全 文 ：收稿日期:2013－09－23
作者简介:翟斡( 1986－) ，男，在读硕士研究生。研究方向:中西医结合临床。
山核桃叶总黄酮诱导人多发性骨髓瘤
U266细胞株凋亡作用研究
翟 斡1，沈嫣婧2，沈一平1，丁志山2
(1．浙江省中医院，浙江 杭州 310006;2．浙江中医药大学，浙江 杭州 310053)
摘要:目的 研究山核桃叶总黄酮诱导人多发性骨髓瘤( U266) 细胞株凋亡的作用及其作用机制。方法
体外培养 U266细胞，CCK-8比色法检测细胞增殖活性，流式细胞术定量分析细胞凋亡程度，Western Blot
分析不同浓度总黄酮对 U266细胞蛋白激酶 B( Akt) 和 p-Akt蛋白表达的影响。结果 山核桃叶总黄酮以浓
度依赖性方式显著诱导 U266细胞株凋亡并抑制 p-Akt蛋白的表达。结论 山核桃叶总黄酮诱导 U266细胞
凋亡的作用与其抑制 Akt磷酸化相关。
关键词:人多发性骨髓瘤; U266细胞株;山核桃叶总黄酮;凋亡;蛋白激酶 B; p-Akt
中图分类号:Ｒ285．5 文献标志码:B 文章编号:1003－8450(2014)02－0007－05
山核桃(Carya cathayensis Sarg．)属胡桃科山核
桃属，山核桃叶具有清热解毒、杀虫止痒的功效。山
核桃植物不同部位提取物具有抗肿瘤［1 － 3］、抑
菌［4 － 5］、抗氧化［6 － 7］、抗衰老［8］、杀虫［9］的药理作用。
文献［10］报道山核桃叶提取物具有抑制肿瘤细胞
增殖和诱导细胞凋亡的作用。山核桃叶提取物中含
有蒽醌类、酚类、黄酮类、多糖、强心苷、三萜类化合
物及其皂苷、鞣质、有机酸等化学成分［11］。
本实验使用的山核桃叶总黄酮由浙江中医药大
学中药学博士丁志山教授采自浙江临安林间，经
60%乙醇洗脱部分即为山核桃叶总黄酮，其总黄酮
得率为(74．93±2．10)%，纯度(74．07±2 ．61)%［12］。
前期实验已从山核桃叶总黄酮中分离鉴定出含量较
高的汉黄芩素、白杨素、小豆蔻明、球松素查尔酮、松
属素 5 个黄酮类活性成分［13］。多发性骨髓瘤
(MM)是一种恶性浆细胞病，其肿瘤细胞起源于骨
髓中的浆细胞，发病率估计为 2 ～ 3 /10 万，男女比例
为 1．6 ∶ 1，大多患者年龄＞40 岁。目前总黄酮对人
多发性骨髓瘤 U266 细胞株的作用尚未见报道。本
实验旨在运用细胞形态学、流式细胞术、Western
Blot等技术方法研究山核桃叶总黄酮诱导 U266 细
胞株凋亡与 p-Akt 表达量变化的关系，观察山核桃
叶总黄酮抗肿瘤的临床作用。
1 材料
药物及细胞:山核桃叶采自浙江临安林间，山核
桃叶总黄酮由浙江中医药大学生命科学学院提取制
备;U266细胞(浙江省中医院血液科实验室)。
试剂:ＲPMI1640 培养液(批号 13050904，吉诺
生物医药技术有限公司) ，无支原体胎牛血清(批号
130407，浙江天杭生物科技有限公司)，二甲基亚砜
(批号 20120323，天津市永大化学试剂有限公司) ，
Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒(批号 TK798，碧
云天生物技术研究所) ，吖啶橙(AO)荧光染料(Sig-
ma产品)。
仪器:电子天平(AＲ1140，美国奥豪斯公司)，
DGG－9070A电热恒温鼓风干燥箱(上海森信实验
仪器有限公司)，荧光倒置显微镜(ECLIPSE Ti －
DH，日本尼康公司)，细胞 CO2 培养箱(HEPA
CLASS100，美国 THEＲMO公司) ，超净工作台(SW－
CJ－1F，苏净集团安泰公司)，低速离心机(LD4－2A，
北京医用离心机厂)。
2 方法
2．1 细胞培养及总黄酮配制
将 U266细胞接种于含 10%胎牛血清、100 U/mL
青霉素和 100 U /mL链霉素的 ＲPMI1640培养液中，
于 37 ℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中常规培养，1
～2 d传代 1 次。所有实验操作均采用对数生长期
的细胞。取山核桃叶总黄酮 5 mg溶于 1 mL的二甲
基亚砜(DMSO)震荡、离心后作为 5 mg /mL 母液。
每次取 50 μL 的母液加入 950 μL 的 ＲPMI1640 培
养液中，配置成 250 μg /mL的工作液。
2．2 CCK-8测定
U266 细胞用 ＲPMI1640 培养液稀释成 2 × 1
04 个 /mL，接种到 96 孔细胞培养板中，每孔 2
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00 μL，并于 37 ℃，5%CO2 培养箱中静置培养;2 4 h
后用不同体积的工作液(10，20，40 μL)共同培养处
理，每个浓度 5个复孔，为排除药物干扰检测，设置
加了相应量细胞培养液、药物但没有加入细胞的孔
作为空白对照。共培养处理 24 h 后，每孔加入
CCK-8溶液 20 μL，混匀，37 ℃继续孵育 2 h 后，于
450 nm波长处用酶标仪测定各吸光度值，然后按以
下公式计算抑制率。抑制率(%)= (1 －实验组 A /
对照组 A)×100%。
2．3 AO染色观察细胞凋亡的形态变化
2．3．1 染色液的配制 取 1 mg吖啶橙(AO)粉末溶
解于 1 mL pH7．4 的 PBS 液中，得到质量浓度为 1
mg /mL的 AO母液，每次用 PBS稀释成 10 μg /mL后
使用。
2．3．2 接种并培养细胞 取对数生长期 U266 细
胞，将 2×104个 /mL 细胞植入 96 孔培养板内，每孔
体积 200 μL，每组各设 5个平行孔。并于 37 ℃，5%
CO2 培养箱中静置培养 24 h。
2．3．3 药物处理细胞 分别加入不同体积的工作
液(10，20，40 μL) ，置于 37 ℃、5%CO2 饱和湿度培
养箱内孵育 24 h。
2．3．4 染色 每孔加入 AO 1 μL，置于 37℃、5%
CO2、饱和湿度培养箱内孵育 30 min，倒置显微镜下
观察。
2．4 流式细胞仪检测细胞凋亡
1)收集培养 24 h 的空白组和山核桃叶总黄酮
(11．90，22．72 和 41．66 μg /mL)组共 4 组细胞混悬
液，各 2 mL(约 1 000～2 000 r /min)，离心 5 min，弃
上清液，用 PBS 轻轻重悬细胞并计数。2)取(1 ～ 5
)×105重悬的细胞，各体积细胞悬液离心 5 min，弃
上清液，加入 500 μL Loading buffer重悬细胞。3)加
入 5 μL Annexin V-FITC，轻轻混匀;再加入 5 μL 碘
化丙啶，轻轻混匀。4)室温(20 ～ 25 ℃)避光孵育 1
5 min，使用铝箔进行避光。5)进行流式细胞仪检
测，于流式细胞仪(EPISXL，Coulter)上进行荧光检
测。
2．5 Western-blot检测相关蛋白表达
细胞处理及总蛋白抽提:收集细胞，漂洗，加上
样缓冲液，裂解细胞。SDS-PAGE 电泳:配置 10%分
离胶 8 mL 及 5%浓缩胶 4 mL 制电泳胶。上样 2
0 μg蛋白样品，浓缩胶电泳 60 V，0．5 h，分离胶电泳
80 V，1．5 h。转膜:转移凝胶上的蛋白至硝酸纤维
素膜(NC)，加入转移缓冲液，4 ℃，90 V，转移 1
．5 h。免疫印迹:转膜结束，TBS-T 漂洗 NC 膜 5 min，
5%脱脂奶粉室温封闭 1 h，一抗 4 ℃孵育过夜。TBS-
T漂洗 3次，每次 5 min。1%脱脂奶粉漂洗 2次，每次
5 min。加入二抗(1 ∶ 5 000，1%脱脂奶粉 /TBS-T 稀
释)室温孵育 1 h，1%脱脂奶粉 /TBS-T 漂洗 2 次，每
次 5 min，TBS-T漂洗 3次，每次 5 min。HＲP 化学发
光增强试剂(ECL，Pierce)使 NC 膜显色 2～5 min，暗
室曝光、显影、定影，实验重复 3次。
2．6 统计方法
结果以珋x±s表示，采用 SPSS 13．0统计软件对数
据进行处理分析，各组间比较采用单因素方差分析，
以 P＜0．05为差异有统计意义。
3 实验结果
3．1 山核桃叶总黄酮对 U266细胞增殖的抑制作用
山核桃叶总黄酮对体外培养的 U266 细胞增殖
具有明显的抑制作用。山核桃叶总黄酮作用于
U266细胞 24 h后，在药物质量浓度为 11．90 μg /mL
时，其细胞活性为 90．23%，与空白组比较差异有高
度统计意义(P＜0．01)，表明此时细胞的增殖活力下
降，用该质量浓度药物处理时，对 U266 的抑制率为
9．76%，随着药物质量浓度的增加，抑制率逐渐增
加，当药物质量浓度为 41．66 μg /mL 时，抑制率为
51．59%，结果表明山核桃叶总黄酮具有一定的抑制
U266细胞增殖的作用，且呈量效关系。详见表 1。
表 1 不同质量浓度山核桃叶总黄酮对 U266细胞
增殖的抑制作用
组别 Abs /450 nm 抑制率 /%
空白组 0．922±0．002 —
11．90 μg /mL组 0．832±0．002 9．76＊＊
22．72 μg /mL组 0．642±0．023 30．36＊＊
41．66 μg /mL组 0．443±0．013 51．95＊＊
注:与空白组比较＊＊P＜0．01。
3．2 U266细胞形态学变化
U266细胞经山核桃叶总黄酮作用 24 h 后，经
AO染色后在荧光显微镜下观察，细胞出现凋亡的
特征性形态学改变。正常活细胞在镜下核染色质呈
现均匀的淡绿色荧光。凋亡细胞体积变小，细胞核
固缩、边集或碎裂，着绿色荧光，出现凋亡小体。不
同质量浓度山核桃叶总黄酮均能抑制 U266 细胞增
殖，随着总黄酮质量浓度的增加，U266 细胞数量明
显减少，出现细胞外形不规则改变及凋亡小体、碎
片。详见图1。
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A 空白组;B 11．90 μg /mL组;C 22．72 μg /mL组;D 41．66 μg /mL组
图 1 不同质量浓度山核桃叶总黄酮下 U266细胞形态(100×)
3．3 不同质量浓度山核桃叶总黄酮作用于 U266 细
胞后细胞凋亡情况比较
经流式细胞仪检测，空白组以活细胞为主，有少
量凋亡细胞，凋亡率(2．90±0．70)%;11．90 μg /mL组
作用 24 h 后，细胞凋亡率为(14． 5 ± 0． 98)%;2
2．72 μg /mL组作用 24 h 后，细胞凋亡率为(30．1±1．
92)%;41．66 μg /mL 组作用 24 h 后，细胞凋亡率为
(54．3±1．7)%。与空白组比较，差异有统计意义(P
＜0．05)。表明山核桃叶总黄酮能诱导 U266 细胞凋
亡，并呈质量浓度－效应依赖关系。详见图 2。
A 空白组;B 11．90 μg /mL组;C 22．72 μg /mL组;D 41．66 μg /mL组
图 2 不同质量浓度山核桃叶总黄酮作用于 U266细胞后细胞凋亡情况比较
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3．4 Akt和 p-Akt蛋白表达
不同质量浓度山核桃叶总黄酮处理 U266 细胞
24 h后，应用 Western Blot技术检测到细胞中 p-Akt
蛋白表达量随药物质量浓度增加而递减，证明了山
核桃叶总黄酮能明显抑制 Akt的磷酸化。
总黄酮质量浓度 0 11．9 22．72 41．66 μg /mL
图 3 细胞中 Akt，p-Akt蛋白表达量的变化
4 讨论
Akt(又称 PKB，即蛋白激酶 B)在 PI3 Kinase
Akt Signaling中起到枢纽作用，广泛参与细胞生长、
增殖、分化的生命进程中，具有抗凋亡作用［14］。Akt
作为细胞内的第二信使分子，被激活后所转导的信
息能调节多种生物学功能，在抑制细胞凋亡过程中
起着很重要的作用［15］。文献［16］报道 Akt 能通过
磷酸化 P53结合蛋白 MDM2影响 P53 的活性，磷酸
化的 MDM2 转位到细胞核与 P53 结合，通过增加
P53蛋白的降解而影响细胞存活。通过调节 Akt 表
达从而调整细胞增殖与凋亡的平衡，达到抑制肿瘤
生长的目的。磷酸化的 Akt抑制促凋亡蛋白 Bad 及
Bax的表达来促进细胞的生存。Bad 及 Bax 可拮抗
Bcl-2等抑制凋亡蛋白来促进细胞凋亡。磷酸化
Akt能终止 Bad 及 Bax 对 Bcl-2 的拮抗作用，使得
Bcl-2恢复抗细胞凋亡的功能。磷酸化 Akt 的过度
表达导致肿瘤形成，因此可以通过改变磷酸化 Akt
的量来调节下游蛋白的活化，进而调节细胞的增殖
凋亡、分化的生命过程。
实验结果表明，随着山核桃叶总黄酮质量浓度
的增加，对 U266 细胞增殖的抑制明显增强，当药物
质量浓度增加到 41． 66 μg /mL 时，抑制率为 5
1．95%，细胞的增殖活力下降;荧光染色后观察到
U266细胞增殖明显抑制及其明显凋亡形态改变;使
用流式技术检测总黄酮对细胞的状态定量的统计，
当山核桃叶总黄酮质量浓度增加到 41．66 μg /mL
时，作用 24 h 后细胞凋亡率为(54．1±1．93)%，差异
有统计意义(P＜0．05)，证明药物处理 24 h 后，随药
物质量浓度的增加，细胞的凋亡作用更加明显;应用
Western Blot技术检测到 p-Akt 蛋白表达量随药物
质量浓度增加而递减，证明了山核桃叶总黄酮能明
显抑制 Akt的磷酸化，p-Akt 的减少在 U266 细胞凋
亡中起到重要作用。
细胞中 Akt蛋白及 p-Akt 蛋白量的变化在肿瘤
发生过程中具有重要作用，Akt 蛋白磷酸化后可以
抑制促凋亡蛋白的表达，进而使细胞过度增殖。肿
瘤细胞中 Akt蛋白磷酸化量过度表达，进而抑制促
凋亡蛋白量的表达，细胞内正常的促凋亡与抑制凋
亡平衡机制的打破，细胞凋亡受阻，导致肿瘤细胞无
限增殖。山核桃叶总黄酮通过抑制 U266 细胞中
Akt蛋白的磷酸化，减少 p-Akt 蛋白数量，进而解除
了 p-Akt蛋白对促凋亡蛋白的抑制作用，导致 U266
细胞凋亡。本实验是探讨山核桃叶总黄酮体外诱导
U266凋亡作用与 PI3K /Akt 通路的研究，结果证明
了山核桃叶总黄酮诱导 U266 细胞凋亡的作用是通
过降低磷酸化 Akt的表达而完成的。
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［编辑:张莉云］
Apoptotic effects of total flavonoid from the leaves of Carya cathayensis Sarg． on U266
Zhai Wo1，Shen Yanjing2，Shen Yiping1，Ding Zhishan2
( 1． Zhejiang Provincial Hospital of TCM，Hangzhou 310006，China;
2．Zhejiang University of TCM，Hangzhou 310053，China)
Abstract: Objective To observe the apoptotic effects of total flavonoids from the leaves of Carya cathayensis
Sarg． on U266 and their underlying mechanisms． Methods U266 were cultured in vitro． cell proliferation was
measured by CCK-8． Cell apoptosis was assayed by flow cytometry． The expression of Akt and p-Akt of U266 after
treatment with different concentrations of total flavonoids was analyzed by western blot． Ｒesults Total flavonoids
from the leaves of Carya cathayensis Sarg． significantly induced U266 apoptosis and inhibited the expression of p
-Aktin a concentration-dependent manner． Conclusion The apoptotic effects of total flavonoids from the leaves of
Carya cathayensis Sarg． on U266 was associated with the inhibition of phosphorylation of Akt．
Key words: multiple myeloma; U266 cell lines; total flavonoids from the leaves of Carya cathayensis Sarg．;
apoptosis; Akt; p-Akt
櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊
·学术探讨·
收稿日期:2013－10－06
基金项目:国家自然科学基金项目( 81273857) ，安徽省卫生厅中医药科研项目( 2012zy34)
作者简介:王冠超( 1979－) ，男，在读硕士研究生。研究方向:针灸临床及其作用机制研究。
通信作者:肖伟( 1961－) ，女，主任医师，硕士生导师。研究方向:针灸临床及其作用机制研究。
针灸歌赋中治疗中风的相关穴位分析
王冠超1，肖 伟2
(1．安徽中医药大学，安徽 合肥 230038;2．安徽省针灸医院，安徽 合肥 230061)
摘要:目的 探析临床针灸歌赋中的中风治疗用穴特点。方法 根据明代杨继洲所著《针灸大成》记载
的针灸歌赋内容，摘录针灸歌赋中有关治疗中风的部分，按照中风、类似疾病名称及中风的症状( 半身不遂、
肢体痿软无力、肢体经筋屈曲拘挛、语言不利及不语、口角歪斜及流涎等) 、类似症状进行分类，然后进行归
纳、综合分析。结果 临床相关的针灸歌赋中，涉及治疗中风的歌赋 14首，涉及处方 30张，28个穴位( 52穴
次) ，涉及经脉 10条。结论 在临床相关的针灸歌赋中，中风治疗的选穴主要有以下特点:注重辨证取穴;
阳经取穴为主，阳明经穴是重点;强调循经取穴;重视局部取穴，结合远道取穴;兼顾对症取穴;突出特定穴;
强调泻法，同时补泻兼施，针灸并用;擅长特殊方法。
关键词:针灸疗法;针灸歌赋;中风;选穴
中图分类号:Ｒ245 文献标志码:A 文章编号:1003－8450(2014)02－0011－06
针灸歌赋是针灸学的重要组成部分，是用歌、赋 两种韵文形式来阐述针灸学的内容，它既有针灸基
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