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荷花 R2R3-MYB 转录因子 NnMYB4 对拟南
芥木质素合成的影响 
李针针，刘兆磊*，陈发棣，蒋甲福，陈素梅
（南京农业大学园艺学院，江苏 南京 210095）
摘要:[目的]研究荷花 R2R3-MYB 转录因子 NnMYB4 的功能，探讨其在木质素合成过程中的作用。[方法]
利用 RT-PCR 技术从荷花品种‘黑龙江红莲’中克隆得到一个 MYB 转录因子基因 cDNA 全长开放阅读框
(ORF)，命名为 NnMYB4。采用实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）法分析 NnMYB4 在荷花不同组织中的表达
情况。构建 pMDC43-NnMYB4 过表达载体转化拟南芥，采用乙酰溴法测定转基因植株的木质素含量，通过
qRT-PCR 技术对木质素合成关键酶基因的表达进行分析。[结果]NnMYB4 基因 ORF 全长 726 bp，编码 24
1 个氨基酸，属于 R2R3-MYB 转录因子 G4 亚组，与拟南芥 AtMYB4 亲缘关系较近。组织定量结果表明，
NnMYB4 基因在荷花根、茎、叶柄、叶中均有表达，且在幼叶中表达量相对最高，在剑叶中最低。与野生
型拟南芥相比，转 NnMYB4 拟南芥植株花序茎变矮，花期延迟，茎木质部染色面积较小、染色程度变浅，
木质素含量显著降低。过表达 NnMYB4 分析结果显示，转基因拟南芥 AtC3H、At4CL1、AtF5H、AtCOMT
1 等木质素合成关键酶基因的表达量显著下调。[结论]荷花 NnMYB4 可能是木质素合成途径中的一个负调
控因子，对植物木质素合成具有负调控作用。 
关键词:荷花；R2R3-MYB；RT-PCR；木质素；调控 
中图分类号:S682.32 文献标志码:A 文章编号: 
Effect of Nelumbo nucifera R2R3-MYB transcription factor
NnMYB4 on lignin biosynthesis in Arabidopsis thaliana
LI Zhenzhen，LIU Zhaolei*，CHEN Fadi，JIANG Jiafu，CHEN Sumei1
(College of Horticulture，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China)
Abstract:[Objectives]we had a study on the function of Nelumbo nucifera R2R3-MYB transcription factor
NnMYB4, and to explore its role in lignin synthesis process. [Methods]we cloned a complete cDNA open reading
frame (ORF) of MYB by RT-PCR method, designated as NnMYB4. The expression of NnMYB4 in different tissues
of Nelumbo nucifera was analysed by real-time quantitative PCR (qRT-PCR). pMDC43-NnMYB4 overexpression
vectors were constructed and transformed into Arabidopsis thaliana by agrobacterium-mediated transformation.
Lignin content was determined by acetyl bromide. Finally, the expression of the key genes involved in lignin
synthesis were analyzed by qRT-PCR. [Results]The full length of the open reading frame was 726 bp, encoding
241 amino acids. It belongs to the R2R3-MYB transcription factor G4 subgroup and it was closely related to
Arabidopsis AtMYB4. NnMYB4 is expressed in the root, stem, leaf, but most strongly in the young leaves and most
weakly in the flag leaves. The transgenic plants showed inflorescence stems shorter, flowering delay, xylem stain
area and the degree of staining shallow smaller, lignin content was significantly reduced when compared to
wild-type A. thaliana.Over expression of NnMYB4 analysis showed that the key enzyme gene (including At4CL1,
AtC3H, AtF5H and AtCOMT1) of the lignin biosynthesis pathway was significantly reduced in transgenic
lines.[Conclusions]NnMYB4 is a negative regulator of genes involved in the lignin pathway and it can negatively
regulate the synthesis of lignin.
                                                              
收稿日期：2016–03–19
基金项目：中央高校基本科研业务费重大专项（KYTZ201401）；国家自然科学基金项目（31272202）
作者简介：李针针，硕士研究生。* 通信作者：刘兆磊，研究员，主要从事荷花遗传育种研究，E-mail：lzl@njau.edu.cn。
 
网络出版时间：2016-09-29 11:42:33
网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/32.1148.S.20160929.1142.022.html
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Keywords: Nelumbo nucifera；R2R3-MYB；RT-PCR；lignin；regulation

MYB 是高等植物基因组中最大的转录因子家族之一，广泛参与植物生长发育调控和环
境胁迫应答。MYB 转录因子 DNA 结合域包含 1~3 个由 50~53 个氨基酸残基组成的不完全
重复的 MYB 结构域（R），根据所含 MYB 结构域位置与数目的不同，可大致将植物 MYB
转录因子分为 3 个亚类：R1/2-MYB 或 R3-MYB、R2R3-MYB、3R-MYB[1]。R2R3-MYB 蛋
白在植物 MYB 家族中占绝大多数，在调控植物木质素合成和次生壁形成过程中起重要作用
[2-3]。根据 C 末端保守基序的差异，可将植物 R2R3-MYB 分为 22 个亚组[4]，同一亚组成员
之间往往具有相似的功能[5]。
木质素是一类广泛存在于维管束植物细胞壁中的芳香族化合物，与多糖类化合物（纤维
素、半纤维素）相互共价结合，增加维管束植物组织的机械强度，在植物抵抗外界非生物胁
迫过程中发挥着重要作用[3]。近年来关于 R2R3-MYB 转录因子对木质素合成影响的研究结
果表明，一些 R2R3-MYB 蛋白通过和 ACI、ACII、ACIII 等顺势作用元件结合，从而促进
或抑制木质素的合成[6-10]。到目前为止，与木质素合成相关的 R2R3-MYB 负调控因子大多
出现在 G4 亚组。
荷花（Nelumbo nucifera）是多年生水生植物，也是品种资源最丰富、栽培面积最大的
水生观赏性植物及经济作物。荷花的观赏性状不仅包含“花型”、“花色”等花的外观性状，
也包括“株形”、“叶径”等性状，而后者这些性状往往离不开组织中木质素的机械支撑作
用，因此研究荷花中木质素合成对改良某些观赏性状具有重要意义。目前关于转录因子对荷
花木质素合成途径的调控作用，鲜有报道。本研究从荷花中克隆得到一个与拟南芥 AtMYB4
高度同源的 R2R3-MYB 转录因子 G4 亚组成员 NnMYB4，并利用模式植物拟南芥对该基因
进行功能分析，旨在了解 NnMYB4 在木质素合成过程中的作用，为进一步深入研究荷花
NnMYB4 基因调控植物木质素合成的分子机制奠定了基础。 
1 材料与方法
1.1 植物材料与试剂
供试荷花（Nelumbo nucifera）品种‘黑龙江红莲’取自南京艺莲苑有限公司。拟南芥选
用哥伦比亚型（Columbia-0，Col-0），栽植于光照培养箱（8 h 黑暗/16 h 光照，17 /22℃ ℃）
中。 
RNA 提取试剂购于原平皓生物公司；大肠杆菌感受态、农杆菌  EHA105 和植物表达载
体 pMDC43 为本实验室保存；Real-Time PCR Kit（SYBR Green）、反转录试剂盒、pMD19-T
载体和聚合酶等均购自 TaKaRa 公司。引物合成和测序由上海捷瑞生物工程有限公司协助完
成。 
1.2 荷花 NnMYB4 的克隆与生物信息学分析
荷花总 RNA 的提取按照试剂盒说明书进行。利用 Primer Premier 5.0 设计荷花 NnMYB4
全长 ORF（XP_010266817）特异性引物 NnMYB4-F:5′ ATGGGGAGGTCTCCTTGCTG 3′和
NnMYB4-R:5′TTATTTCATTTCCAGGCTTCTATAATCC3′，以‘黑龙江红莲’叶片 cDNA 为
模板，高保真 PCR 扩增 ORF 全长。PCR 产物回收、纯化后，连接到 pMD19-T 载体上，挑
取阳性克隆、送测。 
利用 ORF finder 查找相关基因的开放阅读框，通过 BLAST 进行序列的同源性分析，采
用 DNAMAN 2.6 和 MEGA 5.0 分别进行氨基酸序列比对和系统进化树构建。
1.3 荷花 NnMYB4 的表达分析
根据荷花 NnMYB4 开放阅读框设计荧光定量引物，对荷花根、茎、叶柄、剑叶、幼叶、
成熟叶等组织部位进行基因表达分析。参照 SYBR Premix Ex Taq 试剂盒说明，实时荧光定
3 
 
量 PCR 反应程序为：95 60 s℃ ；95 15 s℃ ，60 15 s℃ ，72 45 s℃ ，40 个循环。相对定量采用
2-∆∆Ct 表示[11]。每个样品 3 次生物学重复。以荷花 NnACTIN 为内参基因[12]，内参引物序列：
NnACTIN-F:5′ACCACTGCTGACGGGAAAT3′,NnACTIN-R:5′ATGGCTGGAATAGAACCTC
A3′；荷花 MYB4 引物序列：NnMYB4-QTF:5′ TTCAGATTAGCCTTCCTTATCAACA3′，
NnMYB4-QTR:5′ TCCAGGCTTCTATAATCCAAA3′。
1.4 NnMYB4 过表达载体的构建与转化拟南芥
在 NnMYB4 全长 ORF 特异性引物的上下游分别添加 SalⅠ和 NotⅠ酶切位点，
NnMYB4-SalⅠ:5′GCGTCGACATGGGGAGGTCTCCTTG3′;NnMYB4-NotⅠ:5′TTGCGGCCG
CGATTATTTCATTTCCAGGCTTCTATAA3′，高保真 PCR 产物与入门载体 pENTR1A 质粒同
时进行 SalⅠ和 NotⅠ双酶切，连接、测序后单酶切使重组质粒pENTR1A-NnMYB4 线性化，将
线性化产物和 pMDC43 质粒进行 LR 重组，最后得到 pMDC43-NnMYB4 载体。 
采用冻融法将已构载体导入根癌农杆菌，在加入 Silwet L-77 的 1/2MS 液体培养基中扩
大培养，将拟南芥花序置于其中浸泡[13]，收集种子置于含有 50 mg·L-1潮霉素的培养基上筛
选阳性植株，利用引物 NnMYB4-F 和 NnMYB4-R 进行 PCR 验证，获得 T1 代转基因植株，
将上述 T1 代植株种子继续在潮霉素培养基上筛选，并利用引物 NnMYB4-QTF 和
NnMYB4-QTR 进行 qRT-PCR 验证，最终获得 T2 代转基因植株。 
1.5 木质素含量测定及拟南芥横截面切片观察
利用乙酰溴法[14]测定总木质素含量，首先分离拟南芥花序茎细胞壁，取 1.5 mg 脱淀粉
植物细胞壁，加入 100 μL 乙酰溴溶液（25%（体积分数）乙酰溴–冰醋酸），50°C 加热 3 h，
再加入 400 μL 2 mol·L-1 NaOH 和 0.5 mol·L-1 盐酸羟胺，280 nm 下测定样品吸光值，利用
Foster 等[14]的公式计算出木质素含量。每个样品 3 次重复。
野生型和 NnMYB4 转基因拟南芥各选 10 株，在花序茎基部切取 70 μm 厚的横截面，在
横截面上滴几滴 6 mol·L-1 HCl，保持 3 min，然后滴加 5%（体积分数）的间苯三酚，2 min
后放于光学显微镜下观察。
1.6 木质素、纤维素合成关键基因的表达分析
提取拟南芥花序茎 RNA，反转录成 cDNA，采用 qRT-PCR 测定拟南芥中香豆酸–3–羟
化酶基因（C3H）、4–香豆酸辅酶 A 连接酶基因（4CL1）、阿魏酸 5–羟化酶基因（F5H）、
咖啡酸–O–甲基转移酶基因（COMT1）、肉桂醇脱氢酶基因（CAD6）、肉桂酰 CoA 还原酶
基因（CCR1）、肉桂酸–4–羟化酶基因（C4H）、咖啡酰辅酶 A–O–甲基转移酶基因
（CCoAOMT1）、苯丙氨酸裂解酶基因（PAL1）等木质素合成关键酶基因的表达量。所用
引物见表 1。 
表1 qRT-PCR所用引物序列
Table 1 Primer sequences used in qRT-PCR
4 
 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
2 结果与分析
2.1 荷花 NnMYB4 全长 ORF 克隆与生物信息学分析。
通过与拟南芥木质素相关基因 AtMYB4 比对，在荷花基因组[15]中找到与之同源性最高
（73.6%）的荷花 MYB 基因，根据其全长 ORF 设计特异性引物，以‘黑龙江红莲’幼叶 cDNA
为模板扩增，得到该基因全长 ORF 序列。ORF 为 726 bp，编码 241 aa 的多肽，将该基因命
名为 NnMYB4。同源多序列比对（图 1）显示，NnMYB4 在 9~61 aa 和 62~116 aa 处含有 2 个
MYB 保守结构域，故可判断其为典型 R2R3-MYB 转录因子，在 C 端含有特征基序
LLsrGIDPX[T/S]HRX[I/L],pdLNL[D/E]LXi[G/S] ， GYDFLG[L/M]X4–7LX[Y/F][R/S]XLEMK
及 CX1-2CX7-12CX1-2C 保守锌指结构蛋白，推测 NnMYB4 属于荷花 R2R3-MYB 的 G4 亚组。 
进化树分析（图 2）结果显示，荷花 NnMYB4 与同属于 G4 亚组的拟南芥 AtMYB4、菊
花 CmMYB1、玉米 ZmMYB31 亲缘关系较近，上述基因已被证实在木质素合成途径中起负调
控作用，故推测荷花 NnMYB4 在木质素合成过程中也具有相似功能。

引物 Primer  序列 Sequence (5’–3’) 
AtC3H-F
AtC3H-R
At4CL1-F
At4CL1-R
AtF5H-F
AtF5H-R
AtCOMT-F
AtCOMT-R
AtCAD6-F
AtCAD6-R
AtCCR1-F
AtCCR1-R
AtC4H-F
AtC4H-R
AtCCoAOMT1-F
AtCCoAOMT1-R
AtPAL1-F
AtPAL1-R
AtCesA1-F
AtCesA1-R
AtCesA7-F
AtCesA7-R
AtCesA8-F
AtCesA8-R
AtIRX8-F
AtIRX8-R
CCAACGGTCTGAAGCTAGGTG
GCAAACGCCTTCTCATCAGC
CTCCGGTGTCTGGATCAACT
GAAATCTGGTGCTGCTCCTC
TCGTGTGATGATCAACGCGT
CGGTTCCAAAAACCTCGATG
CGTCGCAGACAACTTTGATG
TGATCTCCCACATGTCATCG
CGAGTCTCTCAAACGCAGTG
GTTAGGTGGAGTCGGTCACA
GTGCAAAGCAGATCTTCAGG
GCCGCAGCATTAATTACAAA
GCAAGCTGAATTGTCCACCT
CACATCCTTGAAGCTGAGCA
CATCATCGACCAATGGAGAA
TCGATCAAACGCTTGTGGTA
AAGATTGGAGCTTTCGAGGA
TCTGTTCCAAGCTCTTCCCT
GGTATTTATTGCGGCAACCT
ATCCAACCAATCTCTTTGCC
CAGGCGTACTCACAAATGCT
TGTCAATGCCATCAAACCTT
ACGGAGAGTTCTTTGTGGCT
GGTCTGTGTTGGAACAATGG
GTGGTCACAGGGAAAGGATT
AGCAAGAGAGGAGCAAGGAG
5 
 
 
图 1 NnMYB4 基因氨基酸序列比对 
Fig.1 Alignment of NnMYB4 with homologous proteins
R2、R3、C1、C2、C4、Zing finger 为保守结构域。R2, R3, C1, C2, C4 and Zing finger are conserved domains.
NnMYB4：荷花 Nelumbo nucifera XP_010266817；AtMYB4：拟南芥 Arabidopsis thaliana AAS10085；GhMYB9：陆地棉 Gossypium
hirsutum AAK19619；ZmMYB31：玉米 Zea mays NP_001105949；CmMYB1：菊花 Chrysanthemum morifolium DK942906；McMYB1：
观赏海棠 Malus crabapples NC_024253；PgMYB1：白云杉 Picea glauca AJD79907；SmMYB39：丹参 Salvia miltiorrhiza NC_023209
 
图 2 NnMYB4 基因进化树分析 
Fig.2 The phylogeny of NnMYB4 and related MYBs
Am：金鱼草 Antirrhinum majus；At：拟南芥 Arabidopsis thaliana；Nn：荷花 Nelumbo nucifera；Tf：紫露草 Tradescantia fluminensis；
Zm：玉米 Zea mays；Cm：菊花 Chrysanthemum morifolium；Os：水稻 Oryza sativa
2.2 荷花中 NnMYB4 的表达特性分析 
从图 3 可以看出：NnMYB4 基因在荷花根、茎、叶柄、剑叶、幼叶、成熟叶中均有表达，
6 
 
其中在幼叶中表达量最高，成熟叶次之，在剑叶中表达量最低。 
 
图 3 NnMYB4 在荷花不同组织的表达分析
Fig.3 NnMYB4 expression profiles in different tissue of Nelumbo nucifera
2.3 转基因拟南芥分子鉴定及表型分析
构建 pMDC43-NnMYB4 过表达载体,采用蘸花法来实现农杆菌介导转化拟南芥。转化后
的拟南芥通过潮霉素（hygromycin B）筛选，RT-PCR 鉴定（图 4-A）以及 qRT-PCR 鉴定（图
4-B），最后选出 2 个荷花 NnMYB4 基因表达量相对较高的转基因株系 35S::NnMYB4-1 和
35S::NnMYB4-2 用于后续试验。在相同生长条件下，对转 NnMYB4 基因的 T2代拟南芥进行
表型观察发现，转基因株系 35S::NnMYB4-1 和 35S::NnMYB4-2 比野生拟南芥开花晚[转基因
株系播种后（45±2）d 开花；野生型播种后（38±2）d 开花]、花序茎变矮（表 2），叶片与
花朵大小无明显差异（图 5）。说明 NnMYB4 过表达能够抑制拟南芥花序茎生长并延迟开花。

图 4 转基因株系 RT-PCR 和 qRT-PCR 鉴定 
Fig.4 RT-PCR and qRT-PCR demonstrate the heterologous expression of NnMYB4 in the transgenic line
A. RT-PCR；B. qRT-PCR 检测转基因拟南芥中 NnMYB4 相对表达量
WT：野生型拟南芥 Wild type Col-0；35S::NnMYB4-1，35S::NnMYB4-2：转基因株系 Transgenic lines；AtACTIN：拟南芥内参基
因 Internal control；1-5：转基因拟南芥株系 Transgenic lines（2：35S::NnMYB4-1；3：35S::NnMYB4-2）

7 
 
 
 
图 5 转基因拟南芥表型观察 
Fig.5 Transgenic phenotype observed
1：野生型拟南芥 Wild type Col-0 ；2，3：35S::NnMYB4-1 和 35S::NnMYB4-2 转基因拟南芥植株 35S::NnMYB4-1 and 35S::NnMYB4-2
are transgenic lines.
2.4 拟南芥横截面切片观察及木质素含量测定 
为初步确定荷花 NnMYB4 基因是否参与木质素的合成，在 NnMYB4 转基因株系及野生
型植株花序茎基部切取 70 μm 厚的横截面，染色后观察，发现转基因株系 35S::NnMYB4-1
和 35S::NnMYB4-2 比对照植株茎木质部染色面积小、染色程度浅，木质部细胞排列更疏松
（图 6）。为进一步明确荷花转录因子 NnMYB4 的功能，对拟南芥细胞壁中的木质素含量进
行了测定。由表 2 可知：转基因拟南芥株系 35::NnMYB4-1 和 35::NnMYB4-2 较野生型木质
素含量显著降低，分别降低了 12. 6%和 15. 4%。说明荷花 NnMYB4 基因对拟南芥木质素合
成具有抑制作用。 
 
图 6 拟南芥横截面切片染色观察图 
Fig.6 Observation of the cross-sectional slice staining of Arabidopsis
Co：皮层 Cortex；X：木质部 Xylem；F：维管束纤维 Interfascicular fibres 

表 2 野生型与转基因拟南芥花序茎长度和木质素含量
Table 2 Determination of inflorescence stem length and lignin content in wild type and transgenic Arabidopsis
8 
 
        注：不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。Different small letters indicate significant difference at 0.05 level. 
2.5 木质素合成关键酶基因的表达分析 
为明确荷花 NnMYB4 如何调控木质素合成相关基因的表达，对拟南芥木质素合成过程
中关键酶基因进行 qRT-PCR 分析。定量结果显示，转基因株系木质素合成关键基因 AtC3H、
At4CL1、AtF5H、AtCOMT1、AtC4H、AtCCR1 表达量降低，AtCAD6 表达量略微升高，
AtCCoAOMT1、AtPAL1 表达量变化不明显(图 7)。说明 NnMYB4 可能参与调控木质素合成，
是木质素合成过程中的一个负调控因子。 


图 7 木质素合成关键酶基因在转基因拟南芥中的表达分析
Fig.7 Expression analysis of genes involved in lignin synthesis in wild type and transgenic A. thaliana plants
heterologously expressing NnMYB4
3 讨论
以往研究发现，大部分参与植物次生壁代谢的 R2R3-MYB 在调节次生壁合成过程中起
正调控作用，但多数 R2R3-MYB 第 4 亚组成员在木质素合成中表现为负调控作用[16-18]。本
研究从荷花中分离得到一个转录因子即 NnMYB4，经序列比对、进化树分析，确定其属于
R2R3-MYB 转录因子 G4 亚组。与其他 G4 亚组木质素相关负调控转录因子一样，荷花
NnMYB4 基因 C 端也含有 C2:pdLNL[D/E]LXi[G/S]氨基酸基序，这一特征基序已被证明具有
转录抑制活性[19]，间接证明了荷花 NnMYB4 转录因子是木质素合成过程中的一个负调控因
子。 
本研究中，对转荷花 NnMYB4 拟南芥进行表型观察，发现植株出现矮化，花序茎缩短，
花期推迟，这一现象与金鱼草 AmMYB308 和 AmMYB330 在烟草，拟南芥 AtMYB4 和玉米
ZmMYB31 在拟南芥中过表达表型观察结果一致[17,20]。但不同的是，转 NnMYB4 拟南芥植株
叶片及花朵大小与对照相比无明显差异，成熟叶片也未出现白斑，可能是不同植物的该类基
因对不同表型性状作用强度有所不同，荷花 NnMYB4 对拟南芥花朵和成熟叶白斑大小调控
作用较小导致的。转 NnMYB4 拟南芥横截面切片观察和木质素含量测定结果直接说明了，
NnMYB4 能够抑制木质部细胞形成和降低木质素含量。 
木质素合成关键酶基因在木质素代谢过程中发挥着关键作用。松树 PtMYB4 在烟草中过
表达，能够使 PAL 表达量降低，CCR、COMT、C3H、CCoAOMT 表达量提高，同时转基因
  35S::NnMYB4-1  35S::NnMYB4-1  WT 
花序茎长度/cm 
Inflorescence stem length 
17.32±2.51b  16.81±1.35b  21.73±2.32a 
木质素含量/（mg•g-1）
Lignin content
181.33±2.35b  175.25±2.75b  207.35±3.31a 
9 
 
烟草木质素含量提高，髓部和韧皮部细胞发生木质化[7-8]；玉米木质素负调控转录因子
ZmMYB31 和 F5H、COMT 启动子区域顺式作用元件 AC-II(CCT/CAC/AC)结合，能够降低转基
因拟南芥 F5H 和 COMT 基因表达量[20]；在拟南芥中，使 C3H、4CL1、F5H、COMT 表达量
降低，结果导致木质素总含量和单体含量降低[21-23]；异源表达菊花 CmMYB1，转基因拟南
芥多数木质素、纤维素合成关键酶基因下调，木质素含量下降[24]。本研究分子检测结果证
实了转荷花 NnMYB4 拟南芥 AtC3H、At4CL1、AtF5H、AtCOMT1 等关键酶基因表达量降低，
与上述研究结果类似，从分子角度证明荷花 NnMYB4 基因负调控木质素合成。以上研究结
果，为进一步深入了解荷花 NnMYB4 对木质素合成调控的分子机制以及荷花的遗传改良奠
定了理论基础。 
 
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