全 文 ：江苏农业学报(Jiang su J. of Ag r. Sci. ), 2006, 22(2):113～ 116
海蓬子盐胁迫初期抑制消减杂交 cDNA文库的构建
张大栋 1, 2 , 　马鸿翔1 , 　吉晓佳 2 , 　周春霖 3 , 　王茂文3 , 　汤日圣 1 , 　杨永华2
(1. 江苏省农业科学院农业遗传生理研究所暨江苏省农业生物学重点实验室 , 江苏 南京 210014;2. 南京大学医药生物技术
国家重点实验室 , 江苏 南京 210093;3. 江苏沿海地区农业科学研究所 ,江苏 盐城 224002)
收稿日期:2005-07-25
基金项目:江苏省自然科学基金 (BK2003201);江苏省农业科学院
基金(6110530)
作者简介:张大栋 (1976-), 男 ,江苏徐州人 ,博士研究生, 助理研究
员 ,主要从事植物分子生物学研究。
　　摘要:　为提高缩叶肉质盐生植物海蓬子总 RNA和 mRNA的质量 , 将改良 CTAB法与 T ripure试剂盒方法相结
合 , 从 300 mg海蓬子发芽后 20 d的幼苗中成功分离和纯化了高纯度的总 RNA和 mRNA。并以无 NaC l处理为
D rive r, 以 200 mm ol /L N aC l处理 24 h、48 h、72 h的幼苗为 Teste r, 通过 cDNA双链的合成及两次 PCR扩增 , 富集到
两组处理中差异表达的大小在 200 ～ 1 300 bp的 cDNA序列 , pGEM-T的连接和蓝白斑筛选表明杂交文库滴度和重
组率分别达到 2. 6×107和 96%, 共收集阳性克隆 12 000个 , 形成了抑制消减杂交的质粒 cDNA文库。随机挑取酶
切质粒的电泳分析表明 ,载体中均有插入片段。两种 RNA提取方法的结合有效提高了多汁多色素海蓬子 RNA的
质量 , 高效抑制消减杂交文库的建立为进一步分析基因的差异表达及分离抗盐基因奠定了基础。
关键词:　盐生植物海蓬子;抑制消减抑制杂交; cDNA文库; RNA分离
中图分类号:　Q785　　　文献标识码:　A　　　文章编号:　1000-4440(2006)02-0113-04
Construction of cDNA L ibrary of Salicornia bigelovii Torr. during Early
Stage of Salt Stress Based on Suppression SubtractiveHybrid ization
ZHANGDa-dong1, 2 , 　MAHong-xiang1 , 　 JIX iao-jia2 , 　ZHOU Chun-lin3 , 　WANGM ao-wen3 , 　TANG
Ri-sheng1 , 　YANG Yong-hua2
(1. In stitu te of Ag rob iolog ica lGen etics and Physiology, J iangsu Acad em y of Agricu ltura l S ciences, Nanjing 210014, Ch ina; 2.S ta te Key Labora tory of
Pharm aceut ica lB iotechno logy, Co llege of Life S cience, Nan jingUn iversity , Nan jing 210093, Ch ina;3. In stitu te o fAg ricu ltura lS ciences in Coasta lD istrict
o fJ iangsu, Yan chen 224002, Ch ina)
　　Abstrac t:　 Pu re to ta l RNA and mRNA w ere successfu lly iso lated from succulen t ha lophy te, Salicornia bigelov ii
To rr. , using a com bin ingm e thod o fm odified CTAB and comm ercia l k it(Roche). Fo llow ing the synthesis of double cD-
NA, suppression subtrac tive hybrid ization (SSH) was carried out w ith the m ixed cDNA from 20-day-o ld seedlings treated
w ith 200 mm o l /L NaC l fo r 24 h, 48 h, and 72 h as ‘Teste r’ and those trea ted w ithout NaC l as ‘D rive r’ . Then a series o f
diffe rentia l cDNAs sized from 200 to 1 300 bp w ere pow erfully enriched. The linkage o f cDNA w ith pGEM-T vecto r and
wh ite-blue screening indica ted that the con tent o f lib rary c lone s and recomb inant ra te reached 2.6 ×107 and 96% respec-
tive ly. The EcoRⅠ digested of random recombinan t plastids showed tha t each had been inse rted by cDNA sequences. H igh
e fficient construc tion o f SSH cDNA lib rary paved thew ay fo r gene expression analysis and d iscovery o f new gene s contribu-
ting to salt to le rance.
K ey words:　halophy te; suppre ssion sub trac tive hybridiza tion; cDNA library;RNA iso la tion
　　植物为适应盐渍 、干旱等非生物胁迫会发生复 杂的生理生化变化 ,包括调节细胞的渗透和离子平
衡以增加对水分的吸收;同时通过增加保护酶类如
超氧化物歧化酶 、过氧化氢酶等的表达以清除有毒
物质 [ 1] ,这些变化都受到基因表达水平的调控。另
一方面 ,植物的耐盐性是由多基因控制的数量性状 ,
其多基因遗传和复杂的信号转导使培育真正的抗盐
113
作物一直较为困难 [ 2, 3] 。不同于作物类甜土植物的
天然盐生植物在长期的进化过程中形成了对土壤盐
分的高度适应 ,可以在甜土植物无法生长的高盐土
壤中正常生长发育 ,因此研究盐生植物盐胁迫下基
因表达差异有利于进一步揭示植物在分子水平的抗
盐机制 。海蓬子作为典型的盐生植物 ,其最适生长
环境的盐分高达 200mmo l /L N aC l,在此浓度下其
各项生物学指标如分枝数 、株高 、种子数等均达到最
大值[ 4] 。
抑制消减杂交 (Suppression sub tractive hybridiza-
tion , SSH)技术是以抑制 PCR为基础的 DNA扣除杂
交方法 ,其标准化步骤使 TESTER cDNA单链的丰度
进一步均等化 ,因此能使检测子和驱动子之间不同的
序列得到最有效地扩增 ,成为研究不同环境下基因表
达差异最有效的方法[ 5] 。另外 , 缩叶肉质植物的
RNA提取和纯化一直比较困难 ,而 RNA的质量是抑
制消减杂交技术也是其它一些分子生物学技术的关
键步骤[ 6] 。本研究试图将改良 CTAB法与 Tripure试
剂盒方法相结合 ,提取和纯化较高质量的海蓬子总
RNA和 mRNA , 并在此基础上 ,进一步构建其盐胁迫
初期的抑制消减杂交 cDNA文库 ,以期为其后的基因
差异表达分析及相关基因克隆打下基础 。
1　材料与方法
1.1　材料与处理
试验所用海蓬子种子 , 由江苏省农业科学院沿
海地区农科所土壤肥料研究室提供。海蓬子种子在
直径 9 cm培养皿中经 Hog lang培养液培养 20 d后 ,
用 200mmo l /L N aC l分别处理 24 h, 48 h和 72 h后
收集整株海蓬子幼苗 ,液氮处理 2m in后 - 80 ℃保
存 ,用作 Tester材料;以无 N aC l处理的清水对照海
蓬子幼苗为 D rive r。每一时间处理的材料各取
300mg鲜重组织。
1.2　总 RNA提取与 mRNA分离 、纯化
在 Tripure (Roche)试剂盒的提取液中加入终
浓度为 1%的 PVP和 1%的 β-巯基乙醇 (生兴公司
产品), 将 300 mg海蓬子整株幼苗经液氮研磨后置
于 65 ℃下 20m in, 然后再按 Tripu re的方法完成提
取总 RNA的剩余步骤 。按 Po lyATtrac tmRNA Iso la-
tion SystemⅢ (Prom ega)试剂盒操作方法从总 RNA
中分离 、纯化 mRNA , 电泳检测总 RNA质量 ,紫外
分光光度计分析 mRNA样品的浓度 、纯度与完整
性。将 mRNA的终浓度调整到 0.5 μg /μl, 3个时
间处理样品的 mRNA经等量混合后用于抑制消减
杂交 。
1.3　抑制消减杂交与 cDNA文库构建
cDNA第一链和第二链的合成及抑制消减杂交
具体操作依照 C lontech试剂盒 PCR-S lect TM c DNA
Sub traction K it进行 , Tester双链 cDNA经 Q IA quick
PCR Purification K it(Q IAGEN)纯化和 R sa Ⅰ消化后
分成两部分 ,并分别连接粘端接头 1和接头 2。
接头 1:5′-CTAATACGACTCACTATAGGGCTC-
GAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3′
　　 　3′-GGCCCGTCCA-5′
接头 2:5′-CTAATACGACTCACTATAGGGCA-
GCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3′
　　　3′-GCCGGCTCCA-5′
两份 Tester再分别与经 R sa Ⅰ消化后双链
D river cDNA进行杂交。杂交产物混合后进行两次
PCR扩增 ,第一次 PCR扩增引物为:5′-CTAATAC-
GACTCACTATAGGGC-3′;第二次扩增引物为:5′-T-
CGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3′和 5′-AGCGTG-
GTCGCGGCCGAGGT-3′。反应体系均为 24μl。
为了提高载体连接效率 ,消减杂交产物按 Q IA-
GEN PCR纯化试剂盒的方法进一步纯化 , 产物经
纯化浓缩后与 pGEM-T(Promega)载体连接 , 形成质
粒文库。
1.4　重组文库的滴度和酶切鉴定
将连接后载体的电转化宿主菌在 37 ℃下培养
20m in,加入 5m l融化的 LB M/ gSO4琼脂 ,混匀后倒
入 37 ℃预热的 LB M/ gSO4平板上 , 冷却 10m in,
37 ℃培养12 h,计数噬菌斑和滴度。取 2 m l融化的
上层琼脂 ,依次加入 50 μl IPTG /X-ga l贮存液 ,计数
蓝 、白斑 ,计算重组效率 。
滴度 (pfu /m l)=噬菌斑数 ×稀释因子 ×[ 1 000 /稀
释的噬菌体铺板体积 (μl)]
重组效率 =白斑数 /(白斑数 +蓝斑数)
从文库中随机挑 8克隆 ,碱裂解法提取质粒 ,以
EcoRⅠ酶 、0.8%聚丙烯酰胺凝胶电泳观察插入片段
效率 。
2　结果与分析
2.1　总 RNA和 mRNA分离
　　海蓬子为典型的缩叶肉质植物 ,幼苗中水分 、多
114 江 苏 农 业 学 报 　2006年 第 22 卷 第 2期
糖和色素较多[ 4] ,造成了总 RNA分离的困难 ,在单
独使用 Tripure(Roche)试剂盒的几次提取中 ,总
RNA的质量均达不到下一步试验的要求。而高纯
度的总 RNA是开展 SSH试验和其它植物分子生物
学试验的前体和基础。为此 ,在本试验中 , 我们在
Tripure试剂盒提取液中分别加入了终浓度为 1%的
PVP和 β-巯基乙醇。同时为了能系统全面地了解
差异基因表达的情况 ,试验材料选用 Hog land培养
的海蓬子整株幼苗 , 且来自 NaC l处理后的 24 h、
48 h和72 h。
0.8%琼脂糖电泳结果均显示有 23S和 18S带
(图 1), 特别是 A260 /A280吸收值在 1.8 OD与
2.1OD之间 ,表明几乎没有蛋白质及其它杂质的污
染 ,相对于单独使用 T ripure试剂盒和改良 CTAT
法 [ 7] 提取的 海蓬 子总 RNA 的 A260 /A280 为
1.06OD和 1.12 OD ,其纯度都有显著提高 ,且完全
满足 SSH试验的要求 , RNA总提取率也达到了 1 g
鲜组织 1.2 ～ 1.6mg。 Tripure为商用综合性提取试
剂盒 ,其不仅用于植物也可广泛应用于动物和细胞
组织的 RNA提取 ,而相比之下植物组织中含有较多
的色素或胶质化物质 ,为分离纯度较高的总 RNA的
带来了困难。 PVP和 β-巯基乙醇常用于 CTAB法
的植物总 RNA的提取 ,其可以与多数色素类物质或
含芳香环羟基的蛋白结合形成复合物 ,从而在分离
过程中尽量去除 [ 6] ,本试验结果也进一步表明将
Tripure与 PVP及 β-巯基乙醇结合使用可显著提高
RNA的纯度和提取率 。 Po ly (A)+RNA的 A260 /
A280也均在 1.85 OD以上 ,提取总量均在 1 μg以
上 。该方法是否适用于其它植物特别是多汁植物的
RNA分离值得进一步验证 。
1. 为对照; 2 ～ 4分别为 200 m ol /L N aC l处理后 72 h, 48 h, 和
24 hRNA。
Lan es:1, C on trol;2— 4, RNA after treatm entsw ith 200 m ol /L N aC l
for 72 h, 48 h and 24 h respectively.
图 1　海蓬子总 RNA分离的电泳图
F ig. 1　E lectrophoresis o f tota l RNA iso la ted from Sa licornia
b igelovii Torr.
2.2　差减 cDNA文库克隆和鉴定
　　来自200mmo l /L N aC l处理后 3个不同时间处
理的 mRNA经等量混匀后反转录形成双链 Tester
cDNA ,由无 NaC l处理的 mRNA反转录合成 D river
cDNA ,并用 R saⅠ进行单一酶切用于抑制消减杂
交 ,为了提高 SSH杂交的效率和真实度 , 试验中又
用 Q IAqu ick PCR Purification K it(Q IAGEN)对 cDNA
进行了进一步纯化 , 0.8%琼脂糖凝胶电泳(图 2)显
示 ,其 cDNA长度为 500 ～ 2 500 bp ,酶切产物长度
范围也较广 ,为 100 ～ 2 000 bp,满足了构建 SSH杂
交和 cDNA文库对双链 cDNA的要求 。由酶切 cD-
NA进行抑制消减杂交 ,杂交产物经特异性引物进
行两轮 PCR扩增 ,形成均一化的差减 cDNA序列。
PCR差减产物的电泳结果表明其大小在 200 bp与
1 200 bp之间 (图 3)。
1:标准 DNA;2和 4:Tester和 Driver cDNA;3和 5:Tester和
Driver cDNA R saⅠ酶切产物。
1:M arker;2 and 4:cDNA ofTester andD river;3 and 5:Rsa Ⅰ d i-
ges tion of the tw o cDNAs.
图 2　D river和 Tester cDNA及其 Rsa Ⅰ酶切产物电泳鉴定图
F ig. 2　Electrophoresis of D river and Tester cDNA and theirRsa
Ⅰ digestion products
　　经差减的 cDNA文库与 pGEM-T(Promega)载体
连接 ,并电转化感受态细胞 DH10B。将培养细胞涂
于含 Amp的 LB /X-ga l /IPTG培养基上筛选 , 挑取白
色阳性克隆共 12 000个 ,建立了质粒 cDNA文库 。
滴度试验结果表明 ,本试验构建的 cDNA文库
的滴度为 2.6×107 pfu /m l;经蓝白斑筛选测定结果
显示 ,文库的重组率约为 96%。
随机挑选了 8个克隆进行 Eco RⅠ酶切鉴定 ,结
果表明 ,每个质粒均有插入片段 ,大小在 300 bp与
800 bp之间(图 4)。说明通过 SSH技术已成功分离
了两组材料中差异表达的基因序列。
　　为适应长期的高盐环境 ,海蓬子在外部形态上
115张大栋等:海蓬子盐胁迫初期抑制消减杂交 cDNA文库的构建
1和 3:标准 DNA1和 2;2:两轮 PCR产物。
1 and 3:M arker 1 and 2;2:Products by tw o-round PCR am p lif ica-
t ion.
图 3　差减产物套式 PCR鉴定电泳图
F ig. 3　E lectrophoresis ana lys is of PCR products from suppres-
sion sub traction hybrid ization
M:标准 DNA;1～ 8:质粒中插入的 DNA片段。
M:M ark er;1— 8:DNA sequences in serted in recomb inant p last ids.
图 4　重组质粒的 Eco R Ⅰ酶切签定
F ig. 4　 Electrophoresis of Eco R Ⅰ d igestion o f recomb inant
plastids
形成了缩叶肉质 (Succulence)的特异结构;在细胞
和遗传水平上同其它植物的抗盐机制类似 ,通过清
除活性氧 、平衡离子和渗透作用来实现抗盐作用 ,但
在抗盐能力上与甜土植物的巨大差异可能只表现在
细微的遗传差异之上 [ 8] 。
　　 Ji等的研究结果表明 , SSH 不但能分离出在
Teste r中表达而在 D river中不表达的基因 ,还能分
离出在 Teste r中表达是 Drive r中表达 5倍以上的差
异表达的基因 [ 9] 。 1次 SSH反应可以同时分离出成
百个差异表达的基因 ,这一优点也使 SSH远胜于其
它差异表达基因的克隆技术 。 SSH虽然建立的时间
不长 ,但已经在医学 、微生物学等方面得到广泛和成
功地应用。本试验在建立了更为有效的海蓬子
RNA分离方法的基础上 ,将该技术用于海蓬子适应
高盐环境的基因差异表达分析 , 成功构建了其质粒
文库 ,对海蓬子幼苗胁迫初期 (<72 h)的整株幼苗
进行基因表达差异的分析有利于进一步揭示其适应
高盐环境的分子机制 ,因而本试验结果为其后的基
因表达谱分析及相关基因克隆打下了基础。
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