全 文 ：南京农业大学学报 2011，34(6) :53 － 58
Journal of Nanjing Agricultural University http:
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/ /nauxb． njau． edu． cn
收稿日期:2011 － 06 － 09
基金项目:国家公益性行业(农业)科研专项(200903020)
作者简介:孙祖霞，硕士研究生。* 通讯作者，刘兆磊，副教授，硕导，主要从事观赏植物种质资源与生物技术研究，E-mail:lzl@ njau． edu． cn。
孙祖霞，刘兆磊，陈素梅，等．荷花 SRAP-PCR反应体系的优化与确立［J］．南京农业大学学报，2011，34(6) :53 － 58
荷花 SRAP-PCR反应体系的优化与确立
孙祖霞1，刘兆磊1* ，陈素梅1，陈发棣1，楼望淮1，郭海林1，2
(1．南京农业大学园艺学院，江苏 南京 210095;2．江苏省中国科学院植物研究所，江苏 南京 210014)
摘要:以荷花(Nelumbo nucifera Gaertn)品种‘新红’叶片为材料，采用 L16(4
5)正交试验设计，对 SRAP-PCR 反应体系中的
Mg2 +、dNTPs、TaqDNA聚合酶、引物和模板 DNA用量 5 因素进行了优化，并确立了适用于荷花 SRAP-PCR的最佳反应体系。
结果表明:荷花的 SRAP-PCR 最佳反应体系为:反应总体积 10 μL，包含 2． 0 mmol·L －1 Mg2 +、300 μmol·L －1 dNTPs、0． 5 U
TaqDNA聚合酶、4 μmol·L －1上下游引物、50 ng DNA 及 10 × PCR Buffer。各因素水平变化对反应体系影响由大到小依次
为:TaqDNA聚合酶、Mg2 +、引物、dNTPs、DNA。用 48 个荷花品种对优化的 SRAP-PCR反应体系进行验证，均获得了条带清
晰、多态性丰富的扩增图谱，证实了该体系的稳定性和适应性。
关键词:荷花;SRAP-PCR;正交试验设计;反应体系优化
中图分类号:S682． 32 文献标志码:A 文章编号:1000 － 2030(2011)06 － 0053 － 06
Optimization and establishment of SRAP-PCR reaction system
for Nelumbo nucifera Gaertn
SUN Zu-xia1，LIU Zhao-lei1* ，CHEN Su-mei1，CHEN Fa-di1，LOU Wang-huai1，GUO Hai-lin1，2
(1． College of Horticulture，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China;2． Institute of Botany，
Jiangsu Province and Chinese Academy of Sciences，Nanjing 210014，China)
Abstract:Using Nelumbo nucifera Gaertn‘Xinhong’ leaves as the experimental material，by the orthogonal experiment design
L16(4
5) ，five factors including concentration for Mg2 + and dNTPs，dosage for TaqDNA polymerase，primer and template DNA in
SRAP-PCR reaction system were optimized，and the optimization SRAP-PCR reaction system suitable for lotus were also established．
The result showed that the optimal SRAP-PCR reaction system was as follows:total volume 10 μL，including 2． 0 mmol·L －1 Mg2 +，
300 μmol·L －1 dNTPs，0． 5 U TaqDNA polymerase，4 μmol·L －1 primer，50 ng DNA and 10 × PCR Buffer． The order of each factor in
different levels affecting the result of PCR was:TaqDNA polymerase，Mg2 +，primer，dNTPs，DNA． The optimal SRAP-PCR reaction
system was identified by means of genomic DNA from 48 varieties of N． nucifera Gaertn and the amplification pattern with clear band
and rich polymorphism was obtained． It is concluded that the SRAP-PCR reaction system is steady and reliable．
Key words:Nelumbo nucifera Gaertn;SRAP-PCR;orthogonal experiment design;optimization of reaction system
荷花(Nelumbo nucifera Gaertn)是睡莲科(Nelumbonaceae)莲属(Nelumbo)多年生大型挺水植物，目前
有中国莲种系、中国莲亚种莲种系和中美杂种莲种系 3 个种系［1］。荷花的观赏价值很高，且盛开于 7 至 8
月，正值酷暑高温的少花季节，深受各国人民喜爱，成为原产我国的十大传统名花之一，在园林实践中广泛
应用。但荷花的基础研究相对薄弱，分子标记技术在荷花上的应用也相对滞后，目前已经报道应用的分子
标记技术主要有 ISSR、SSR和 RAPD等［2 － 4］。
序列相关扩增多态性(sequence-related amplified polymorphism，SRAP)是 Li 等［5］于 2001 年在芸薹属
植物上开发的基于 PCR反应的新型分子标记技术，具有多态性高、重复性好、在基因组中分布均匀、引物
通用性强等优点。适合于植物的遗传多样性研究［6 － 7］、指纹图谱的构建［8］、比较基因组学［9］、遗传连锁图
谱的构建［10］和重要性状的 QTL定位分析［11］等研究领域。迄今为止，在荷花上利用 SRAP 技术仅在遗传
多样性方面有所研究［12］。笔者在使用 SRAP 技术对荷花进行多样性分析时，发现条带的清晰度差、易发
生弥散，而且稳定性较差。因此，需要先确定其最佳反应体系。
正交试验能够综合各因素及其交互作用快速找到影响因素的最佳水平组合，不仅效率高，而且结果稳
定可靠，已被广泛应用到紫椴［13］、菊花［6］和番茄［14］的优化体系研究中，并确立了较为可靠的反应体系。
南 京 农 业 大 学 学 报 第 34 卷
本研究以荷花品种‘新红’为研究试材，采用正交试验设计，对影响荷花 SRAP-PCR 反应体系的 Mg2 +
浓度、dNTPs浓度、TaqDNA聚合酶用量、引物浓度和模板 DNA 用量 5 个因素进行优化试验，并且利用 48
个荷花品种对所优化的体系进行验证，建立适用于荷花的 SRAP-PCR反应体系，为进一步利用 SRAP标记
技术开展荷花品种鉴定、种质资源遗传多样性研究和遗传连锁图谱构建等研究工作提供一定的技术支持。
1 材料与方法
1． 1 材料
在南京艺莲苑采集 48 个荷花品种的嫩叶(表 1) ，液氮速冻后置于 － 70 ℃冰箱保存备用。
表 1 供试材料
Table 1 List of materials
编号
No．
材料
Material
种质来源
Germplasm sources
编号
No．
材料
Material
种质来源
Germplasm sources
1 新红 Xinhong A 25 卓越 Zhuoyue A
2 艾江南 Aijiangnan A 26 上海 1 号 Shanghai 1 G
3 思念 Sinian A 27 秦淮人家 Qinhuairenjia A
4 彩云 Caiyun B 28 逸仙莲 Yixianlian A
5 金陵畅想 Jinlingchangxiang A 29 精彩 Jingcai A
6 玉楼人醉 Yulourenzui C 30 白鹤 Baihe A
7 新统帅 Xintongshuai A 31 溢彩 Yicai A
8 窅娘玉脚 Yaoniangyujiao A 32 墨荷 Mohe H
9 红台莲 Hongtailian C 33 贵妃醉酒 Guifeizuijiu A
10 巨子 Juzi A 34 玄武红莲 Xuanwuhonglian H
11 小锦边 Xiaojinbian A 35 贵妃出浴 Guifeichuyu A
12 风暴 Fengbao A 36 芸雅 Yunya A
13 金凤凰 Jinfenghuang A 37 欢庆 Huanqing A
14 东方红 Dongfanghong A 38 绍兴红莲 Shaoxinghonglian H
15 小洒锦 Xiaosajin D 39 金合欢 Jinhehuan A
16 黄羚羊 Yellow Antelope A 40 桃园春色 Taoyuanchunse A
17 普者黑白荷 Puzheheibaihe D 41 红金雀 Hongjinque A
18 深情 Shenqing A 42 金陵火都 Jinlinghuodu A
19 卡洛琳公主 Kaluolingongzhu A 43 红蜻蜓 Hongqingting A
20 红飞天 Hongfeitian A 44 黄牡丹 Huangmudan A
21 宝石花 Baoshihua E 45 香雪海 Xiangxuehai A
22 雪翠莲 Xuecuilian F 46 金色年华 Jinsenianhua A
23 绿之星 Lüzhixing A 47 火花 Huohua C
24 金碧辉煌 Jinbihuihuang A 48 观音莲 Guanyinlian A
注:A:南京艺莲苑 Nanjing Yileen Garden Co．，Ltd;B:重庆大足雅美佳水生花卉公司 Chongqing Dazu Yameijia Aquatic Plants Company;C:
武汉东湖风景区 East Lack Scenic Area of Wuhan;D:云南省普者黑旅游区 Puzhehei Tourism Area in Yunnan Province;E:中国荷花研究
中心 Chinese Lotus Reaserch Center;F:河北白洋淀荷花大观园 Baiyangdian Lotus Daguanyuan in Hebei Province;G:上海植物园 Shang-
hai Botanical Garden;H:杭州 Hangzhou
1． 2 主要试剂和仪器
试验所用的 Mg2 +、dNTPs 和 TaqDNA 聚合酶均购自上海申能博彩生物有限公司，100 bp DNA marker
购自基天生物技术公司，SRAP引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物名称和序列见表 2。
表 2 用于荷花基因组 DNA的 SRAP-PCR反应的引物序列
Table 2 The primer sequences used for SRAP-PCR of genomic DNA form Nelumbo nucifera Gaertn
引物
Primer
5→3序列
5→3sequence
引物
Primer
5→3序列
5→3sequence
正向
Forward
Me20
Me13
Me19
TGAGTCCAAACCGGTCC
TGAGTCCAAACCGGTGT
TGAGTCCAAACCGGTAA
反向
Reverse
Em2
Em4
Em9
GACTGCGTACGAATTAAC
GACTGCGTACGAATTTGA
GACTGCGTACGAATTGAC
试验中使用的主要仪器有 PTC － 100TM型 PCR仪(MJResearch 公司)、Eppendorf 5810 R 型高速冷冻
离心机(Eppendorf公司)、JY － SCZ7 型电泳仪(北京君意东方电泳设备有限公司)和 JS － 380 型凝胶成像
分析仪(上海培清科技有限公司)。
1． 3 方法
1． 3． 1 基因组 DNA 的提取与检测 采用改良的 CTAB 法［15］，取未展开的嫩叶提取基因组 DNA。将
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第 6 期 孙祖霞，等:荷花 SRAP-PCR反应体系的优化与确立
DNA用 1． 2%琼脂糖凝胶电泳，检测 DNA的纯度。用核酸仪检测 DNA的浓度，并用双蒸水稀释至 50 ng·
μL －1，－ 20 ℃保存备用。
1． 3． 2 SRAP-PCR 反应体系的正交试验设计 以‘新红’为材料，采用 L16(4
5)正交表［16］对 Mg2 + 和
dNTPs浓度、TaqDNA聚合酶、引物和 DNA用量进行 5 因素 4 水平正交试验(表 3)。选用 SRAP引物组合
Me20 － Em2 试验，重复 3 次。Mg2 +浓度分别为:1． 0、1． 5、2． 0、2． 5 mmol·L －1;dNTPs 浓度分别为:100、
200、300、400 μmol·L －1;TaqDNA聚合酶用量分别为:0． 5、1． 0、1． 5、2． 0 U;上下游引物用量分别为:2、4、6、
8 μmol·L －1;DNA用量分别为:25、50、75、100 ng。反应总体积为 10 μL，含有 10 × PCR Buffer，总体积不足
的用双蒸水补足。
表 3 SRAP-PCR正交试验设计表
Table 3 Orthogonal design for SRAP-PCR
编号
No．
因素和水平 Factor and level
MgCl2 /(mmol·L －1) dNTPs /(μmol·L －1) TaqDNA /U 引物 /(μmol·L －1)Primer DNA /ng
1 1． 0 100 0． 5 2 25
2 1． 0 200 1． 0 4 50
3 1． 0 300 1． 5 6 75
4 1． 0 400 2． 0 8 100
5 1． 5 100 1． 0 6 100
6 1． 5 200 0． 5 8 75
7 1． 5 300 2． 0 2 50
8 1． 5 400 1． 5 4 25
9 2． 0 100 1． 5 8 50
10 2． 0 200 2． 0 6 25
11 2． 0 300 0． 5 4 100
12 2． 0 400 1． 0 2 75
13 2． 5 100 2． 0 4 75
14 2． 5 200 1． 5 2 100
15 2． 5 300 1． 0 8 25
16 2． 5 400 0． 5 6 50
1． 3． 3 SRAP-PCR扩增及检测 扩增程序参照刘月光等［12］的反应程序，反应结束后加入 2 μL上样缓冲
液，以 100 bp DNA ladder为 DNA分子质量标准，采用 8%非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，电泳缓冲液为
0． 5 × TBE，200 V稳压电泳 2 ～ 2． 5 h，至 loading buffer移到凝胶底部时电泳结束。电泳结束后，采用银染
法［17］染色，最后将凝胶置于凝胶成像系统上拍照。
1． 3． 4 荷花最佳 SRAP-PCR 反应体系验证 以 48 份荷花材料的基因组 DNA 为模板，随机选择 2 个
SRAP引物组合 Me13 － Em4 和 ME19 － Em9，按照上述 SRAP-PCR 扩增及检测方法，对优化确定的荷花
SRAP-PCR反应体系进行检测。
1． 4 数据统计分析
采用 Excel 2003 软件对正交试验结果进行统计分析。
2 结果与分析
2． 1 荷花 SRAP-PCR反应体系的确立
2． 1． 1 供试材料基因组 DNA 的检测 部分供试材料的 DNA 琼脂糖电泳检测结果(图 1)显示，DNA 条
带清晰，完整，弥散较少，符合 SRAP对 DNA的要求。
图 1 部分供试材料 DNA的电泳检测图
Fig． 1 Electrophoresis of genomic DNA for some tested samples
1 － 23:供试材料编号，同表 1。The No． of tested samples is the same as in Table 1．
2． 1． 2 正交试验结果分析 根据正交试验表，每个处理重复 3 次，得到的电泳结果(图 2)显示，采用不同
的反应体系，扩增结果存在显著差异。第 1、2、3、4、9、10、13、14 组反应体系的扩增效果较差，条带丰富度
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南 京 农 业 大 学 学 报 第 34 卷
差、不清晰且稳定性差;第 5、11、15 组反应体系的扩增效果较好，但是第 5 组条带丰富度和重复性较差，第
15 组反应体系弥散现象较严重，条带不清晰。综合条带的丰富度、清晰度以及重复性等因素初步选定第
11 组反应体系作为适合的反应体系。
按照重复性、清晰度和条带丰富度等遗传多样性的分析要求评分，最佳组合(谱带最多、亮度最强、无
杂带)记 16 分，最差处理(谱带最少、亮度最弱、有杂带)记 1 分。16 个组合的分数依次为 2、12、4、1、13、
11、5、6、10、9、16、8、7、3、15、14。根据分数求出每个因素水平下的平均值 ki 以及同一因素不同水平间的
平均值的极差 R。结果(表 4)显示，各因素对荷花 SRAP-PCR 反应的影响从大到小依次为:TaqDNA 聚合
酶、Mg2 +、引物、dNTPs 和 DNA;得到的适宜反应水平为:Mg2 +浓度 2． 0 mmol·L －1、dNTP 浓度 300 μmol·
L －1、TaqDNA聚合酶用量 1． 0 U、上下游引物浓度 4 μmol·L －1、DNA用量 50 ng。
图 2 正交试验电泳结果
Fig． 2 Electrophoresis of orthogonal design
M:100 bp分子质量标准 100 bp DNA ladder;1 － 16:反应体系编号，同表 3。The No． of amplification systems is the same as in Table 3．
表 4 正交试验统计分析
Table 4 Statistical analysis of orthogonal design
编号
No．
因素和水平 Factor and level
MgCl2 /(mmol·L －1) dNTP /(μmol·L －1) TaqDNA /U 引物 /(μmol·L －1)Primer DNA /ng
k1 4． 75 8． 00 10． 75 4． 50 8． 00
k2 8． 75 8． 75 12． 00 10． 25 10． 25
k3 10． 75 10． 00 5． 75 10． 00 7． 50
k4 9． 75 7． 25 5． 50 9． 25 8． 25
R 6． 00 2． 75 6． 50 5． 75 2． 75
注:k:各因素水平下的平均值 The average value of each factor level;R:各因素的极差 The range of each factor
2． 1． 3 荷花 SRAP-PCR 反应体系的确定 对表 4 的统计分析结果和图 2 的直观分析结果进行综合分
析，统计分析结果与扩增图谱的第 11 组体系很接近，仅在 TaqDNA聚合酶用量和 DNA用量有差异。虽然
统计分析结果显示，TaqDNA聚合酶在 1． 0 U时 ki 值最高、反应水平最好，但是 0． 5 U 时的 ki 值与前者差
异很小，结合考虑试验成本将 TaqDNA聚合酶用量确定为 0． 5 U;DNA 的用量在 50 ng 时，ki 最大，所以将
DNA用量确定为 50 ng。
最终确定荷花 SRAP-PCR最佳反应体系为:反应总体积 10 μL，Mg2 + 2． 0 mmol·L －1、dNTPs 300 μmol·
L －1、TaqDNA聚合酶 0． 5 U、上下游引物分别为 4 μmol·L －1、DNA 50 ng和 10 × PCR Buffer。
2． 2 荷花最佳 SRAP-PCR反应体系的验证
应用上述筛选出的荷花最佳反应体系，选择 2 个引物组合 Me13 － Em4 和 Me19 － Em9 对 48 个荷花品
种进行 PCR扩增。结果(图 3)显示，引物组合Me13 － Em4 共扩增出 14 条条带，其中多态性条带 12 条，多
态性比率(PPB)为 85． 71%;引物组合 Me19 － Em9 共扩增出 15 条，多态性条带为 14 条，多态性比率为
93. 33%。随机选取的这 2 个引物组合能应用筛选出的最佳体系扩增出丰富的条带，多态性比率很高，并
且从图中可以看出图谱的条带清晰、稳定性好，证明该最佳体系可以应用到荷花基因组 DNA 的 SRAP-
PCR反应中。
3 讨论
优化 PCR反应体系主要有两种方法:单因素试验和正交试验。传统的单因素试验不能兼顾到各因素
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图 3 引物Me13 － Em4(A)和Me19 － Em9(B)对 48 个荷花品种的 SRAP-PCR扩增图谱
Fig． 3 SRAP-PCR amplification pattern from forty-eight cultivars of N． nucifera Gaertn
using primer combination Me13-Em4(A)and Me19-Em9(B)
M:100 bp分子质量标准 100 bp DNA ladder;1 － 48:编号同表 1。Forty-eight individuals of N． nucifera Gaertn is the same as in Table 1．
间的交互作用，且多数单因素试验仅对扩增结果作直观分析，并未进行统计分析，无从考察各组分不同水
平对扩增结果影响的差异显著性［18］;正交试验较传统的单因素试验节省了时间，用较少的试验次数就可
以获得可靠的试验结果。本研究通过正交试验对影响 SRAP-PCR 的 5 因素 4 水平进行优化和筛选，综合
了统计分析和直观分析结果对反应体系进行调整，避免了由于主观打分而造成试验误差，最终确定了荷花
SRAP-PCR最佳反应体系:反应总体积为 10 μL，2． 0 mmol·L －1 Mg2 +、300 μmol·L －1 dNTPs、0． 5 U TaqDNA
聚合酶、4 μmol·L －1的上下游引物、50 ng模板 DNA及 10 × PCR Buffer。
不同物种的 SRAP-PCR反应体系既有相似的影响因素也有各自特殊的反应条件［6］，体系中的每个因
素间都会相互作用，一种因素发生变化都可能影响扩增的结果。本试验结果显示各因素对荷花反应体系
的影响大小依次为:TaqDNA 聚合酶、Mg2 +、引物、dNTP 和模板 DNA。TaqDNA 聚合酶的变化对荷花
SRAP-PCR的影响最大，这与邵清松等［18］所优化的药用菊花 SRAP-PCR 反应体系中得到的结论相似，但
也与有些学者的研究不同［19］。本研究结果显示，Mg2 +浓度对荷花反应体系有重要的作用，但 dNTPs 和
DNA对反应体系的影响不大。李梅等［20］和权俊萍等［21］也得到了相似的研究结果，但是与张飞等［6］的研
究结果相反，这可能是与每个反应因素对物种的影响程度不同有关。因此，对于 SRAP-PCR反应体系必须
针对不同的物种、仪器设备和试剂的差异而对主要的影响因素进行优化，从而保证结果的稳定可靠。
随着近年来分子生物学的不断发展，分子标记技术已被广泛应用于荷花遗传多样性的研究中。Kubo
等［3］应用 SSR技术对 16 个荷花品种进行多样性分析，11 对引物共扩增出 43 条条带，其中多态性条带为
22 条，多态性比率为 51． 00%。Han等［4］利用 ISSR和 RAPD技术对 38 份荷花材料进行多样性分析，13 条
ISSR引物扩增出 164 条条带，多态性条带有 126 条，多态性比率为 76． 83%;19 个 RAPD 引物共扩增出
212 条条带，其中 181 条为多态性，多态性比率为 85． 38%。在本试验中，利用 SRAP 技术，仅随机选用 2
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南 京 农 业 大 学 学 报 第 34 卷
对引物对 48 个荷花品种进行分析，就获得 29 条条带，多态性条带占 26 条，多态性比率高达 89． 66%。从
以上研究可以看出，SRAP技术条带丰富度、多态性和检测效率远远高于 SSR、ISSR和 RAPD技术，并且通
过对最佳反应体系的验证可以看出，SRAP 在应用到荷花遗传多样性分析时能保证稳定性和重复性。而
且 SRAP技术不需要预知基因组序列信息就可以设计引物，引物在不同物种间具有通用性，可以节省开发
引物的费用。因此 SRAP较 SSR、ISSR和 SRAP更适用于荷花种质资源的遗传多样性研究，也为进一步对
荷花进行资源鉴定、遗传连锁图谱的构建和基因定位等方面的研究提供更加经济、快捷的技术支持。
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责任编辑:范雪梅
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