因的中间保守
序列设计 2 条 5ＲACE 反向引物 GCS － 51 和 GCS －
52，引物序列分别为 5 － CCTTCGCCTTACAACCAGAG
－3和 5 － AGCATCATCTGTAGGGGGGC － 3;接头引
物 为 AAP 和 AUAP，引物序列分别为 5 －
GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG － 3和
5 － GGCCACGC GTCGACTAGTAC － 3。并设计 2 条 3
ＲACE正向引物 GCS －31和 GCS －32，引物序列分别为
5 － ATGAGAAGCCACATTTGGACCGACAC － 3 和 5 －
TGGGTTTGAGCAGTATGTGGA －3;接头引物为 Jiang － T
和 Jiang － Ｒ，引 物 序 列 分 别 为 5 －
CTGATCTAGAGGTACCGGATCCTTTTTTTTTTTTTTTT － 3
和 5 － CTGATCTAGAGGTACCGGATCC －3。5ＲACE 的
2轮扩增程序均为:94 ℃预变性 5 min;94 ℃变性 30 s、
55 ℃ 退 火 30 s、 72 ℃ 延 伸 1 min， 共 35
个循环;最后于 72 ℃延 伸 10 min。3ＲACE的扩增
程序为:94 ℃预变性 5 min;94 ℃变性 30 s、50 ℃退火 30
s、72 ℃延伸1 min，共35个循环;最后于72 ℃延伸7 min。
分别对 5ＲACE和 3ＲACE扩增产物进行纯化和回收，将
其连接到 pMD19 －T载体上并转化大肠杆菌 DH5α感受
态细胞;按照上述筛选方法用 Amp 进行筛选，挑取单个
阳性克隆进行测序。
将测序得到的 3ＲACE片段、5ＲACE片段及中间保
守片段进行拼接，得到荷花 γGCS基因的全长序列，并根
据拼接结果设计全长引物 GCS －WF和 GCS －WＲ，引物
序列分别为 5 －ATTCTATCACTCGACACTCA
AAGCC －3和 5 － TCAATATAACAGCTCCTCAAAAATG
GGATCCACGCATTGACCCC － 3。使用上述引物对荷花
γGCS 基因的全长序列进行验证，扩增程序为:94
℃预变性 5 min;94 ℃变性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延
伸 2 min，共35个循环;最后于72 ℃延伸7 min。回
收扩增产物，将其与 pMD19 － T载体连接并转化大肠杆
菌 DH5α感受态细胞;按照上述筛选方法用 Amp进行筛
选，挑取单个阳性克隆进行测序。
1． 2． 3 序列分析 利用 GenBank 内的 OＲF finder 工具
查找序列的开放阅读框(OＲF);采用 BLASTp 软件进行
序列比对分析，选择与荷花 γGCS氨基酸序列同源的其他
植物的 γGCS 氨基酸序列、用 ClustalX 1． 83 软件进行多
重比对，利用MEGA 5． 1软件中的 neighbor － joining (NJ)
法构建系统进化树。利用在线工具 ProtParam(http:∥
web． expasy． org /protparam/)预测荷花 γGCS 基因编码的
蛋白质的理论相对分子质量及理论等电点(pI);采用
TMHMM Sever v． 2． 0(http:∥www． cbs． dtu． dk /services /
TMHMM/)预测该蛋白质的跨膜结构域;采用 wolf PSOＲT
(http:∥wolfpsort． seq． cbrc． jp /)对该蛋白质进行亚细胞
定位预测;采用 SMAＲT(http:∥smart． embl-heidelberg．
de /)分析该蛋白质的保守结构域。
1． 2． 4 荷花 γGCS基因的表达分析 任意选取长势一致
的 3株荷花，分别采集各单株的剑叶(刚萌出、未展开的
叶片)、嫩叶(刚刚展开的叶片)、成熟叶、叶柄(成熟叶的
叶柄)、茎和须根，各称取 0． 1 g，用于 γGCS基因的组织定
量表达分析，每个样品设 3次重复。
3第 4 期 张阿慧，等:荷花 NnγGCS基因的克隆及表达分析
在塑料花盆(上口径 25 cm、高 28 cm)中分别装入
200和 400 μmol·L －1 CdCl2溶液 2 L，植入正常生长的荷
花植株进行胁迫培养，每盆 1株;于胁迫培养 0、1、3、6、12
和 24 h时每处理各选取 3株样株，分别采集每株样株的
嫩叶和须根各 0． 1 g，经液氮速冻后于 －80 ℃保存、备用。
按照 ＲNA快速提取试剂盒说明书上的操作流程分
别提取嫩叶和须根样品的总 ＲNA，取 1 μg 总 ＲNA、按照
cDNA合成试剂盒说明书上的操作流程合成 cDNA第 1
链;将获得的 cDNA稀释30倍，采用设计的定量引物GCS
－ＲTF和 GCS －ＲTＲ进行扩增反应，引物序列分别为 5
－ GCTTATTTCCCAGCCAAGTC － 3 和 5 －
TCTCGGCACTCCATAACAAG － 3，反应体系总体积 20
μL。参考张计育等［15］的方法和条件进行实时荧光定量
PCＲ反应，并用7300 Ｒeal Time PCＲ System软件和2 －ΔΔCt
法［16］进行分析。
1． 2． 5 荷花 γGCS 基因表达载体的构建和亚细胞定位
以正确提取的质粒 DNA为模板，采用含酶切位点的引
物 GCS － SalⅠ和 GCS － NotⅠ(引物序列分别为 5 －
CGCGTCGACATGATGGCGCTTATTTCCCAGCCAAG
TCC －3和 5 －AAAGCGGCCGCGATCAATATAACAGCT
CCTCAAAAATGGGAT －3)扩增荷花 γGCS基因的 OＲF;
回收扩增产物，分别用限制性内切酶 SalⅠ和 NotⅠ对扩增出
的目的片段进行双酶切，并利用 T4 DNA连接酶将其连接
到 pENTＲ1A载体中;转化大肠杆菌 DH5α 感受态细胞，
按照上述筛选方法用 Amp进行筛选，挑取单个阳性克隆
进行测序。提取测序正确的阳性克隆菌液中的质粒
DNA，使用 PvuⅠ进行单酶切后得到线性化产物;利用 LＲ
重组酶与 pMDC43 载体进行重组，转化大肠杆菌 DH5α
感受态细胞，并按照上述筛选方法用 Amp 进行筛选;挑
取单个阳性克隆，采用 pMDC43载体引物 pMDC43 － Test
－ F 和 pMDC43 － Test － Ｒ(引物序列分别为 5 －
CGTCGTCCTTG
AAGAAGATGG －3和 5 － TGAATTAGATGGTGATGTTA
ATGGG －3)以及 γGCS 基因特异引物 GCS － T － F 和
GCS －T －Ｒ(引物序列分别为 5 －CCCTCTGGAGACCCT
CAYCAＲACNTG －3 和 5 －GAAGATGGTGGTCAGGTG
GTTYTCCCAＲTC －3)进行 PCＲ检测，经测序验证载体构
建的正确性。
构建的 pMDC43 －γGCS表达载体含2个35S启动子
和 GFP荧光信号(见图 1)，利用基因枪轰击法［17］将该表
达载体转化到在MS高渗培养基上培养 16 h的洋葱表皮
细胞中，获得高效瞬时表达，暗培养 16 h后在激光共聚焦
显微镜下观察细胞的荧光。
图 1 荷花 γGCS基因表达载体的结构图
Fig． 1 Structure chart of expression vector of γGCS gene from Nelumbo nucifera Gaertn．
2 结果和分析
2． 1 荷花 γGCS基因全长序列分析
利用简并引物扩增获得荷花 γGCS 基因的保守中
间片段，长度为 619 bp;其 3ＲACE 和 5ＲACE 片段长
度分别为 596 和 668 bp。将中间片段、3ＲACE 和
5ＲACE 片段进行拼接，得到总长度为 1 801 bp 的片
段，即为荷花 γGCS 基因的全长 cDNA 序列。序列分
析结果(图 2)表明:该序列包含 194 bp 的 3非编码
区、38 bp的 5非编码区以及 1 569 bp 的开放阅读框
(OＲF) ，共编码 522 个氨基酸残基。预测结果显示:
荷花 γGCS基因编码的蛋白质的理论相对分子质量为
59 159． 0;理论等电点为 pI 6． 27，稳定指数为 39． 60，
表明该蛋白质较稳定。跨膜结构域和亚细胞定位的
预测结果显示:荷花 γGCS蛋白质无跨膜结构域，且该
蛋白质位于细胞质和叶绿体中。通过保守结构域分
析可知，荷花 γGCS蛋白质具有 1 个保守的 GCS2 结构
域，属于谷氨酰半胱氨酸连接酶家族。
多重比对结果显示(图 3) :根据获得的基因序列
推导 出 的 氨 基 酸 序 列 与 百 脉 根、洋 葱、龙 眼
(Dimocarpus longan Lour．)、巴 西 橡 胶 树〔Hevea
brasiliensis (Willd． ex A． Juss．)Müll． Arg．〕、黄瓜和拟
南芥的 γGCS氨基酸序列的一致性分别为 87%、85%、
4 植 物 资 源 与 环 境 学 报 第 24 卷
* :终止密码子 Stop codon．
图 2 荷花 γGCS基因的 cDNA序列及其编码的氨基酸序列
Fig． 2 cDNA sequence of γGCS gene from Nelumbo nucifera Gaertn． and amino acid sequence encoded by the γGCS gene
5第 4 期 张阿慧，等:荷花 NnγGCS基因的克隆及表达分析
AC:洋葱 Allium cepa Linn．;AT:拟南芥 Arabidopsis thaliana (Linn．)Heynh．;BJ:芥菜 Brassica juncea (Linn．)Czern．;CS:黄瓜 Cucumis sativus
Linn．;LC:百脉根 Lotus corniculatus Linn．;NN:荷花 Nelumbo nucifera Gaertn．;HB:巴西橡胶树 Hevea brasiliensis (Willd． ex A． Juss．)Müll． Arg．
图 3 荷花与其他 6 种植物的 γGCS基因编码的氨基酸序列的比对分析
Fig． 3 Comparison analysis on amino acid sequences encoded by γGCS gene from Nelumbo nucifera Gaertn． and other six species
81%、80%、78%和 76%。据此确定获得的序列为荷
花 γGCS基因，命名为 NnγGCS。
2． 2 基于 γGCS 氨基酸序列的荷花与其他植物的系
统进化分析
基于 GenBank中龙眼、百脉根和玉米等 15 种植
物的 γGCS氨基酸序列及本研究预测的荷花 NnγGCS
氨基酸序列构建系统进化树(图 4)。这些植物的
γGCS氨基酸序列在进化过程中比较保守，主要分为
双子叶植物和单子叶植物 2 个大类，其中，荷花与龙
眼和百脉根等 10 个种类聚为一组，均为双子叶植物，
6 植 物 资 源 与 环 境 学 报 第 24 卷
图中数据为置信度 Datums in the figure are confidence． LC:百脉根 Lotus
corniculatus Linn．;PV:菜豆 Phaseolus vulgaris Linn．;PS:豌豆 Pisum
sativum Linn．;CB:高山离子芥 Chorispora bungeana Fisch． et C． A．
Mey．;AT:拟南芥 Arabidopsis thaliana (Linn．) Heynh．;DL:龙眼
Dimocarpus longan Lour．;PC:豆梨 Pyrus calleryana Dec．;CS:黄瓜
Cucumis sativus Linn．;HB:巴西橡胶树 Hevea brasiliensis (Willd． ex A．
Juss．)Müll． Arg．;ZE:百日菊 Zinnia elegans Jacq．;NN:荷花 Nelumbo
nucifera Gaertn．;AC:洋葱 Allium cepa Linn．;TA:小麦 Triticum aestivum
Linn．;OS:粳稻 Oryza sativa subsp． japonica Kato;ZM:玉米 Zea mays
Linn．;PA:芦苇 Phragmites australis (Cav．)Trin． ex Steud．
图 4 基于 γGCS氨基酸序列构建的荷花与其他植物的 NJ系统树
Fig． 4 NJ phylogenetic tree of Nelumbo nucifera Gaertn． and other
species based on γGCS amino acid sequence
与水稻和玉米等 5 种单子叶植物的亲缘关系较远。
2． 3 荷花 NnγGCS基因的表达分析
以荷花的 NnActin 基因为内参，利用实时荧光定
量 PCＲ技术分析荷花 NnγGCS 基因在不同组织中的
表达状况，结果见图 5。分析结果显示:荷花的
NnγGCS基因在其须根、茎和叶片中均能够表达，但表
达量差异明显，该基因在各组织中的相对表达量从高
到低依次排序为嫩叶、叶柄、成熟叶、须根、剑叶、茎。
不同浓度镉胁迫条件下荷花嫩叶和须根中 NnγGCS
基因的表达特征见图 6。由图 6 －A可见:在
ML:成熟叶 Mature leaf;St:茎 Stem;FL:剑叶 Flag leaf;TL:嫩叶
Tender leaf;Pe:叶柄 Petiole;FＲ:须根 Fibrous root．
图 5 荷花不同器官中 NnγGCS基因的相对表达量
Fig． 5 Ｒelative expression of NnγGCS gene in different organs of
Nelumbo nucifera Gaertn．
□:200 μmol·L －1 Cd;■:400 μmol·L －1 Cd．
图 6 不同浓度镉胁迫条件下荷花嫩叶(A)和须根(B)中 NnγGCS基因相对表达量的变化
Fig． 6 Change in relative expression of NnγGCS gene in tender leaf and fibrous root of Nelumbo nucifera Gaertn． under
cadmium stress with different concentrations
200 μmol·L －1 Cd 胁迫条件下，嫩叶中 NnγGCS 基因
的相对表达量在胁迫 1 h 时略升高，胁迫 3 h 时明显
下降，胁迫 6、12 和 24 h逐渐升高，胁迫 24 h时较初始
水平(胁迫 0 h)明显升高;在 400 μmol·L －1 Cd 胁迫
条件下，嫩叶中 NnγGCS 基因的相对表达量在胁迫 1
和 3 h 时持续下降，胁迫 6 和 12 h 时逐渐升高，胁迫
24 h时又略有下降且低于初始水平。
由图 6 － B可见:不同浓度镉胁迫条件下 NnγGCS
7第 4 期 张阿慧，等:荷花 NnγGCS基因的克隆及表达分析
基因在须根中相对表达量的变化与嫩叶中存在较大
差异。在 200 μmol· L －1 Cd 胁迫条件下，须根中
NnγGCS基因的相对表达量在胁迫 1 h时显著升高，随
后下降至初始水平，之后保持在稳定状态，变化幅度
较小;而在 400 μmol· L －1 Cd 胁迫条件下，须根中
NnγGCS基因的相对表达量在胁迫 1、3 和 6 h 时均略
低于初始水平，在胁迫 12 h 时显著升高，胁迫 24 h 时
虽有一定下降但仍高于初始水平。
2． 4 荷花 NnγGCS基因的表达定位分析
采用洋葱表皮细胞对荷花 NnγGCS基因表达进行
亚细胞定位，结果(图 7)显示:该基因表达的蛋白质荧
光仅出现在细胞质中，并呈分散状态，而液泡和质膜
中没有荧光，与该蛋白质跨膜结构域的预测结果部分
一致。虽然该基因在细胞质和叶绿体中均能表达［18］，
但由于本研究所用材料为洋葱表皮，无法观察到叶绿
体，因而仅在细胞质中观察到该基因的表达。
A，B，C． pMDC43 载体 pMDC43 vector:A． 可见光 Visible light;B． GFP;C． 叠加 Merged．
D，E，F． pMDC43 － γGCS载体 pMDC43-γGCS vector:D． 可见光 Visible light;E． GFP;F． 叠加 Merged．
图 7 洋葱表皮细胞中荷花 NnγGCS基因表达的亚细胞定位
Fig． 7 Subcellular localization of expression of NnγGCS gene from Nelumbo nucifera Gaertn． in epidermal cells of Allium cepa Linn．
3 讨 论
序列分析结果显示:荷花 NnγGCS 蛋白与其他植
物的 γGCS 蛋白具有相同的 GCS2 结构域，为谷胱甘
肽合成过程中的限速酶。比对结果显示:荷花
NnγGCS蛋白的氨基酸序列与百脉根 γGCS 蛋白的氨
基酸序列一致性最高(87%) ，与拟南芥 γGCS 蛋白的
氨基酸序列一致性最低(76%)。在进化关系上，荷花
γGCS 基因属于双子叶植物类，与龙眼和百脉根等双
子叶植物的亲缘关系较近，与水稻等单子叶植物的亲
缘关系较远，表明该基因在进化过程中具有保守性。
在进化过程中，γGCS基因的 C 端氨基酸比较保守，而
N端则约有 100 个氨基酸残基存在较大差异。不同植
物 γGCS基因的 OＲF 编码的氨基酸残基数变化较大
(百脉根为 435 个、小麦为 374 个、荷花为 522 个) ，这
种差异不仅体现了不同物种间的差异性，也体现了相
同基因的多态性。
GSH广泛存在于植物体中，参与调节植物的多种
抗性机制［19］。γGCS 蛋白为 GSH 合成过程中的限速
酶，直接影响 GSH 的生物合成量。表达分析结果显
示:NnγGCS基因在荷花的各个组织器官中均能够表
达，说明该基因在荷花中没有组织特异性，能够在荷
花各组织器官的生长发育过程中发挥作用。这一研
究结果与巴西橡胶树的相关研究结果一致［20］。
荷花 NnγGCS基因的表达量对重金属镉胁迫有一
定的响应，大体表现为随胁迫时间延长 NnγGCS 基因
的相对表达量先下降后升高，与镉胁迫下番茄中
8 植 物 资 源 与 环 境 学 报 第 24 卷
γGCS 酶活性的变化趋势一致［11］，推测这可能是由于
γGCS酶能够催化合成 GSH，继而合成 PC来抵御重金
属对植物的伤害，说明镉胁迫条件下 PC 合成受镉胁
迫诱导［21 － 22］。然而，在不同浓度镉胁迫条件下，荷花
须根中 NnγGCS 基因的表达模式不同，高浓度(400
μmol·L －1Cd)镉胁迫条件下该基因的响应时间反而
延迟，其响应机制有待深入研究。
利用基因枪轰击法将 NnγGCS基因表达的蛋白质
定位于细胞质中，说明该蛋白质在细胞质中发挥相应
的生理功能，与该蛋白质跨膜结构域的预测结果一
致。其作用过程可能是该蛋白质在细胞质中催化合
成 GSH，进而合成 PC，PC与重金属结合后被运至液泡
内，从而降低重金属对细胞的伤害［23］。虽然 Hell
等［24］证实 γGCS 基因表达的蛋白质还存在于叶绿体
内，但是由于本研究所用材料为洋葱表皮，无法观察
到该基因在叶绿体中的表达情况，因而，还需采用合
适的材料对此进行进一步的实验验证。
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(责任编辑:佟金凤)
9第 4 期 张阿慧，等:荷花 NnγGCS基因的克隆及表达分析