全 文 ：分 析 化 学 1 9 9 5 . 2 5 ( 1 ) : 4 9~ 5 1研究简报
F E NXI H UA XUE (C hin e s eJ
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反相高效液相色谱法测定
深层培养含硒构菌菌丝体中的硒蛋氨酸
章 军 傅庭治 曹幼琴 ’
(南京大学生物科学与技术来 , 南京 21 0 09 3)
摘 要 本文用苯异硫氛酸醋 (PI T C )作柱前衍生化试剂 ,衍生的硒蛋氨酸及其它非硒代氨
荃酸用反相高效液相色谱进行分离分析 . 分析表明 ,加无机硒培养的构菌菌丝体中含一定量
的硒蛋氮酸 ,且这一方法广泛适于生物物质中其它硒代氮基酸的分析 .
关健词 硒蛋氮酸 ,硒构菌 ,反相高效液相色谱 .
1 引 言
硒是人体必需微量元素 ,研究表明 ,硒能降低癌症等病的发病率 ,改善心脏病的状况 ,并给
整个身体的机能状况带来有益的影响 。 因此 ,对硒的测定方法的研究一直是硒研究的热点之
一 ,但对生物样品中有机硒化合物直接测定的报道很少 〔 , , 。 对样品中硒代氨基酸的分析 ,经典
的方法是采用离子交换法 ,使其与其它氨基酸分离 ,用纸色谱法或薄层色谱法检测〔2 , 。 随着色
谱技术的发展 , 人们对分析方法要求更为快速 、灵敏和准确 ,欧阳政等 〔3 ,用气相色谱法 ( G C )测
定了硒酵母中硒蛋氨酸 ,但由于硒蛋氨酸气化困难 , 因而这一方法受到限制 。 本文在国内首次
报道用反相高效液相色谱法成功地测定了含硒构菌菌丝体中硒蛋氨酸 。
2 实 验 部 分
2
.
1 仪器与试剂
美国 W at er s 多功能高效液相色谱仪 ; W a t e r s 4 84 可变波长紫外检测器 ; 81 0 色谱工作台 ;
W a t e r s N o v a
一
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: 。柱 ( 3 拌m , 3 . 9 m m 又 3 0 e m ) , M i l l ip o r e 水解真空工作台 。
标准品 : 硒蛋氨酸 ( s e l e n o m e t h i o 九i n e )和 1 7种氨基酸 ,美国 S ig m a 公司产品 。 实验所用试
剂为光谱纯和分析纯 ,水为超纯水 。
2
.
2 色谱条件
流动相 : 洗脱液 A ,醋酸钠和乙晴混 合液 。 洗脱液 B , 乙晴和甲醇混合液 。 30 。 m 长柱分析
样品的梯度参数见表 1。
2
.
3 样品的处理及衍生化
样品用 4 m ol / L H CI 水解 50 h ( 5 0℃ ) , 水解后同标准品一样 ,干燥 ,千燥后的样品 ,加适量
的衍生液 (苯异硫氛酸醋 : 甲醇 , 三乙胺 : 水 ~ 1 : 7 : 1 : l) 涡旋并在室温下放置 10 m in , 真
空干燥 l h 。
2
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4 定性与定 t
1 9 9 4一 0 1
一
2 0 收稿 . 19 9 4一 0 7一 2 5 接受 ·
50 分 析 化 学 ` 第 32 卷
厂
采用保留时间定性 ,外标法定量 。
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3 结 果 与 讨 论
.3 1 标准硒蛋氨酸衍生物进样分析
结果表明 ,用 30 c m 长的柱 ,标准硒蛋氨酸保留时间 (t r )为 ZI . 25 m in 。
3
.
2 标准硒蛋氨酸加人 17 种标准氨基酸的分离
如图 l 所示 .
图 1 表明 , 采用两种洗脱液 ( A 和 B )作为硒蛋氨酸和其它非硒代氨基酸分离的流动相是
可行的 ,硒蛋氨酸保留时间仍为 21 . 25 m in 。
3
.
3 含硒样品处理后的进样分析
如图 2 所示 。
结果表明 , 出峰情况良好 ,标准品和样品保留时间吻合 。故选用双泵 、梯度洗脱作为含硒样
品中硒蛋氨酸的检测 .
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.
第 23 卷 分 析 化 学
3
.
4 含硒样品中加标准硒蛋氨酸混合分析
样品中添加标准硒蛋氨酸 ,则硒蛋氨酸峰升高 , 但并不形成新峰 , 因此 ,可以判断样品中含
有硒蛋氨酸 。
.另外 ,对不含硒样品进行分析 , 硒蛋氨酸未能检测到 。
3
.
5 保留时间的孟现性
在选定的色谱条件下 ,同一样品多次重复进样 , 出峰时间稳定 ,相对标准偏差为 0 . 5 % 。
3
.
6 不同培养基及硒浓度培养的构菌菌丝体中硒蛋氨酸含 t 的测定
所有样品在同一条件下分析测定 ,结果如表 2 所示 。
T a b l e 2 D e t
e r m i n at lo n r e s u l st o f s e l e n o m e ht io n i en (阳 / g )
S e in e u l t u r e m e d i u m (拼g / m l )
口 O U r C e 一0 5 1 0 1 5 20 2 5N a t u r a l e u l t u er m e d i u m lN a t u r a l e u l t u r e m e d i u m ZS y n t h e t i e e u l t u er m e d iu m.3 7 硒蛋氨酸测得值重现性同一样品多次检测 ,测得值的相对标准偏差小于 5纬 。 另外 ,在回收率实验中 , 回收率变化范围稳定在 98 % ~ 1 02 % 。综上所述 ,采用反相高效液相色谱法对含硒构菌菌丝体中硒蛋氨酸进行测定分析 ,具有准确度高 ,分离时间短 ,有很好的重现性等优点 ,适于大多数生物材料中其它硒代氨基酸的分析 。4 参 考 文 献K il la H M A . R a b e n s t e i n D L . A n a l . C h e m . , 1 9 8 8 , 2 2 84M il la r K R . J . C h阳m a t o g r . , 1 9` 5 , 2 1 : 3 4 43 Z h e n g o u y a n g , Jia n g w u · B勿m ed . hC or ma t o g r . , 1始8 , 2 ( 6 ) : 2 5 8D e t e r m i n a t io n o f S e l e n o m e t h i o n i n e i n M y e e l i a o f
S u b m e r g e d
.
C u l t u r a l S e l e n i u m F l a m m u l i n a V e l u t iP e s b y
R e v e r s e d
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C a o Y o u q i n
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(肠户尸刊 , e n t of iB汉 o君 ica l S c i en c e a 二 d T e hc n o lo舒 , N a n j i n g U n i v e sr i yt , N a 可 i n g 2 1 0 0 9 3 )
A b s t r a e t A r e v e r s e d
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p e r f o r m a n e e l i q u id e h r o m a t o g r a p h y f o r t h e s e p a r a t i o n o f
s e l e n o m e t h i o n i n e a n d a m i n o a e id s w a s d e v e l o P e d
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I n t h e m e t h o d
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i s o t h io e y a n a t e w a s
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.
T h e s e d e r i v a t i v e s w e r e e f f i e i e n t ly s e P a r a t e d o n a C
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T h e a n a l y t i e a l r e s u l t s
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t h a t t h e s e l e n o m e t h i o n i n e e o n t e n t s i n t h e m y e e l i a o f s e l e n i u m 刀a m m u l i n a v e l u t iP e s a s s o e i a t e s
w i t h t h e e o n e e n t r a t io n o f s e ! e n i u m i n t h e m e d i a a s w e l l a s t h e k i n d s o f m e d i a
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, a e e t一r a t e a n d s e n s i t i v e
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( R e e e i v e d 2 0 J
a n u a r y 1 9 9 4 ; a e e e p t e d 2 5 J
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