全 文 ：植物生态学报 2008, 32 (4) 932~937
Journal of Plant Ecology (Chinese Version)

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收稿日期: 2007-08-19 接受日期: 2007-10-12
基金项目: 国家自然科学基金资助项目(30571471)和江苏省自然科学基金重点资助项目(BK2004217)
* 通讯作者 Author for correspondence E-mail: xqwu@njfu.edu.cn
黑松菌根共生体中真菌液泡形态构架及其活力
郑 玲 吴小芹*
(南京林业大学森林资源与环境学院, 南京 210037)
摘 要 为探讨菌根共生体中菌根菌液泡结构及其活力变化对宿主生长的影响, 对3种外生菌根菌黄色须腹菌
(Rhizopogen luteous, 简称Rl)、彩色豆马勃(Pisolithus tinctorius, 简称 Pt2)、美味牛肝菌 (Boletus edulis, 简称Be)
离体菌丝及与黑松(Pinus thunbergii)形成菌根共生体的冰冻切片进行6-羧基二乙酸荧光素(6-CFDA)染色, 观察了
真菌液泡形态构架及其活力的变化。结果表明, 在Pt2与Rl离体菌丝中既可见单个分散的大液泡, 又可见相邻液泡
间由细管状连接而成的管状液泡系统, Be离体菌丝的液泡则呈细小颗粒状, 密集分布于菌丝体的各个部分; Be离
体菌丝的活性强于Pt2和Rl。上述3种菌根菌与黑松形成菌根共生体后, Pt2与Rl对黑松的促生效果好于Be, 菌根共生
体中菌套和哈氏网菌丝的活性明显强于Be, 且仍可见数个液泡连接成管状系统; 而在Be菌根中菌丝液泡系统不形
成管状, 活性较低。结果暗示, 菌根共生体中真菌的管状液泡系统及其活力与对黑松的促生作用似存在一定的相
关性。该研究对于进一步了解菌根的促生作用机理及菌根真菌与宿主植物的协同进化具有一定的意义。
关键词 黑松 外生菌根 管状液泡 菌丝活力 6-羧基二乙酸荧光素
MORPHOLOGY AND ACTIVITY OF ECTOMYCORRHIZAL FUNGI IN VITRO
AND IN SYMBIONT WITH PINUS THUNBERGII
ZHENG Ling and WU Xiao-Qin*
College of Forest Resources and Environment, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China
Abstract Aims The fungal vacuole plays a key role in nutrient transportation and storage, especially
in ectomycorrhizal symbionts. Our objective was to explore the effects of fungal activity and vacuole
structure changes on host plant growth to further understand the mechanism of growth-promotion of
mycorrhizal fungi and coevolution between host plant and mycorrhizal fungi.
Methods Hyphae of ectomycorrhizal fungi Rhizopogen luteous (Rl), Pisolithus tinctorius (Pt2), and
Boletus edulis (Be) cultured in vitro were stained with 6-CFDA, and the morphologies of fungal
vacuoles and their activities were examined. Frozen sections of the ectomycorrhizal symbiont formed
by the three fungi and Pinus thunbergii seedlings were stained and observed in the same way.
Important findings Dispersive large vacuoles in hyphae of Pt2 and Rl and many small dense vacuoles
in the hyphae of Be were observed in fungi cultured in vitro, and some vacuoles of Rl and Be linked
into tubular vacuole systems. The activity of Be hyphae was higher than Pt2 and Rl, and Be grew faster
than the other two. After ectomycorrhizal formation, P. thunbergii seedlings with Pt2 or Rl grew better
than those with Be, and the fungal activities vacuole morphologies had changed greatly. Hyphae in
mantles and Hartig nets of ectomycorrhiza formed by Pt2 and Rl showed higher activities than those
formed by Be, which were hard to label, and tubular vacuole systems were observed sometimes in the
hyphae of Hartig nets of Pt2 and Rl symbionts. It appears that fungal activity and tubular vacuole
systems are related to the growth of P. thunbergii seedlings.
Key words Pinus thunbergii, ectomycorrhiza, tubular vacuole systems, fungal activity, 6-CFDA
DOI: 10.3773/j.issn.1005-264x.2008.04.023
菌根真菌是大多数林木生长不可缺少的共生 菌, 它们从土壤中吸取水分和矿质养分转运给植

4 期 郑玲等: 黑松菌根共生体中真菌液泡形态构架及其活力 DOI: 10.3773/j.issn.1005-264x.2008.04.023 933
物利用, 同时从植物体获取碳水化合物以维持自
身生长。在自然土壤中, 林木的外生菌根一般具
有明显的包裹营养根的菌套、在根内皮层细胞间
生长扩展的哈氏网以及向土壤中生长蔓延的外延
菌丝甚至菌索。土壤外延菌丝(菌索)-菌套-哈氏
网-根形成一个完整的共生体营养吸收、转运和交
换的系统, 菌套、哈氏网则是土壤与真菌、真菌
与寄主植物进行营养交换的直接和最终界面
(Ostonen & Lõhmus, 2003)。
在外生菌根中, 菌套被认为是营养元素的储
藏室。Kottke等(1998)对冷杉(Picea abies)的几种
菌根共生体采用二乙酸荧光素(FDA)荧光染色和
电子能量消失谱(EELS)研究发现 , 冷杉-褐绒牛
肝菌(Xerocomus badius)菌根共生体的菌套活性
较高, 且含有较多数量的P、N、K、Mg、Fe、Zn
等营养元素, 经定位观察可知N、P主要位于菌套
菌丝的液泡中。在菌根真菌的菌丝细胞中, 液泡
作为分解和储藏物质的功能细胞器, 在分解、转
运和吸收从植物中获得的有机物过程中, 无疑起
着重要作用。研究发现, 丝状真菌的液泡不只是
简单的球形结构 , 有时会形成复杂的管状系统
(Kuga-Uetake et al., 2002)。外生菌根共生体中的
管状液泡系统可能在养分的长距离运输中发挥着
重要作用(Cole et al.,1998; Saito et al.,2004)。本文
通过研究 3 种外生菌根菌及其与黑松 (Pinus
thunbergii)形成菌根后真菌液泡形态构架及其活
力状况 , 试图寻找液泡系统与菌根促进黑松生
长关系的可能证据 , 这有助于了解菌根共生体
之间营养物质交换、运输的机理及其代谢结构特
征。
1 材料与方法
1.1 供试外生菌根真菌及其培养方法
供 试 外 生 菌 根 真 菌 : 1) 黄 色 须 腹 菌
(Rhizopogen luteous, 简称 Rl); 2) 彩色豆马勃
(Pisolithus tinctorius, 简称 Pt2); 3)美味牛肝菌
(Boletus edulis, 简称Be)。采用常规平皿插片培养
法将3种菌根菌置于25 ℃温箱中培养一周待用 ,
并观测菌根菌生长速度。
1.2 黑松菌根苗的培育及其生长量的测定
供试树种为黑松。从江苏镇江句容林场松林
中采集土壤, 分装入营养杯, 分别将3种外生菌根
菌Rl、Pt2和Be对黑松幼苗(播种后20 d左右)进行
截根菌根化接种后植入营养杯, 每处理20株苗。
所有试验苗进行统一的光照和浇水管理。
14个月后对黑松苗高、地径等生长指标进行
测定分析, 试验苗待用。
1.3 荧光染料及其配制方法
6-羧基二乙酸荧光素(简称6-CFDA)购自美国
Sigma公司, 置于-20 ℃冰箱保存。使用前配制20
μg•ml-1的6-CFDA水溶液, 置室温充分溶解后待
用(Hyde & Ashford, 1997)。
1.4 菌根真菌离体菌丝染色及其显微观察
选取长有菌根菌菌丝的盖玻片10片 , 以20
μg•ml-1的6-CFDA水溶液在黑暗中染色30 min,
用水冲洗3~5次后在Leica DMLB2荧光显微镜下
观察液泡系统的形态, 照相, 并计算管状液泡出
现的比例。(每个盖玻片按对角线取5个视野观察,
每菌共观察50个视野)
1.5 黑松新鲜菌根冰冻切片的制作及其荧光显
微观察
每处理随机选取生长处于平均水平的黑松菌
根苗3株 , 不同菌根苗各截取菌根根段10个 , 用
Leica CM1900冰冻切片机进行切片。切片厚度10
μm, 每处理200个切片。将冰冻切片立即于黑暗
中用20 μg•ml-1的6-CFDA染色30 min, 用水冲洗
3~5次后在Leica DMLB2荧光显微镜下观察菌根
共生体中液泡系统结构的差异, 并照相。根据观
察结果统计管状液泡出现的比例。
1.6 数据统计分析
对黑松生长量的测定值用SPSS软件进行统
计分析和LSD多重比较检验 , 显著性水平为α=
0.05。
2 结果与分析
2.1 3种外生菌根菌离体生长及活性和液泡形态
构架
在人工培养条件下, Be生长较快, 属快生型
菌根菌 ; 而Pt2和Rl生长缓慢 , 属慢生型菌根菌
(表1)。6-CFDA可检测细胞膜完整性和细胞活性,
被所标记体发出荧光的强弱可间接反应其活性的
大小; 3种菌根菌菌丝经6-CFDA染色后, 均可发
出较明亮的荧光 , 但Be发出的荧光似乎要强于
Pt2与Rl (图1, 表1), 说明3种菌根真菌在离体培
养条件下虽均具有较高的活性, 但Be菌丝的活性
要强于Pt2与Rl。由此可见, 在离体条件下菌根真

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菌菌丝的生长速率与其活性有较大关系, 生长快
则活性强, 生长较慢则活性较弱。
3种外生菌根菌离体培养的菌丝经荧光染色
后, 所观察到液泡的分布构架有所变化。Pt2与Rl
菌丝中液泡较大 , 除单个球形或近球形液泡外 ,
还可见相邻液泡间有细管状连接而成为管状液泡
系统(图1A~B和图1C~D), 其中Pt2菌丝中可见管
状液泡的比例较高 , 占所观察菌丝的32%; Rl菌
丝中管状液泡的比例较低, 占20%。荧光染色后,
Be菌丝的液泡呈细小颗粒状, 密集分布于菌丝体
的各个部分(图1E~F), 未观察到明显的管状液泡
结构(表1)。


表1 3种外生菌根菌离体菌丝生长速度及其活性与管状液泡丰度
Table 1 The growth rate and activity of three ectomycorrhizal fungi and abundance of tubular vacuole
管状液泡分布 Distribution of tubular vacuole 菌根菌
Fungi
离体菌丝生长速率
Growth rate of
hyphae
荧光强度
Fluorescence
intensity
菌丝活性
Hyphae
activity 观察玻片数
Number of total
slides observed
观察视野数
Number of total
visions observed
可见管状液泡视野比例
Percentage of tubular
vacuole
Rl 慢 Slow 弱 Weak ++ 10 50 20
Pt2 慢 Slow 弱 Weak ++ 10 50 32
Be 快 Fast 强 Strong +++ 10 50 0
“+++”: 菌丝活性极强 Extremely strong activity of hyphae “++”: 菌丝活性较强 Strong activity of hyphae “+”菌丝活性较
弱 Weak activity of hyphae Rl: 黄色须腹菌Rhizopogen luteous Pt2: 彩色豆马勃Pisolithus tinctorius Be: 美味牛肝菌Boletus edulis






图1 3种外生菌根菌离体培养菌丝6-CFDA荧光染色后液泡的形态结构
Fig. 1 The morphologies and structures of the three ectomycorrhizal fungi hyphae by 6-CFDA staining
A、B示Pt2菌丝; C、D示Rl菌丝; E、F示Be菌丝 A, B for Pt2 hyphae; C, D for Rl hyphae; E, F for Be hyphae 箭头示管状液泡系统
The arrows show the tubular vacuole systems 比例尺 Scale bars: 10 μm Pt2、Rl、Be: 同表1 See Table 1


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2.2 3种外生菌根菌对黑松生长的影响
接种不同菌根菌14个月后, 黑松苗生长表现
均有所差异。其中, Rl菌根苗生长最好, Pt2略次之,
Be相对较差。Rl菌根苗其平均苗高为8.03 cm, 与
Pt2和Be有显著差异; 就地径而言, Rl菌根苗可达
2.55 mm, 与Pt2无显著差异, 其二者与Be的差异
均达显著水平(图2)。
2.3 黑松菌根共生体中菌根菌液泡形态构架
将接种了3种不同菌根真菌的黑松菌根根段
进行活体冰冻切片并经6-CFDA染色后观察发现,
各处理液泡系统的形态结构有一定程度的差异 ,
且与离体菌丝液泡系统也有所不同。
Pt2菌根的菌套和哈氏网菌丝中的液泡呈小
颗粒状 , 且密集分布; 同时 , 在哈氏网菌丝中还
可见液泡连接成管状系统包围着根部皮层细胞
(图2 A, 图2B); 在所检测的切片中, 有1/4的切片
可观察到管状液泡系统的存在(表2)。Rl菌根液泡
也密集呈细小颗粒状, 哈氏网菌丝中也可见液泡
连接成管状系统包围着根部皮层细胞(图2 C, 图
2D), 但管状结构没有Pt2菌根发达 , 可观察到管
状液泡的切片比例只有15%(表2)。Be菌根中菌丝
的液泡能被荧光标记的比Pt2和Rl都要少, 不形成
管状液泡, 只有较少细小颗粒状的液泡包裹着根
部皮层细胞(图2E, 图2F)。结合黑松的苗高和地
径生长量来看 , 在生长较好的Pt2和Rl菌根苗中 ,
其哈氏网中存在较多密集细小颗粒状的液泡和管
状液泡, 可能有助于菌根共生体养分的运输和交
换, 从而促进黑松的生长。



图2 3种外生菌根菌对黑松苗木生长量的影响
Fig. 2 The effect of different ectomycorrhizal fungi on the growth of Pinus thunbergii seedings
同一图表中不同小写字母表示其二者差异达到显著水平(p<0.05) Significant difference ws indicated by different letters in the same
figure (p<0.05) Rl、Pt2、Be: 同表1 See Table 1



表2 黑松外生菌根共生体中真菌活性及管状液泡丰度
Table 2 The activity of fungi and abundance of tubular vacuole in the ectomycorrhizal symbiont of Pinus thunbergii
Pt2、Rl、Be、hyphae activity: 同表1 See Table 1


2.4 黑松菌根共生体中菌套、哈氏网菌丝活性的
差异及其与黑松生长的关系
由 前 文 所 知 , 可 标 记 真 菌 液 泡 系 统 的
6-CFDA染料可检测真菌细胞膜的完整性和细胞
活性, 因此, 本试验中冰冻切片能否被6-CFDA标
记而发出绿色荧光及其荧光强度也可在一定程度
管状液泡分布 Distribution of tubular vacuole 菌根菌
Fungi
荧光强度
Fluorescence
intensity
菌丝活性
Hyphae activity 观察切片总数
Number of total sections
for observation
形成管状液泡的切片数
Number of sections with
tubular vacuole observed
管状液泡所占比例(%)
Percentage of tubular
vacuole
Rl 强 Strong +++ 200 30 15
Pt2 强 Strong +++ 200 50 25
Be 弱 Weak + 200 0 0

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上反映黑松不同菌根共生体中菌根真菌活性的强
弱。
观察发现(表2, 图2), Pt2菌根的菌套和哈氏
网菌丝极其密集, 且均可发出明亮的荧光(图2A,
图2B), 表明Pt2与黑松的共生状态佳 , 其菌丝在
菌根共生体中活性极强, 利于菌根菌促生作用的
发挥。Rl菌根的菌套和哈氏网菌丝也较密集, 也
可发出明亮的荧光(图2C, 图2D), 同样表明Rl与
黑松形成了良好的共生体, 因而促进了黑松的生
长。而Be菌根的菌套及哈氏网菌丝发出的荧光均
极微弱(图2E, 图2F), 表明Be虽也与黑松形成了
较好的菌根共生体, 但其菌丝的活性较弱或只有
少数菌丝有活性, 因而在一定程度上影响了菌根
共生体功能的发挥, 使黑松的生长相对较差。






图3 黑松3种外生菌根冰冻切片经6-CFDA染色结果
Fig. 3 6-CFDA staining of frozen sections of different ectomycorrhiza of Pinus thunbergii
A、B为Pt2菌根; C、D为Rl菌根; E、F为Be菌根。星号示菌套, 箭头示哈氏网 A, BC for Pt2; C, D for Rl; E, F for Be. The stars show
the mantles. The arrows show the Hartig net 比例尺 Scale Bars: 10 μm Pt2、Rl、Be: 同表1 See Table 1



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3 结论与讨论
对3种外生菌根菌Pt2、Rl和Be离体菌丝及其
与黑松形成的菌根进行6-CFDA荧光染色 , 观察
了不同条件下菌根菌生长活性及液泡系统的变
化。在离体培养条件下, 3种菌根菌均可发出较明
亮的绿色荧光, 但Be菌丝的荧光要强于Pt2和Rl。
Be易于人工培养, 其菌丝生长快, 活性强; 而Pt2
与Rl则反之, 人工培养难, 菌丝生长慢, 活性弱。
但在与黑松形成菌根共生体后, 菌根菌的液泡系
统发生了较大的变化。Be菌根菌套和哈氏网菌丝
较难被6-CFDA标记, 表明其菌丝的活力较弱; 而
Pt2与Rl菌根的菌套和哈氏网菌丝活力较强, 且哈
氏网菌丝中还可见液泡连接成管状系统包围着根
部皮层细胞。综合离体和共生两种条件下的结果,
Pt2和Rl在离体培养时生长速率及活性不如Be,
但与黑松形成菌根共生体后活性明显强于Be, 且
对黑松的促生作用明显好于Be, 说明Pt2和Rl在
与寄主黑松协同进化过程中达到了较好的共生状
态, 共生后不仅利于菌根菌自身的生长, 同时也
有利于黑松的生长。同时, 促生效果较好的Pt2与
Rl菌根其菌体细胞中具有较高比例的管状液泡结
构, 管状液泡系统可能在养分的长距离运输中发
挥着重要作用 , 从而更好地促进寄主植物的生
长。
采用6-CFDA对菌根菌液泡系统进行荧光标
记, 观察到分散的液泡之间的管状连接系统, 取
得了较好的标记效果。近年来, 另一种衍生染料
Oregon Green 488 Carboxy-DFFDA已被广泛使用,
使得对液泡系统的标记更灵敏也更稳定(Ashord
& Allaway, 2002 )。外生菌根真菌从土壤中吸取矿
质元素 , 储存在液泡中 , 进而转运到植物体 , 因
此液泡是整个转运系统的起点。钱晓鸣等(2001)
用 电 子 能 量 消 失 谱 法 对 马 尾 松 (Pinus
massoniana)-Pt2菌根菌套细胞内N、P元素进行了
定位测定, 发现该菌根对N、P有较强的吸收和储
存能力, 且N、P明显处于液泡中。关于菌根共生
体的液泡系统在营养转运过程中所起的作用及其
作用方式还有待进一步研究, 以期较全面地了解
菌根共生体对寄主植物的促生作用机理。
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责任编委: 李晓林 责任编辑: 李 敏