全 文 ：欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁
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引文格式:杨丹，余德立，余资江．复方五花血藤对鼠视网膜缺血再灌注损伤的保护作用［J］．眼科新进展，
2014，34(8) :713-717． doi:10． 13389 / j． cnki． rao． 2014． 0195 【实验研究】
复方五花血藤对鼠视网膜缺血再灌注损伤的保护
作用△
杨丹 余德立
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余资江
作者简介:杨丹，女，1985 年 11 月出
生，满族，辽宁台安人，硕士。联系
电 话:18798000353;E-mail:yang-
dan619@ 126． com
About YANG Dan:Female，born in
November，1985． Master degree． Tel:
18798000353;E-mail:yangdan619 @
126． com
收稿日期:2014-01-19
修回日期:2014-03-07
本文编辑:盛丽娜
△基金项目:贵州省中医药管理局
科研项目(编号:2009-97)
作者单位:550004 贵州省贵阳市，
贵阳医学院人体解剖学教研室(杨
丹，余资江) ;550001 贵州省贵阳
市，贵阳中医学院临床二系眼科(余
德立)
通讯作者:余资江，E-mail:yzj0112@
126． com
Ｒeceived date:Jan 19，2014
Accepted date:Mar 7，2014
Foundation item:Scientific Ｒesearch
Project of Guizhou Province Adminis-
tration of Traditional Chinese Medicine
(No:2009-97)
From the Department of Anatomy，
Guiyang Medical University (YANG
Dan，YU Zi-Jiang) ，Guiyang 550004，
Guizhou Province，China;The Second
Department of Clinical Medicine，Tra-
ditional Chinese Medical of Guiyang
(YU De-Li ) ，Guiyang 550001，
Guizhou Province，China
Ｒesponsible author:YU Zi-Jiang，E-
mail:yzj0112@ 126． com
Protective effects of compound stem of Sar-
gentgloryvine on retinal ischemia reperfu-
sion injury in rats
YANG Dan，YU De-Li，YU Zi-Jiang
【Key words】 compound stem of Sargentgloryvine;retinal ischemia reperfusion injury;survivin;
rat
【Abstract】 Objective To explore the protective effects of compound stem of Sargentgloryvine
on retinal ischemia reperfusion injury in rats． Methods N inety healthy and clean SD rats were
randomly divided into 3 groups:normal control group，model group and treatment group (lava-
ging the rats w ith a certain range of stem of sargentgloryvine，herb of tuberculate speranskia，spi-
nyleaf pricklyash root and so on) ，and sub-divided into 6-hour group，12-hour group，24-hour
group，48-hour group and 72-hour group according to different reperfusion period． The morpho-
logic change of each layer of cells in the retina was studied by HE and transmission electron mi-
croscope． The preoperative and postoperative positive expression of apoptotic related factor sur-
vivin was detected by the method in situ hybridization． Ｒesults After increasing intraocular pres-
sure for 6 hours，the histology started to change，manifest as edema of gangliocyte and inner plexi-
form layer，few gangliocyte were vacuolar degeneration，but it recovered gradually w ith the exten-
sion of time，the normal control group showed normal retinal structure，while the treatment group
gradually recovered from ischemic reperfusion，but was less than the same stage of ischemia-reper-
fusion group． After reperfusion for 12 hours，the positive expression of survivin started to increase，
peaked at 24 hours，and then gradually decreased(P ＜ 0． 05)． Compared w ith the model group，
the positive expression of survivin in the treatment group decreased(P ＜ 0． 05)． Conclusion The
preliminary results show that compound stem of Sargentgloryvine drug has the obvious protective
effects on retinal ischemia reperfusion injury，which has the positive significance on the develop-
ment and utilization of clinical drug．
［Ｒec Adv Ophthalmol，2014，34(8) :713-717］
【关键词】 复方五花血藤;视网膜缺血再灌注损伤;survivin;大鼠
【摘要】 目的 探讨复方五花血藤对大鼠视网膜缺血再灌注损伤的保护作用。方法 采
用健康成年 SD 大鼠 90 只，随机分为正常对照组、模型组和治疗组，其中模型组和治疗组
建立视网膜缺血再灌注模型，治疗组于造模前连续 3 d给予复方五花血藤灌胃，每天 2 次(总剂量为 10 g·kg －1·d －1) ，模型组
和正常对照组灌服相同剂量的生理盐水。通过 HE染色、透射电镜观察再灌注 6 h、12 h、24 h、48 h与 72 h各组大鼠视网膜的形
态学变化，原位杂交方法检测各组视网膜凋亡相关因子 survivin的表达情况。结果 与正常对照组相比，模型组再灌注后 6 h
视网膜神经节细胞层高度水肿，内丛状层明显增厚，部分视网膜神经节细胞发生空泡变性，但随时间延长病变逐渐减轻。治疗
组各时间点视网膜损伤均较模型组轻。与正常对照组相比，模型组 survivin在再灌注后 6 h即开始增加，24 h达到高峰，以后逐
渐下降，但各时间点均高于正常对照组(均为 P ＜ 0． 05)。与模型组相比，治疗组 survivin各时间点表达均较高(均为 P ＜ 0. 05)。
结论 初步证实复方五花血藤对于大鼠视网膜缺血再灌注损伤有较为明显的保护作用，此研究对于临床药物的开发和利用具
有积极意义。
［眼科新进展，2014，34(8):713-717］
视网膜缺血再灌注损伤(retinal ischemia-reper-
fusion injury，ＲIＲI)是临床上广泛关注的问题。视网
膜组织代谢极为旺盛，其内层的血液供应又来自于
终末分支的视网膜血管，因此对于缺血、缺氧极为敏
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感［1-2］。视网膜组织是视觉神经元所在处，一旦发生
缺血、缺氧对视觉的损害极为严重，因此研究其发生
发展机制对防治 ＲIＲI 具有重要意义。ＲIＲI 的机制
包括氧自由基学说、一氧化氮学说、钙通道学说、炎
症反应学说、兴奋性氨基酸学说、基因调控学说、细
胞凋亡学说等［3］。复方五花血藤(主方成分:五花血
藤、透骨草、见血飞)具有清热解毒、活血、祛风、止痛
等功效，药理学研究表明该药具有提高小鼠耐缺氧
能力、扩张小动脉及抑制大鼠肿瘤坏死因子-α、白细
胞介素-6 的异常分泌等作用。本研究拟采用复方五
花血藤灌胃大鼠，探讨其对 ＲIＲI 的保护机制，以期
为临床应用该药治疗视网膜缺血性疾病提供新的治
疗策略。
1 材料与方法
1． 1 实验动物及分组 选取健康成年 SD(Sprague
Dawley)大鼠 90 只(无眼疾) ，体质量 180 ～ 250 g，雌
雄不限，由贵阳医学院实验动物中心提供［合格证
号:SCXK(黔) (2002-0001) ］。随机分成 3 组:正常
对照组、模型组、治疗组，每组 30 只。其中模型组和
治疗组大鼠制作 ＲIＲI 模型;治疗组于造模前连续 3
d 给予复方五花血藤灌胃，每天 2 次(总剂量为
10 g·kg －1·d －1) ;模型组和正常对照组灌服相同剂
量的生理盐水。
1． 2 主要仪器与试剂 LEICA ＲM2016 转轮切片机
(上海莱卡仪器有限公司) ，OLYMPUS BH-2 显微镜
(日本 OLYMPUS公司) ，LKB-V型超薄切片机(第三
军医大学电镜中心) ，荷兰 PHILIPS TECNAI10 透射
电子显微镜(第三军医大学电镜中心) ，精密电子天
平(德国 Sartorius 公司)。复方五花血藤(贵阳中医
学院提供) ，多聚赖氨酸(武汉博士德生物工程有限
公司) ，妥布霉素滴眼液(美国爱尔康公司) ，盐酸丙
美卡因滴眼液(比利时 s． a． Alcon-Couvreur n． v． 公
司) ，survivin原位杂交检测试剂盒(武汉博士德生物
工程有限公司)。
1． 3 复方五花血藤制剂的制备 取五花血藤 20 g、
透骨草 15 g、见血飞 15 g 用纱布包扎，加 500 mL 蒸
馏水煮 2 次，每次 1 h，过滤，合并煎煮液。减压浓缩
后真空干燥，得到复方五花血藤提取物。每次取提
取物适量，用蒸馏水制备成含生药 1 g·mL －1的药
液，无菌密封后置入 4 ℃ 冰箱中保存备用。
1． 4 动物模型的建立 参照文献［4］的方法制作动
物模型。具体方法:大鼠称体质量后以 6 mL·kg －1
给予 50 g·L －1水合氯醛腹腔注射麻醉。麻醉后将
大鼠侧卧位固定于实验台上，选取任一眼球，滴加复
方托吡卡胺滴眼液散瞳，盐酸丙米卡因滴眼液表面
麻醉 5 min后，将一端连有生理盐水注射液的 4 号半
头皮针从大鼠颞侧角膜缘斜刺入眼前房，固定针头
并打开注射器。使输液瓶与眼球垂直距离为 150
cm，眼压升高至 110 mmHg(1 kPa = 7． 5 mmHg) ，这
时可见大鼠瞳孔散大，巩膜变白。持续 60 min，拔出
针头，可见大鼠球结膜及巩膜颜色迅速恢复正常，检
眼镜下视网膜血供恢复，瞳孔回缩，说明造模成功。
术中及术后间断滴加妥布霉素滴眼液防止角膜干燥
及预防感染。
1． 5 光镜标本的制作 各组分别于造模后 6 h、12
h、24 h、48 h和 72 h随机取 5 只鼠，过量麻醉后给予
心脏灌注 40 g·L －1多聚甲醛溶液处死大鼠，立即取
出眼球，经 Bouin液固定 24 h(4 ℃冰箱)。取出标本
后流水冲洗 24 h，之后再由蒸馏水浸泡 3 次，每次 10
min。取出后放于干净滤纸上，用眼科剪去掉角膜
(保留晶状体以保持其形态) ，修剪平整后放入体积
分数 75%酒精中过夜。第 2 天取出按以下步骤进
行:体积分数 80%酒精(2 min) ，体积分数 95%酒精
Ⅰ(10 min) ，体积分数 95%酒精Ⅱ(10 min，去除晶
状体) ，体积分数 100%酒精Ⅰ(10 min) ，体积分数
100%酒精Ⅱ(10 min) ，二甲苯Ⅰ(15 min) ，二甲苯
Ⅱ(5 min) ，65 ℃恒温箱中浸蜡(40 min，2 次) ，然后
行石蜡包埋，包埋好的标本后端以视神经定位，行视
网膜全层连续切片，厚度 5 μm。
1． 6 HE 染色 于 51 ℃水浴箱中摊片、捞片，然后
放入 70 ℃恒温箱中烤片 2 h。HE染色步骤如下:从
恒温箱中取出烤好的切片立即置于二甲苯Ⅰ(5
min)、二甲苯Ⅱ(5 min)、体积分数 100% 酒精(5
min)、体积分数 95%酒精(5 min) ，蒸馏水冲洗擦干，
苏木精染色(7 min) ，蒸馏水冲洗擦干，体积分数
0. 5%盐酸酒精分色(即刻) ，蒸馏水冲洗(5 min) ，取
出擦净，伊红染色(10 min) ，蒸馏水冲洗擦干，再分
别置于体积分数 95%酒精(5 min)、体积分数 100%
酒精(5 min)、二甲苯(5 min) ，取出载玻片自然风干
后中性树脂封片，显微镜观察其形态结构。
1． 7 电镜标本的制作 各组均于造模后 72 h 过量
麻醉剩余大鼠，迅速摘取眼球，在冰浴环境中沿角膜
缘切开，去除角膜及晶状体，冰生理盐水中冲洗干
净，放入体积分数 4% 戊二醛中固定 24 h(4 ℃冰
箱) ，送第三军医大学电镜室行透射电镜观察并
摄片。
1． 8 survivin 原位杂交检测 使用 survivin 原位杂
交检测试剂盒对大鼠视网膜切片进行检测，不加探
针者作为阴性对照，详细步骤见试剂盒说明书。此
试剂盒采用针对 survivin 的寡核苷酸探针，经地高辛
标记。针对大鼠 survivin 靶基因的 mＲNA 序列为:
(1)5’-ACCTTCAAGAACTGGCCCTTCCTGGAGGAT-
TGCTC-3’;(2)5’-TTTCTGCTTTAAGGAACTGGAAG-
GCTGGGAACCGG-3’; (3)5’-ACAAAATTGCAAAG-
GAGACCAACAACAAACAGAAA-3’。
1． 9 统计学处理 各实验数据均以均数 ±标准差
(珋x ± s)表示，采用 SPSS 16． 0 统计软件对所得数据进
行单因素方差分析。两组间比较采用 q 检验，P ＜
0. 05 为差异有统计学意义。
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眼 科新进展 2014年8月 第34卷 第8期
Ｒec Adv Ophthalmol Vol． 34 No． 8 August 2014
2 结果
2． 1 HE 染色结果 光镜下，正常对照组可看到视
网膜各层结构完整，3 层细胞核排列整齐，从外向内
分别为:外核层(outer nuclear layer，ONL)、内核层
(inner nuclear layer，INL)和神经节细胞层(ganglion
cell layer，GCL)。其中视网膜神经节细胞(retinal
ganglion cells，ＲGC)呈单层排列，可见到较大完整胞
体，胞核清晰;INL 细胞数较少，有 2 ～ 4 层;ONL 细
胞数较多，有 3 ～ 6 层。各层细胞排列紧密、整齐，无
组织坏死出现(图 1)。模型组:再灌注 6 h，GCL 高
度水肿，内丛状层(inner plexiform layer，IPL)明显增
厚，结构疏松，细胞排列开始不规则;部分 ＲGC 和神
经纤维层(nerve fiber layer，NFL)细胞发生空泡变
性。再灌注 12 h、24 h、48 h视网膜细胞持续高度水
肿，主要表现在 ＲGC 和 NFL 细胞，但随着时间延长
而逐渐减轻。再灌注 72 h，损伤继续发展，可见到
ＲGC 减少，NFL明显变薄，INL细胞明显减少，部分
结构不清晰(图 2)。治疗组:再灌注 6 h，GCL 和
NFL较模型组细胞水肿减轻，IPL 较模型组变薄;再
灌注 12 h、24 h、48 h 视网膜各层水肿较模型组减
轻，并逐渐消退，细胞排列较模型组整齐;再灌注 72
h，IPL略有变薄，且明显较模型组轻(图 3)。
Figure 1 HE staining of rat retina in normal control group (×200)
正常对照组大鼠视网膜组织 HE染色结果(×200)
Figure 2 HE staining of rat retina at different time after ＲIＲI in model group (× 200)． A:6 hours;B:24 hours;C:48 hours;D:72 hours 模型组
ＲIＲI后不同时间大鼠视网膜组织 HE染色结果(× 200)。A:6 h;B:24 h;C:48 h;D:72 h
Figure 3 HE staining of rat retina at different time after ＲIＲI in treatment group (× 200)． A:6 hours;B:24 hours;C:48 hours;D:72 hours 治疗
组 ＲIＲI后不同时间大鼠视网膜组织 HE染色结果(× 200)。A:6 h;B:24 h;C:48 h;D:72 h
2． 2 透射电镜观察结果 正常对照组:ＲGC 形态规
则，胞膜清晰，胞核内染色质分布均匀，胞浆内线粒
体、内质网、高尔基复合体等细胞器丰富，结构完整;
可见典型 ＲGC 轴突(图 4A)。模型组:ＲGC 高度肿
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胀，胞膜边界不清晰、不完整，细胞核核膜皱褶增多，
核染色质浓缩，聚集于核膜附近，细胞器减少，线粒
体肿胀，呈透明空泡(图 4B)。治疗组:ＲGC 形态大
体正常，核膜、核仁清楚，胞浆内细胞器轻微肿胀，线
粒体数量较模型组增多(图 4C)。
2． 3 survivin mＲNA 的表达结果 survivin mＲNA
的阳性颗粒主要存在于胞浆中，呈黄色或棕黄色不
均匀分布，主要表达于 GCL、IPL 和 INL。与正常对
照组相比，模型组和治疗组 survivin mＲNA 的表达在
ＲIＲI后 6 h即开始增加，24 h达到高峰，以后逐渐降
低，但各时间点均高于正常对照组(均为 P ＜ 0． 05) ;
而治疗组各时间点 survivin表达均较模型组高，差异
均有统计学意义(均为 P ＜ 0． 05;图 5、表 1)。
表 1 各组大鼠视网膜中 survivin mＲNA的表达
Table 1 Expression of survivin mＲNA in rat reti-
nas of each group (珋x ± s，n = 6)
Observation period Control group Model group Treatment Group
6 hours 0． 2 ± 0． 2 7． 5 ± 1． 0* 10． 5 ± 1． 4* #
12 hours 0． 3 ± 0． 2 12． 8 ± 1． 5* 16． 2 ± 1． 7* #
24 hours 0． 3 ± 0． 2 31． 2 ± 1． 2* 34． 8 ± 1． 5* #
48 hours 0． 2 ± 0． 2 16． 2 ± 1． 9* 19． 0 ± 1． 4* #
72 hours 0． 2 ± 0． 2 8． 0 ± 1． 4* 13． 5 ± 3． 8* #
Note:Compared with control group，* P ＜ 0． 05;Compared with model
group，#P ＜ 0． 05
Figure 4 Transmission electron microscopy photograph of rat retina (× 12 000)． A:Normal control group;B:72 hours after ＲIＲI of model group;C:
72 hours after ＲIＲI of treatment group 各组大鼠视网膜组织透射电镜图片(× 12 000)。A:正常对照组;B:ＲIＲI后 72 h模型组;C:ＲIＲI后 72
h治疗组
Figure 5 Expression of survivin mＲNA in rat retinas(× 200)． A:Normal control group;B:24 hours after ＲIＲI of model group;C:24 hours after ＲIＲI
of treatment group;D:48 hours after ＲIＲI of model group;E:48 hours after ＲIＲI of treatment group 各组大鼠视网膜中 survivin mＲNA的表达(×
200)。A:正常对照组;B:ＲIＲI后 24 h模型组;C:ＲIＲI后 24 h治疗组;D:ＲIＲI后 48 h模型组;E:ＲIＲI后 48 h治疗组
3 讨论
ＲIＲI是视网膜在缺血损伤的基础上，恢复血流
灌注后并不缓解视网膜细胞的损伤，反而加剧了细
胞的死亡使损伤更严重的现象。研究表明，眼球的
血液供应来自于视网膜中央血管系统和睫状血管系
统，其中视网膜中央动脉分布于视网膜达锯齿缘，以
营养视网膜内 5 层组织。黄斑部中心凹无血管分
布，而由脉络膜毛细血管网供应营养，故我们不观察
其结构。视网膜中央动脉属于终末动脉，没有侧支
吻合，故在临床上此动脉发生病变的患者会造成相
应区域的视网膜缺血，严重者可导致视力丧失。而
视网膜的急性高眼压(如急性青光眼) ，主要是对视
网膜视神经的直接压迫从而造成供血障碍。
近年来国内外研究进一步说明了细胞凋亡与
ＲIＲI密切相关。细胞凋亡不是被动的过程，而是主
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动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等
的作用［5］。survivin 又称生存素，是凋亡抑制蛋白
(inhibitor of apoptosis，IAP)家族的新成员，也是目前
发现的最强的凋亡抑制因子［6］。survivin 功能复杂，
具有抑制细胞凋亡、促进细胞转分化并且参与细胞
的有丝分裂、血管的生成和肿瘤细胞耐药性的产生
等作用［7-10］。研究表明，survivin 蛋白在心肌缺血再
灌注损伤中对心肌细胞起到了很好的保护作用［11］。
而研究也表明，其能够促进缺血再灌注损伤后器官
内血管的生成［12］。survivin在膀胱癌、甲状腺癌及星
形细胞瘤中也有高表达［13-15］。在本实验中我们可以
观察到 survivin mＲNA的表达在再灌注 6 h即开始增
加，24 h 达到高峰，以后逐渐降低，而治疗组 survivin
mＲNA的表达各时间点都高于模型组。因此我们可
以认为复方五花血藤在一定程度上能够激活 sur-
vivin的表达，从而起到抑制凋亡的作用。
本实验所采用的复方五花血藤是贵州省传统中
药的代表。复方五花血藤的组成是五花血藤、透骨
草和见血飞，其中五花血藤又名大血藤，具有清热解
毒、活血、祛风、止痛等功效。药理学研究表明，该药
具有抗辐射作用，能显著增加小鼠心肌对86铷的摄取
量，明显提高小鼠耐缺氧能力，扩张小动脉，减轻心
肌梗死和改善心肌梗死所致的心肌乳酸代谢紊
乱［16］。用大血藤治疗脑血管功能不良有一定疗效，
并具有抗凝血作用。此外，大血藤还有镇静、抗急性
过敏、抗炎、抗病毒、抗氧化和抗癌等作用。研究表
明大血藤可以抑制 AA大鼠肿瘤坏死因子-α、白细胞
介素-6 的异常分泌，从而阻止 AA 大鼠免疫性炎症
的发展［17］。透骨草为较常用中药，具有祛风、除湿、
舒筋、活血、止痛的功效，常用于风湿痹痛、筋骨挛
缩、寒湿脚气、疮癣肿毒等症［18］。其药理作用有:抗
炎镇痛、抗菌、抗过敏、抗肿瘤等［19-20］。见血飞具有
祛风散寒、活血舒筋、镇痛等功效。研究表明，见血
飞可缩短小鼠出血时间及血浆复钙时间，说明见血
飞具有一定的止血作用［21-22］。近几年研究表明，对
于 ＲIＲI，中医学者主要选择具有活血化瘀、益气活血
等作用的中药来治疗［23］。鉴于复方五花血藤有以
上作用，因此我们尝试性运用该药来探索其对于大
鼠 ＲIＲI的疗效。
经过实验我们可以观察到:光镜下，正常视网膜
结构清晰，排列规则。ＲIＲI 6 h 视网膜即发生组织
学改变，表现在 ＲGC等细胞发生空泡变性，IPL 明显
增厚，结构疏松，且细胞排列开始不规则。随着再灌
注时间的延长，水肿减轻，NFL明显变薄，INL细胞明
显减少，部分结构不清晰。而透射电镜显示其超微
结构的改变主要表现为 ＲGC 的变性。在给予复方
五花血藤治疗后，HE染色和透射电镜均观察到损伤
减轻。因此我们可以初步判断复方五花血藤对于大
鼠 ＲIＲI 有一定的治疗效果，能缓解 ＲIＲI 造成的细
胞水肿等症状，也能激活抗细胞凋亡因子 survivin 而
起到一定的抑制凋亡的作用。其具体作用机制还有
待于进一步探讨。本实验对于贵州传统中药的开发
和利用起到了积极的作用。
参考文献
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·717·眼 科新进展 2014年8月 第34卷 第8期Ｒec Adv Ophthalmol Vol． 34 No． 8 August 2014 http:/ /www ． ykxjz． com