全 文 ：植物生态学报 2010, 34 (12): 1448–1453 doi: 10.3773/j.issn.1005-264x.2010.12.011
Chinese Journal of Plant Ecology http://www.plant-ecology.com
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收稿日期Received: 2010-01-12 接受日期Accepted: 2010-05-16
* 通讯作者Author for correspondence (E-mail: hqyang@sdau.edu.cn)
NaCl胁迫下平邑甜茶根系线粒体特性和细胞死亡
特征
马怀宇1 吕德国1 杨洪强2*
1沈阳农业大学园艺学院, 沈阳 110161; 2山东农业大学园艺科学与工程学院, 作物生物学国家重点实验室, 山东泰安 271018
摘 要 以平邑甜茶(Malus hupehensis var. pingyiensis)实生幼苗为试验材料, 研究NaCl浇灌后根系线粒体H2O2含量、膜电位
(Δψm)和根系ATP含量的变化以及细胞死亡特征。结果表明, 根系线粒体H2O2含量在0.085 mol·L–1 NaCl处理的第1–6天逐渐降
低, 在第6–15天则快速上升; 线粒体Δψm在0.085 mol·L–1 NaCl处理的15天内一直呈下降趋势, 在第6–15天下降速度明显加快;
根系ATP含量在0.085 mol·L–1 NaCl处理的15天内始终低于对照, 但保持在一个较稳定的范围内。TUNEL原位末端标记试验显
示, 0.085 mol·L–1 NaCl处理的第9天, 根系石蜡组织切片上的阳性反应斑点明显增多, 到第15天时阳性反应斑点密集成片, 表
明细胞核DNA发生了细胞程序性死亡的特征性断裂。根系中细胞程序性死亡关键酶类caspase3/7活性在0.085 mol·L–1 NaCl处
理的第1–6天处于较低水平, 其活性在第6–15天成倍上升。这些结果表明, 0.085 mol·L–1 NaCl处理6–15天能诱导平邑甜茶根细
胞发生程序性死亡, 而且线粒体特性的变化与根系细胞程序性死亡密切相关。
关键词 类caspase3/7, 线粒体, 细胞程序性死亡, 根系, 盐胁迫
Characteristics of mitochondria and cell death in roots of Malus hupehensis var. pingyiensis
under NaCl stress
MA Huai-Yu1, LÜ De-Guo1, and YANG Hong-Qiang2*
1College of Horticulture, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110161, China; and 2College of Horticulture Science and Engineering, Shandong Agri-
cultural University, State Key Laboratory of Crop Biology, Tai’an, Shandong 271018, China
Abstract
Aims Malus hupehensis var. pingyiensis with strong ability for apomixes is unique to China and is tolerant of
waterlogged conditions and salt. There is little difference among its seedlings because of apomixes. Malus hupe-
hensis var. pingyiensis is widely used as stocks of apple cultivars and ornamental apples and has important applied
value in apple production and research. Our objective was to determine the response characteristic of cells and
mitochondria in M. hupehensis var. pingyiensis roots under high saline conditions.
Methods Pot seedlings with at least seven mature leaves were used in this experiment. In order to avoid irre-
versible damage to roots caused by sudden exposure to high level saline condition, we first used a weak saline
solution (0.051 mol·L–1 NaCl) to water seedlings every two days, for a total of three times. Then strong saline so-
lution (0.085 mol·L–1 NaCl) was used to water seedlings. Tap water was used for control seedlings. H2O2 content,
membrane potential of mitochondria (Δψm), ATP content, terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP
nick end labelling (TUNEL) and caspase3/7 activity were determined every two days from the third day of 0.085
mol·L–1 NaCl treatment, altogether five times.
Important findings Δψm of roots declined slowly in the first six days of 0.085 mol·L–1 NaCl treatment and
thereafter declined rapidly. The H2O2 content in mitochondria decreased slowly in the first six days and then ac-
cumulated quickly. ATP content in roots remained constant during the treatment of 0.085 mol·L–1 NaCl, but was
low compared with that in control seedlings. The results of TUNEL assay showed that root paraffin slices dis-
played distinct positive-reaction spots that became more numerous in the root paraffin slice of the ninth day. Cas-
pase3/7 activity was examined with a detection kit; it remained at a low level for the first six days of 0.085
mol·L–1 NaCl treatment, and thereafter increased sharply. Results indicated that programmed cell death could be
induced in roots of M. hupehensis var. pingyiensis by 0.085 mol·L–1 NaCl treatment, and this was closely related
to the change of mitochondrial characteristics.
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Key wards caspase3/7, mitochondria, programmed cell death, roots, saline stress
土壤盐碱化是限制农业生产的一个世界性环
境问题, 它给农业生产造成的损失仅次于干旱。因此,
植物盐碱胁迫一直是农业和生态科学研究中的重要
课题。果树是具有重要农业和生态价值的木本植物,
同样存在盐碱胁迫问题。研究表明, 盐胁迫加速果树
根尖或靠近根尖部分的木栓化程度(Storey & Walker,
1999), 降低果树根系水流导度(hydraulic conductiv-
ity) (杨启良等, 2009)。盐胁迫达到一定程度还会引
起根尖细胞死亡(Katsuhara & Shibasaka, 2000)。
在盐碱等逆境胁迫下, 植物根细胞内会积累大
量的H2O2等活性氧(任红旭等, 2000; 袁琳等, 2005;
Navrot et al., 2007)。近年来的研究表明, 一定浓度
的H2O2可以诱导细胞程序性死亡(programmed cell
death, PCD) (James et al., 2003; 马怀宇和杨洪强,
2006; 任丽梅等, 2009)。根细胞中的H2O2主要来源
于线粒体电子传递链的电子渗漏(Liu et al., 2002;
Jezek & Hlavata, 2005), 因此, 线粒体特性变化在
细胞死亡过程中的作用不容忽视。平邑甜茶(Malus
hupehensis var. pingyiensis)是我国特有的苹果砧木
资源, 耐涝性和耐盐性较强, 具有较强的无融合生
殖能力, 实生苗个体间差异非常小, 是理想的果树
根系研究材料(杨洪强和束怀瑞, 2007)。本研究以盆
栽平邑甜茶幼苗为试验材料, 通过根区浇灌0.085
mol·L–1 NaCl溶液, 研究盐胁迫过程中根系线粒体
特性变化及根细胞死亡特征, 探讨线粒体特性变化
与根细胞死亡的相关性, 以期为从细胞学水平揭示
果树根系耐盐胁迫机理提供依据。
1 材料和方法
1.1 试验材料
平邑甜茶种子层积后播种于营养钵中, 营养钵
基质由等体积的沙、果园表土和锯末混合而成。平
邑甜茶出苗后进行常规管理, 待第7片真叶展开后,
选择长势一致的实生幼苗进行盐胁迫处理。
1.2 盐胁迫处理
为避免土壤盐分剧烈变化对根系造成不可逆
的伤害, 首先用0.051 mol·L–1 NaCl溶液浇灌幼苗,
对照用自来水浇灌, 每隔2天浇1次, 共处理3次; 然
后用0.085 mol·L–1 NaCl溶液浇灌, 对照一直用自来
水浇灌。于0.085 mol·L–1 NaCl处理的第3天开始取
样测定各项指标, 以后每隔2天测定1次, 共测5次。
试验设3次重复, 数据取3次重复的平均值。
1.3 ATP的测定方法
ATP的测定参照王维光(1985)的方法, 用pH 7.8
的甘氨酰-甘氨酸缓冲液提取, 采用生物发光法(荧
光素-荧光素酶法)测定样品中ATP的含量。
1.4 线粒体的提取
线粒体的提取参照杨玖英等(2004)的方法, 略
作修改。剪取平邑甜茶白色幼根, 用清水冲洗干净;
加入缓冲液I (400 mmol·L–1甘露醇, 50 mmol·L–1
Tris-HCl, 10 mmol·L–1 EDTA, 0.1% BSA, 0.05% β-巯
基乙醇, pH 7.4), 冰上研磨成浆; 4 ℃条件下600 × g
离心10 min; 取上清液, 4 ℃条件下10 000 × g离心
10 min; 弃上清液, 沉淀用缓冲液I洗两遍, 放在冰
上待用。线粒体提取过程不超过1 h, 提取的线粒体
在2 h内用完。
1.5 线粒体H2O2含量测定
线粒体H2O2含量测定参照周智波等(2004)的方
法 , 略作修改。分离的线粒体用缓冲液 II (70
mmol·L–1蔗糖 , 20 mmol·L–1 EDTA, 50 mmol·L–1
Tris-HCl, pH 7.4)悬浮, 调整1 mL悬浮液蛋白浓度
为0.5 mg·mL–1, 然后加入外源呼吸底物6 mmol·L–1
琥珀酸(钠盐), 最后加入发光剂10 μmol·L–1 luminal
(鲁米诺) + 10 μg·mL–1 HRP(辣根过氧化物酶)启动
发光反应, 在超微弱发光仪(中国科学院生物物理
研究所, 北京)上记录样品发光强度。样品室温度为
37 ℃恒温, 测定时间为50 s, 间隔时间为1 s, 每个
样品测3次, 样品发光强度取3次的平均值(单位为
相对光单位(relative light units, RLUs)) (采用考马斯
亮蓝法测定样品蛋白质含量)。
1.6 线粒体膜电位测定
参照Braidot等(1998)的方法。分离的线粒体用
缓冲液III (250 mmol·L–1蔗糖, 2 mmol·L–1 Hepes, 0.5
mmol·L–1 KH2PO4, 4.2 mmol·L–1琥珀酸钠, pH 7.4)悬
浮 , 调整悬浮液蛋白浓度为0.3 mg·mL–1。加入1
µg·mL–1 Rh123 (罗丹明123)在25 ℃下孵育30 min,
然后用缓冲液III洗3次。在荧光分光光度计上检测
荧光强度 , 激发波长为505 nm, 发射波长为534
nm。每个样品测定3次, 每次间隔5 min, 样品荧光
强度取3次的平均值(单位为相对荧光单位(relative
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fluorescence units, RFUs)) (采用考马斯亮蓝法测定
样品蛋白质含量)。
1.7 Terminal deoxynucleotidyl transferase medi-
ated dUTP nick end labelling (TUNEL)原位检测
常规方法制作根系组织石蜡切片。按照TUNEL
染色试剂盒(Promega, Baton Rouge, USA)提供的步
骤对石蜡切片进行染色。光学显微镜下观察有蓝紫
色颗粒者为阳性反应。
1.8 类caspase3/7蛋白酶活性检测
剪取白色根系提取根系总蛋白, 调整粗提液总
蛋白浓度为0.5 mg·mL–1。按照Caspase-GloTM 3/7
Assay试剂盒(Promega, Baton Rouge, USA)提供的检
测方法测定根系酶活性(单位为相对光单位(relative
light units, RLUs))。
2 结果
2.1 盐胁迫下平邑甜茶根系ATP含量的变化
ATP是细胞生命活动的主要能量物质。在NaCl
胁迫条件下, 平邑甜茶根系ATP含量始终低于对
照。在NaCl处理的前6天, 平邑甜茶根系的ATP含量
呈逐渐增加的趋势; 处理的第6–12天, 根系ATP含
量先降后升, 第9天根系ATP含量降到最低点; 第12
天后根系ATP含量又开始呈下降的趋势(图1)。
2.2 盐胁迫下根系线粒体H2O2含量变化
H2O2不仅是逆境胁迫下植物氧应激反应的产
物, 同时也是一个信号因子(Miller et al., 2008)。在
NaCl处理的前6天中, 线粒体中H2O2的含量略低于
对照, 应该与细胞内的抗氧化酶系统发挥了作用有
关(初期SOD、CAT活性明显升高, 数据未列)。NaCl
处理的第6–9天, 线粒体中H2O2含量急剧上升; 第9
天开始线粒体中H2O2含量增加速度变缓, 第15天线
粒体中H2O2含量高出对照4倍多。这表明, NaCl处理
6天以后根系线粒体中抗氧化系统明显受到抑制
(SOD、CAT活性下降, 数据未列) (图2)。
2.3 盐胁迫下根系线粒体膜电位的变化
线粒体是具有双层膜结构的细胞器, 外、内膜
间的空间称为外室, 由内膜包围的腔称为内室。质
子泵存在于内膜上, 它将内室的质子泵入外室, 从
而形成横跨内膜的线粒体膜电位(Δψm), 质子在返
回时又将能量传递给ADP和Pi, 生成ATP。因此,
Δψm对维持线粒体功能至关重要(Kroemer et al.,
1997)。对线粒体具有特异选择性的荧光探针Rh123

图1 0.085 mol·L–1 NaCl处理后,平邑甜茶根系ATP含量的变化。
Fig. 1 Change of ATP content in Malus hupehensis var. pin-
gyiensis roots after treated with 0.085 mol·L–1 NaCl.

图2 0.085 mol·L–1 NaCl处理后, 平邑甜茶根系线粒体H2O2
含量的变化。
Fig. 2 Change of H2O2 quantity in Malus hupehensis var. pin-
gyiensis roots mitochondria after treated with 0.085 mol·L–1 NaCl.

能够顺着线粒体Δψm进入线粒体基质中, 即Δψm越
高, 进入基质内的荧光探针越多, 检测到的荧光强
度越强; 反之, Δψm下降, 荧光强度也会随之减弱。
在NaCl处理平邑甜茶根系的过程中, 线粒体Δψm随
着处理时间的延长逐渐降低。处理的前6天, Δψm下
降比较缓慢; 第6天后Δψm下降的速度明显加快(图
3)。在NaCl胁迫过程中, 根系线粒体Δψm的改变影
响了电子传递, 进而影响了电子传递链的电子漏。
2.4 盐胁迫下根系细胞核DNA的断裂情况
利用TUNEL原位末端标记法检测NaCl处理后
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图3 0.085 mol·L–1 NaCl处理后, 平邑甜茶根系线粒体膜电
位的变化。RFUs, 相对荧光单位。
Fig. 3 Change of membrane potential of mitochondrial ( ψm△ )
in Malus hupehensis var. pingyiensis roots after treated with
0.085 mol·L–1 NaCl. RFUs, relative fluorescence units.


根细胞核DNA断裂情况。发生程序性死亡的细胞核
DNA断裂后产生具有3′-OH末端的DNA片段, 经
TUNEL染色后形成蓝紫色斑点(Promega, 2009)。本
试验中, NaCl处理后的根系组织切片出现较深的蓝
紫色阳性反应斑点, 而且处理的时间越长阳性反应
斑点越多。在NaCl处理第3和第6天的根组织切片上,
阳性反应斑点与对照相比没有明显的增多, 所以不
能确定是否为盐胁迫诱导产生。第9天切片上的阳
性反应斑点明显增多, 到第15天时切片上的阳性反
应斑点密集成片。表明盐胁迫到一定程度会诱导平
邑甜茶根系中大量细胞发生程序性死亡(图4)。
2.5 盐胁迫下根系类capase3/7活性变化
大量研究表明, 细胞程序性死亡(PCD)是一个
由caspases家族介导的蛋白酶级联反应过程, 其中
caspase3被称为“死亡蛋白酶”, 是动物PCD蛋白酶
级联反应的必经之路, 而caspase7与caspase3功能和
作用底物相同(卢晓晔和钟雪云, 2000; Ferrer &
Planas, 2003)。植物细胞同动物细胞存在相似的PCD
过程, 在其PCD过程中也应存在与类caspase3/7酶
类似的活性。表1显示, 平邑甜茶根系中确存在类
caspase3/7酶活性, 而且在NaCl处理过程中, 其活
性随着处理时间延长而增高。从处理的第9天开始,




图4 0.085 mol·L–1 NaCl处理后, 平邑甜茶根系石蜡切片TUNEL染色(125×)。A, 对照。B, 处理3天。C, 处理6天。D, 处理9
天。E, 处理12天。F, 处理15天。
Fig. 4 TUNEL assay of Malus hupehensis var. pingyiensis root paraffin section after treated with 0.085 mol·L–1 NaCl (125×). A,
Control. B, Treated for 3 days. C, Treated for 6 days. D, Treated for 9 days. E, Treated for 12 days. F, Treated for 15 days.

表1 0.085 mol·L–1 NaCl胁迫下平邑甜茶根系类caspase3/7酶活性的变化(相对光单位) (平均值±标准误差)
Table 1 Change of Caspase3/7 activity in Malus hupehensis var. pingyiensis roots after treated with 0.085 mol·L–1 NaCl (relative
light units) (mean ± SE)
处理时间 Treatment time (d) 对照
Control 3 6 9 12 15
41.52 ± 10.36 45.94 ± 11.48 59.28 ± 10.04 217.33 ± 46.43 368.49 ± 41.32 452.27 ± 49.54

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根系中的类caspase3/7酶活性急剧升高, 在NaCl处
理的第15天, 根系中类caspase3/7酶活性高出对照
十几倍。
3 讨论
有研究者提出, PCD可能是植物抗盐的一种普
遍生理机制, 其主要功能是通过根尖局部细胞的主
动死亡形成一道死细胞屏障(木栓化结构), 阻止盐
离子进入植物体的其他组织(姜丽丽等, 2005)。近年
来对PCD发生机制的研究显示, 线粒体和H2O2在
PCD过程中扮演着重要的角色。Halestrap等(2000)
曾报道,没有线粒体的原生质体不能诱导PCD发生,
而在没有细胞核却有线粒体存在的原生质体中却
能够诱导PCD发生。由于线粒体内膜的高选择透性,
线粒体较少受到外界环境的影响, 但在较严重的胁
迫条件下, 线粒体在能量合成和转换过程中也会受
到影响, 产生氧应激。本试验中, 从NaCl处理平邑
甜茶根系的第6天开始, 根系线粒体中H2O2含量迅
速增加, 与此同时线粒体Δψm明显下降。植物根系
中的活性氧(ROS)主要来源于线粒体, 线粒体态4呼
吸会在呼吸链复合体I和复合体III部位发生单电子
泄漏, 使氧分子接受单电子生成ROS (Chen et al.,
2003; Navrot et al., 2007)。而且线粒体态4呼吸受线
粒体Δψm调控, 线粒体Δψm的下降可以导致线粒体
态4单电子泄露增加(Ichas & Mazat, 1998)。由此看
来, NaCl胁迫下根系线粒体Δψm的下降是导致细胞
中H2O2含量增加的一个主要原因。Liu (1999)证实,
呼吸链生成的过多的ROS反过来又可以引起线粒
体Δψm下降,表现出对线粒体Δψm的负反馈调节作
用。本试验测得的数据亦显示ROS和线粒体Δψm的
变化具有相似的变化节奏。由此推测, 线粒体中增
加的H2O2又反过来促进线粒体Δψm的降低, 即根系
线粒体Δψm的下降和H2O2的增加是互为因果的关
系, 而且二者之间的这种负反馈调节应是细胞内胁
迫信号放大的过程。此外, 也观察到线粒体的电子
传递虽然受到高盐胁迫的影响, 如ATP含量水平整
体低于对照, 但在高盐胁迫过程中根系ATP含量并
没有呈持续降低的趋势, 表明在NaCl诱导根系发生
细胞程序性死亡过程中线粒体并没有受到不可逆
的损伤, 仍维持一定的ATP合成功能。
动物细胞PCD是由一系列特异的半胱氨酸蛋
白酶(caspases)调控的, caspases被激活后, 能够分解
底物蛋白, 导致细胞骨架解体。其中caspase3是连接
PCD信号途径上下游的关键因子(Ferrer & Planas,
2003), 所以被认为是检测PCD的一个指示性指标
(José et al., 2005)。许多试验表明, 植物体内也存在
类caspases蛋白酶(Braidot et al., 1998)。本试验也在
平邑甜茶根系中检测到类caspase3/7活性, 并且在
NaCl处理过程中, 根系类caspase3/7活性的升高与
TUNEL原位检测的阳性反应斑点数量显著增加的
时期相近。表明高盐胁迫能够诱导平邑甜茶根细胞
发生PCD过程。
综上所述, 在NaCl处理过程中 , 根系线粒体
Δψm和H2O2含量的变化大致可以分为两个阶段, 第
一阶段为NaCl处理的第1–6天, H2O2含量和Δψm的
变化幅度都不大; 第二阶段为NaCl处理的第6–15
天, 是H2O2含量急剧升高的阶段, Δψm亦大幅度下
降。在H2O2含量缓慢下降的阶段, TUNEL染色显示
阳性反应斑点数量变化不显著, 类caspase3/7酶活
性亦保持在较低水平, 这说明此时根系中只有少数
细胞发生程序性死亡, 推测是植物正常生长过程中
发生的程序性死亡。在H2O2含量剧烈变化阶段 ,
TUNEL染色显示阳性反应斑点显著增加 , 类
caspase3/7活性急剧升高, 显示根系中有大量细胞
发生程序性死亡。由此看出, 线粒体Δψm和H2O2的
变化与高盐胁迫下根细胞的死亡密切相关。由此推
测, NaCl处理的第6天是根细胞内相关生理生化反
应的一个拐点, 即在线粒体中H2O2积累到一定阈
值, 或是线粒体Δψm下降到一定阈值时, 细胞内才
启动死亡程序, 这亦显示线粒体在诱导根细胞程序
性死亡的过程中起着重要的作用。
致谢 国家自然科学基金(30270923、30571285和
30671452)和高等学校博士学科点专项科研基金
(20050434009)资助。
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特邀编委: 张文浩 责任编辑: 李 敏