全 文 ：HPLC-MSn法鉴定葫芦巴碱及其在大鼠体内的主要代谢产物
陈　勇 1* , 沈少林 1 , 陈怀侠2 , 潘　军 1 , 韩凤梅 1
(1. 湖北大学 中药生物技术省重点实验室 , 湖北 武汉 430062;2. 武汉大学 化学与分子科学学院 , 湖北 武汉 430070)
摘要:目的　建立快速灵敏的 LC-MSn检测葫芦巴碱及其在大鼠体内代谢物的分析方法。 方法　以葫芦巴碱对
LC-MS2色谱及质谱条件进行优化 , 分析其电喷雾质谱的一级电离规律和多级质谱裂解规律 ,以此作为葫芦巴碱大鼠
体内代谢物分析鉴定的依据。健康大鼠尾静脉注射 8 m g kg - 1葫芦巴碱 , 收集 0 ～ 48 h的尿样 ,经 C18小柱固相萃取
分离纯化后 , 直接采用 LC-MSn方法对尿样进行测定。结果　根据生物体内药物代谢转化规律及母体药物的色谱-质
谱行为规律 , 在尿样中鉴定出母药及其 N-去甲基 、N-去甲基环氧化产物 ,以及母药及其 N-去甲基环氧化物的甘氨酸
轭合物。结论　本方法灵敏 、快速 、选择性高 、专属性好 , 可用于葫芦巴碱的代谢产物研究。
关键词:LC-M Sn;葫芦巴碱;代谢物
中图分类号:R917　　　文献标识码:A　　　文章编号:0513 - 4870(2006)03 - 0216 -05
收稿日期:2005-06-01.
基金项目:湖北省杰出青年基金项目 (2002AC004);中药生物
技术省重点实验室开放基金项目(2004CTM 001).
*通讯作者　Tel / Fax:86 - 27 - 88663590,
E-m ai l:cy101610@ npc. gov. cn
HPLC-MSn analysis of tr igonelline and itsm etabolites in rat urine
CHEN Yong
1* , SHEN Shao-lin1 , CHEN Huai-xia2 , PAN Jun, HAN Feng-m ei1
(1. B io-Technology of T rad itiona l ChineseMedicineKey Lab of Hubei P rovince, Hubei University, Wuhan 430062 , China;
2. College of Chem istry and Molecular Science, Wuhan University, Wuhan 430070 , Ch ina)
Abstract:A mi 　 To estab lish a rapid and sensitive LC-MSn me thod for the iden tification o f
trigone lline and its main me tabo lites in rat urine. Methods　A fter op tim izing the de tec tion cond itions o f
LC-MSn chromatog raphy and mass spec trometry using trigonelline, its ion ization and c leavage in ESI-MS
and ESI-MSn modes we re summarized, then se rv ing as the basis fo r the metabolite ana ly sis of trigonelline in
ra t urine. The 0 - 48 h urine samp les of ra ts w ere co llec ted after iv 8 mg kg- 1 trigone lline, then, the
samp lesw ere purified through C18 so lid-phase ex traction cartridge. The purified samp lesw ere analy zed by
LC-MSn. Results　The struc tures of trigonelline metabo lites w ere elucidated according to the changes o f
the mo lecularw eights of theme tabo lites(ΔM) and the ir cleavage pattern in ESI-ITMSn. A s a result, tw o
phase Im etabo lites and the paren t drug we re identified existing in ra t urine, and tw o phase IIme tabo lites
w e re identified. Conclusion　The LC-MSn me thod is rapid and h igh sensitive and specific, it is su itable
for the identifica tion of trigone lline and itsme tabo lites in rat u rine.
Key words:LC-MSn;trigone lline;me tabo lite
　　葫芦巴碱( trigone lline,图 1)为豆科植物葫芦巴
(Trigonella foenum-graecum L. )干燥成熟种子中的
主要生物碱之一 ,具有温肾 、祛寒 、止痛之功效 ,中国
药典将其作为治疗肾脏冷虚 、小腹冷痛 、寒湿脚气的
主要药物 [ 1] 。现代药理研究[ 2]表明 ,葫芦巴碱具有
较强的抗肿瘤 、降血糖等作用 ,在国外多用于退热 、
止咳 、降胆固醇 、降血糖等药剂中 。
F igure 1　S truc ture o f trigone lline
216 药学学报 Ac ta Pharm aceu tica S in ica 2006, 41(3):216 - 220
目前 ,文献 [ 3, 4]报道的主要是对葫芦巴碱含量
测定 、药代动力学以及药理学等方面的研究 ,未见葫
芦巴碱生物体内代谢转化的研究报道 。而研究葫芦
巴碱生物体内代谢转化过程 ,对于阐述该药物的药
效机制及指导临床合理用药具有重要的意义。
本文应用液相色谱-电喷雾离子阱串联质谱法
(HPLC-MSn)研究了葫芦巴碱静脉注射给药后 ,在
大鼠体内的代谢产物 ,方法灵敏 、快速 、选择性高 、专
属性较好。
材料与方法
药品与试剂　鉴定用葫芦巴碱对照品购于中国
药品生物制品检定所;色谱纯甲醇 、乙腈 (Fishe r公
司 ,美国)、超纯水 ,其他试剂均为分析纯。
仪器　美国 Finnigan公司 LCQDUO型液相色谱-
离子阱质谱仪 (LC /ESI-ITM S),包括电喷雾电离源
(ESI), TSP P4000泵及 TSP AS3000自动进样器;X-
calibre 1.2数据处理系统;H ighchem 公司 M ass
Fron tie r 1.2质谱解析软件;AccuBond II C18固相萃
取柱(A gilen t, 200mg, 3mL)。
对照溶液　用甲醇配制 1.0 mg mL -1葫芦巴
碱标准储备液 ,用甲醇稀释至 10 μg mL -1后直接
进样。
色谱条件 　A gilen t Ex tend-C18色谱柱 (100
mm ×3.0mm ID , 3.5μm),乙腈-甲酸水溶液流动相
(pH 3.5, 75∶25),流速 0.3mL m in-1 ,柱温 25℃,
进样量 10μL。
质谱条件　ESI离子源;扫描范围 m /z 100 ～
1 000;离子源喷射电压 3.5 kV;毛细管电压 45 V;
毛细管温度 280℃;鞘气 (N 2)流速 60个单位;自动
进样器直接进样 ,在正离子检测模式下采用全扫描
一级质谱及其源内碰撞诱导解离 ( sou rce C ID ,
S-C ID)等方式进行测定 。
实验动物　雄性 W istar大鼠 (220±5) g,购于
湖北省实验动物研究中心 。
尿样的收集及样品的预处理 　取健康大鼠 6
只 ,置于代谢笼中 ,禁食 12 h,收集空白尿样 。尾静
脉注射葫芦巴碱 8mg kg-1后 ,收集 0 ～ 48 h尿样 ,
放置于 -20 ℃冰箱中保存备用 。测试前 ,先将空白
尿样及给药后的尿样融化 , 离心分离 ,取上清液
1 mL,均以经甲醇和水活化的固相萃取柱 (C18)固
相萃取 ,以蒸馏水 1 mL冲洗 ,再以甲醇 1 mL洗脱 ,
收集洗脱液 ,离心 10 000 r m in-1 ,吸取上清液 ,直
接用于 LC-MSn分析 。
结果
1　葫芦巴碱对照品的 HPLC-MSn分析
葫芦巴碱经 HPLC-MS2检测 , 检测限在 0.1
μg mL - 1以下。其 HPLC-MS2色谱及其各级质谱示
于图 2B。葫芦巴碱的一级质谱以质子化分子离子
峰 m /z 138[M +H ] +为基峰 ,还有较强的二聚体峰
m /z 275 [ 2M +H ] +及三聚体峰 m /z 412 [ 3M +
H] + ,聚合体分子离子峰的相对强度随聚合度增加
而减弱。同时 ,上述各分子离子在一级质谱中还出
现了相应的加钠弱峰 ,如 m /z 160[M +N a] + , m /z
297[ 2M +Na] +和 m /z 434[ 3M +H ] +等 。源内碰
撞诱导解离(S-C ID)后各聚合体和加合离子峰均减
弱或消失 。
采用碰撞诱导解离 (C ID)技术 ,对葫芦巴碱分
子离子 m /z 138[M +H ] +进行了 LC-MSn分析 ,其
LC-MS2色谱及二级质谱图分别见图 2A和 2C , 显
然 ,其保留时间为 2.88 m in。葫芦巴碱的二级特征
碎片较简单 ,主要有 m /z 94[M - CO 2 +H ] + , 110
[M -CO +H ] +和 124[M -CH2 +H ] +等 ,即特征性
中性碎片丢失为 44, 28和 14 u。说明葫芦巴碱的六
元环共轭结构比较稳定 ,不易裂解 ,分子中两个取代
基-CH3和-COO -易断裂丢失。为得到更多碎裂信
息 ,对其中的二级碎片 m /z 124[M - CH2 +H ] +进
行了三级质谱 (图 2D)分析 ,得到了 m /z 80, 96等特
征三级碎片。
2　大鼠尿样中葫芦巴碱及其代谢物的 HPLC-MSn
分析
由于药物在生物体内的代谢转化主要是药物分
子进行官能团化反应或与内源性极性分子的结合反
应等 ,即代谢物仍保留了原药的基本骨架结构或亚
结构 ,因而具有原药特征的质谱裂解碎片或中性丢
失。因此 ,葫芦巴碱的上述质谱裂解规律可作为其
生物体内代谢物结构分析的主要依据。结合药物的
体内代谢规律 ,对葫芦巴碱大鼠体内的代谢物进行
如下分析 。
以空白尿样及葫芦巴碱为对照 ,在大鼠尿样的
一级全扫描质谱中发现与原药结构相关的组分有
m /z 124, 138, 156 , 195, 213等 。其中 ,准分子离子
m /z 138(M0)的保留时间(2.88 m in)及二级质谱与
葫芦巴碱完全相同 ,说明 m /z 138对应于未代谢的
原药 。
准分子离子 m /z 124(保留时间 1.57 m in, M1)
的二级质谱特征性丢失 44 u和 28 u后得到主要碎
片峰 m /z 80和 96(图 3A), 分别比母药准分子离子
217 陈　勇等:HPLC-MSn法鉴定葫芦巴碱及其在大鼠体内的主要代谢产物
F igure 2　LC-MSn chromatogram (A), MS spectrum (B), MS2 spectrum (C) andM S3 spec trum
(D) of trigone lline
F igure 3　MS2 spec tra o f trigonelline’ s metabolitesM 1(m /z 124, tR 1.57m in), M2(m /z 156, tR 2.56m in),
M3(m /z 195, tR 1.81 m in) andM 4(m /z 213, tR 1.94m in) in rat u rine
峰 m /z 138,及其二级碎片 m /z 94, 110少 14 u ,即均
发生了相同的质量数漂移。而 14 u正好对应亚甲
基质量数 , 故推测 m /z 124为原药脱甲基代谢物 。
将此物质二级质谱和原药二级质谱中的脱甲基碎片
m /z 124的三级质谱进行比较 ,两者吻合 ,进一步证
实了以上推测 。
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准分子离子峰 m /z 156(保留时间 2.56 m in,
M 2)的二级质谱产生了一个与原药同质荷比的碎片
离子 m /z 138(图 3B),但其三级质谱和原药分子离
子 m /z 138的二级碎片不一致 ,故该碎片和原药的
结构不同。推测准分子离子 m /z 156应为原药脱甲
基后环上两个 C被氧化的代谢产物 ,其基峰 m /z
110应为 m /z 156同时脱去一分子 H2O和 CO后的
碎片 , m /z 138为准分子离子 m /z 156脱水产生。环
氧化位置之一应在 C6 ,因为 C6位于 N原子和羧基
中间 ,活性较强而易被氧化 。另一氧化位置可能在
C2或 C4 ,而不可能在 C3上 ,这是由于其二级碎片
中还出现了 m /z 130 ,此为分子开环失去中性碎片
C2H2后的产物。故推测两个羟基位于环的 6位及 2
或 4位 。
准分子离子 m /z 195(保留时间 1.81m in, M3)
的二级质谱主要产生 m /z 177, 167, 151 , 120和 76
等碎片 (图 3C)。其二级碎片中出现了比母药葫芦
巴碱最小的二级碎片 m /z 94还小的碎片 m /z 76,故
推测此峰可能对应于轭合物碎片峰 。将碎片 m /z
76进行三级质谱分析 ,其三级特征碎片和甘氨酸标
准品的二级质谱完全一致 ,见图 4。因此 ,可推测准
分子离子 m /z 195为母药和甘氨酸的轭合产物 。其
他二级碎片分析如下:m /z 177为 m /z 195羧基上的
羟基发生重排后的脱去一分子水的碎片 , m /z 167
为 m /z 195脱羰基 (CO)碎片 , m /z 151为 m /z 195
脱羧基 (CO 2)碎片 , m /z 120是 m /z 195中性丢失一
分子甘氨酸 (75 u)后的产物。
F igure 4　MS3 spectrum of glycin
准分子离子 m /z 213(保留时间 1.94m in, M4)
脱去一分子水产生碎片 m /z 195,而该分子离子同
时脱去 H2O和 CO产生碎片 m /z 167(图 3D),这与
M 2(m /z 156)的二级碎片丢失规律相似。同时 ,m /z
213的二级质谱中还产生了与 m /z 156(M2)二级碎
片相同的碎片峰 m /z 110和 m /z 138,说明在准分子
离子 m /z 213中含有 M2结构部分 ,故推测 m /z 213
可能为 M2的 II相甘氨酸轭合产物 。子离子 m /z
138是由母分子离子 m /z 213丢失中性碎片 75 u产
生 ,该碎片对应于甘氨酸 ,由此 ,进一步证实了上述
推论 。
在大鼠 0 ～ 6 h尿液中已可检测到上述代谢产
物 ,但各物质相对丰度均较低;6 ～ 24 h尿液中 m /z
138成为第二强峰 (基峰为杂质峰 m /z 114,此峰在
空白尿样中也存在 ),其他代谢物相对丰度均有所
提高;24 ～ 48 h尿样的一级质谱和空白尿样基本一
样 ,说明葫芦巴碱已代谢完全。主要代谢物的排泄
过程发生在 6 ～ 24 h。葫芦巴碱在大鼠体内的代谢
途径见图 5。
F igure 5　The proposed m ajor me tabo lic pa thw ay o f
trigonelline in ra ts (G ly=g lycine)
讨论
对于尿样的预处理 ,作者比较了固相萃取小柱
和高速离心法 。固相萃取小柱可去除尿样中的尿
素 ,及一些盐类成分 ,但在萃取过程中有可能损失部
分代谢产物 。高速离心法通过对尿样直接高速离
心 ,取上清液进样分析。实验结果表明 ,上述尿样处
理方法的定性分析结果基本相同 ,文中所述的 4种
代谢物均可被检测到。但使用固相萃取小柱对杂质
的去除效果较好 ,有利于保护色谱柱。
HPLC-MSn联用技术集分离和检测于一体 ,对被
测物不需复杂的分离富集即可直接进样 ,获得被测
物的分子结构信息 ,从而能够在没有对照品的情况
下对未知物进行定性分析 [ 5, 6] 。该方法已成为药物
代谢物研究的首选方法之一 。实验结果表明 ,葫芦
巴碱部分以原药形式直接从大鼠尿液中排出 ,其在
大鼠体内 I相生物转化主要是氮脱烷基化和氮去甲
基环氧化产物 ,第 II相生物转化主要是甘氨酸轭合
产物 。这为进一步研究葫芦巴碱的生物体内代谢过
程提供了科学依据 。
219 陈　勇等:HPLC-MSn法鉴定葫芦巴碱及其在大鼠体内的主要代谢产物
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关于召开全国医药学术交流会
暨临床药理学研究进展学术研讨会的通知
2006年 8月中旬在新疆乌鲁木齐市召开全国医药学术交流会暨临床药理学研究进展学术研讨会 , 会议主题:了解新药
动态 ,倡导科学用药。会议由中国药理学会主持 , 华中科技大学同济医学院临床药理研究所和《医药导报》杂志社共同承
办 ,参加者可获国家级 I类继续教育学分 10分 , 并颁发论文证书。会议期间将邀请国内知名医 、药学专家作专题讲座。现
将会议的有关事宜通知如下。
1　会议内容
1. 1　专题讲座　①“抗心力衰竭药物的临床应用研究进展”,曾繁典教授(中国药理学会副理事长 、《医药导报》杂志主编 、
华中科技大学同济医学院临床药理学专家 、博士生导师);②“新药的临床合理应用”, 杜冠华教授 (中国药理学会秘书长 、
中国医学科学院药物研究所副所长 、国家药物筛选中心主任 、《医药导报》杂志副主编 、博士生导师);③“药物不良反应监
测与基础研究”,李学军教授(中国药理学会副秘书长 、常务理事 , 北京大学基础医学院副院长 、药理学系主任 、博士生导
师);④“代谢性药物相互作用”, 曾苏教授(浙江大学药学院常务副院长 、博士生导师);⑤“调血脂药物的临床应用研究进
展”,陈汇教授(中国药理学会临床药理专业委员会委员 、湖北省药理学会副理事长 、华中科技大学同济医学院药理学系副
主任 、硕士生导师);⑥“抗高血压药物的临床应用研究进展”, 龚培力教授(华中科技大学同济医学院硕士生导师);⑦“维
吾尔药物的发展历史与现状”, 顾政一研究员(新疆维吾尔自治区药物研究所所长)。
1. 2　大会论文交流
1. 3　考试并颁发结业证书
2　征文内容与要求
征文内容:①抗肿瘤药物研究进展及其给药方法与合理利用;②生物制品的开发与研究进展;③疫苗的流通管理与
合理使用;④抗病毒药物研究进展与合理使用;⑤中药 、天然药物的研究 、筛选与应用;⑥心脑血管药物的研究与开发进
展;⑦新上市抗生素的应用与疗效评价;⑧其他有关药学的热点问题等均在本次征文的范围内。
征文要求:未公开发表的论文均可作为本次征文稿件 ,来稿全文请控制在 4 000字以内(书写格式请参照《医药导报》
2006年第 1期第 IV页投稿须知),综述不超过 5 000字。论文截止日期:2006年 4月 30日 ,论文请邮寄至《医药导报》编辑
部 ,或发电子邮件 , 并请注明 “会议征文”字样 ,来稿一律不退 , 请自留底稿。
3　说明
征文经筛选后可作为大会交流材料 ,经大会学术组研究同意后 , 优秀论文可作为大会报告并由作者本人在大会上宣
读 ,请报告者预先制作 Powe rpoint课件并按时与会。会期预计 5天。大会交流论文经相关专业专家审阅通过后 , 均可在《医
药导报》杂志(中国药理学会主办 , 国家科技部中国科技论文统计源期刊 、中国科技核心期刊)正刊或增刊上发表。请有意
参加会议的代表或单位及时与《医药导报》编辑部联系 , 以便邮寄会议正式通知。地址:武汉市航空路 1号《医药导报》杂
志社;邮政编码:430030;电话:027 - 83643083, 83666619;E -m ail:y198203@public. wh. hb. cn。
会议详细报到时间 、地点另行通知。
中国药理学会　《医药导报》杂志社
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