全 文 ：番茄多胁迫诱导型 LeMTshsp启动子的分子克隆及其功能分析?
伊淑莹 , 孙爱清 , 赵春梅 , 刘 箭??
( 山东师范大学生命科学学院 , 山东 济南 250014 )
摘要 : 根据 Southern杂交结果 , 选取 KpnⅠ与 EcoRⅠ双酶切番茄中蔬 4 号基因组 DNA , 3 kb左右的酶切片
段连入 pBSⅡKS ( + ) 载体 , 构建成含有线粒体小分子热激蛋白基因 ( LeMTshsp) 上游 2 kb左右调控区的
质粒文库。通过巢式 PCR 方法从构建的质粒文库中克隆出 LeMTshsp基因上游 1915 bp的调控区 ( GenBank
登录号为 AB239774)。该序列含有 TATA box及 CAAT box等启动子基本元件 , 还具有 6 组典型的 HSE 元件
及多个 AT-rich区 , 另外还有许多逆境反应元件如 ABRE , C-repeat— DRE , AP-1。凝胶阻滞结果表明 , 纯化
的 HsfA2 蛋白与 LeMTshsp启动子的 HSE 元件在体外具有结合活性 , 且与近端 5 组 HSE 的结合活性比与远端
HSE 的结合活性强。构建该启动子与 GUS基因的融合载体 , 利用农杆菌介导的叶圆盘法转化番茄 , GUS组
织化学染色结果表明 LeMTshsp启动子对热激、低温、外源 ABA 及重金属胁迫都有应答。
关键词 : 番茄 ; 线粒体小分子热激蛋白 ; 启动子 ; 逆境 ; 克隆
中图分类号 : Q 78 , Q 943 文献标识码 : A 文章编号 : 0253 - 2700 (2007) 02 - 223 - 08
Cloning and Functional Analysis of a Multiple Stress-inducible
LeMTshsp Promoter from Tomato ( Lycopersicon esculentum)
YI Shu-Ying, SUN Ai-Qing, ZHAO Chun-Mei , LIU J ian
**
( Collegeof LifeSciences, Shandong Normal University, Jinan 250014 , China)
Abstract : Based on the Southern blot analysis results, the KpnⅠ and EcoRⅠ restriction enzymeswere selectedtodigest
the genomic DNA of a cultivar of tomato ( LycopersiconesculentumMill . CV . zhongshu 4) . The3 kb bands of thedigested
genomic DNA were inserted into the pBSⅡKS ( + ) vector . As a result, a plasmid library was generatedcontaining about
2 kbof the5′-flanking sequence of themitochondria-localized small heat shock proteingene ( LeMTshsp) . A 1915 bp of the
5′-flanking region of LeMTshsp was isolated from the plasmid library by nested PCR ( GenBank accession number
AB239774) . The 5′-flanking region of LeMTshsp contains putativeTATA box, CAAT box, atotal of six HSEs and several
AT-rich regions . Additionally, there are some transcription factor bindingmotifs related to stress response, such as ABA-
responsiveelement [ABRE] , C-repeat— DRE and activating protein binding sites [AP-1 ] . Electrophoresis mobility shift
assay (EMSA) showed that the purified HsfA2 protein bound specifically to HSEs of the LeMTshsp promoter invitro, and
bound strongly to the proximal five HSEsthanto thedistal HSE . Thefusion constructionof LeMTshsp promoter- gus (β-glu-
curonidase) was introduced into tomato using an Agrobacterium -mediated transformation . The resistant transgenic plants
were selected on theMS mediumcontaining50 mg?L kanamicin . PCR analysis showedthat thechimeric gus genewas inte-
grated into the tomato genome . By using the gus reporter gene system, the LeMTshsp promoter dynamicswas explored un-
der stress conditions . After heat, cold, exogenous ABA and heavy metal (Cd2+ , Cu2 + , Pb2 + or Zn2 + ) treatments, GUS
staining was detected in the leaves and roots of transgenic tomato plants . Theactivityof the LeMTshsp promoter under heat
shock conditionswas comparable to that of the constitutive CaMV35S promoter . All these results show that the LeMTshsp
云 南 植 物 研 究 2007 , 29 (2) : 223～230
Acta Botanica Yunnanica

?
?? ?通讯作者 : Author for correspondence; E-mail : ljlsd@ beelink. com
收稿日期 : 2006 - 05 - 15 , 2006 - 10 - 16 接受发表
作者简介 : 伊淑莹 (1979 - ) , 女 , 博士研究生 , 主要从事分子生物学研究。 ?
基金项目 : 国家自然科学基金项目 (30270132)
promoter is a promoter responding to heat, cold, exogenous ABA and heavy metals .
Key words: Tomato; Mitochondria-localized shsp; Promoter; Stress; Clone
冷害、高温和干旱是常见的农业自然灾害 ,
农业生产上抵抗自然灾害的方法很多 , 其中运用
生物技术 , 特别是基因工程方法培育抗性品种是
重要的生物学途径。利用基因工程进行抗性育
种 , 就是将抗性基因导入作物中 , 提高其抗逆能
力。目前基因工程常用的启动子主要是组成型表
达启动子 , 如花椰菜花叶病毒 35S ( CaMV35S)
启动子、水稻肌动蛋白基因 ( Act1 ) 启动子、玉
米泛素基因 ( Ubi1) 启动子等。利用组成型表达
启动子表达抗性基因虽然可以提高植物在逆境条
件下的抗逆能力 , 但在这些启动子调控下的外源
基因在转基因植物的所有部位和发育阶段均表达
(Huang等 , 2001; 李一琨和王金发 , 1998 ) , 正
常环境下细胞内组成型表达的抗逆蛋白是一种能
量的浪费 , 可能妨碍植物的正常代谢 , 造成转基
因植物的发育异常 (Kasuga 等 , 1999 )。解决此
矛盾的途径就是使用逆境胁迫诱导型启动子 , 用
这些环境胁迫诱导型启动子与抗逆基因融合 , 使
植物在受到逆境胁迫时才表达相应蛋白 , 从而使
转基因植物更好地适应逆境 (Kasuga等 , 1999 )。
热激蛋白 ( heat shock protein, HSP) 是生物
体在不利环境因素刺激下应激合成的具备分子伴
侣活性的一类蛋白质。植物热激蛋白中最丰富的
是小分子量热激蛋白 (sHSP) , 分子量一般是 15
～50 kD。番茄线粒体小分子热激蛋白 (mitochon-
dria-localized sHSP, 简称 LeMTsHSP) 由核基因编
码 , 定位于线粒体基质中。番茄 LeMTsHSP 基因
(即 LeMTshsp) 无组成型表达 , 但对热激 ( Liu
and Shono, 2001; Sabehat 等 , 1996 )、冷害 ( Liu
and Shono, 2001 ) 均有较强应答。作者从番茄中
克隆了线粒体小分子热激蛋白基因启动子 , 构建
了含 LeMTshsp: : GUS融合基因的植物表达载体 ,
并转化番茄 , 通过检测逆境条件下该启动子的诱
导活性 , 发现该启动子对热激、低温、外源 ABA
及重金属胁迫都有应答。
1 材料与方法
1 .1 Southern杂交分析
以番茄 ( LycopersiconesculentumMill .)“中蔬 4 号”成
熟叶片为实 验材料 提取基 因组 DNA ( Dellaporta 等 ,
1983) , 用位于 LeMTshsp cDNA 下游的单一酶切位点 EcoR
Ⅰ与 BamHⅠ、 BglⅡ、 KpnⅠ、 PstⅠ、 SacⅠ、 SpeⅠ、
XbaⅠ、 XhoⅠ分别双酶切番茄基因组 DNA , 另外以
EcoRⅠ与 HindⅢ单酶切基因组 DNA 作为对照。以 LeMT-
shsp基因片段为探针模板 , 用α-32 P-dCTP标记探针 , 65℃
杂交过夜 (杂交液组成为 : 0 . 5 mol?L 磷酸缓冲液 , 7%
SDS, 10 mmol?L EDTA , 100 μg?mL 鲑精 DNA ) , 依次用
65℃的 4×SSC?0 .1% SDS、2×SSC?0 .1 % SDS 和 1×SSC?
0 .1% SDS洗膜 , 每次 10～15 min, X 光片曝光。
1 .2 质粒文库的构建及启动子片段的获得
KpnⅠ与 EcoRⅠ双酶切的基因组 DNA 片段经低熔点
琼脂糖凝胶电泳分离后 , 切下 3 kb左右的片段并回收 ,
与同样双酶切的 pBSⅡKS ( + ) 载体连接 , 转化大肠杆
菌 DH5α, 复苏后摇菌 , 提取质粒 , 以 LeMTshsp cDNA 内
部特异引物 (正向引物 : 5′-CATGATGGATCAAATGATGG-
3′及反向引物 : 5′-TCCACAACAACCTATCTAAG-3′) 进行
PCR检测 , 证明目的基因确已插入 , 从而建成含有
LeMTshsp上游 2 kb左右调控区的质粒文库。根据 pBSⅡ
KS ( + ) 载体及已知的 LeMTshsp cDNA 序列设计两组引
物进行巢式 PCR。首先用 pBSⅡKS ( + ) 载体特异引物
M13?RV (5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3′) 与 LeMTshsp基因
特异引物 MT?R1 ( 5′-TCCACAACAACCTATCTAAG-3′) PCR
扩增质粒文库 ; PCR 产物稀释 1000 倍作为模板 , 以内部
另一对引物 T3 (5′-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3′) 与 M1
(5′-CTGGTCATAAGCTGTCATCTG-3′) 做二次 PCR。将得到
的大约 2 kb的巢式 PCR 产物连入 pGEM-T 载体中 , 测序 ,
从而克隆出 LeMTshsp上游 5′侧翼序列。
1 .3 凝胶阻滞分析
番茄全长 HsfA2 cDNA 构建入 pET-27b ( + ) 载体的
HindⅢ?XhoⅠ位点 , E . coli BL21 菌株表达 HsfA2-His6 融
合蛋白 , 表达的融合蛋白大量存在于包涵体中 , 用超声
处理及 PBS 缓冲液多次洗涤的方法纯化包涵体蛋白。最
后用结合缓冲液 ( 10 mmol?L Tris, pH 7 .9 ; 50 mmol?L
NaCl; 1 mmol?L EDTA ; 0 . 5 mmol?L DTT; 5% 甘油 ) 溶解
包涵体 , 用于凝胶阻滞分析。
PCR 扩增含有 HSE1-5 的 163 bp的 LeMTshsp启动子片
段 (起始密码子 ATG 上游 - 88 至 - 250) 和含有 HSE6 的 152
bp的启动子片段 (起始密码子 ATG 上游 - 832 至 - 983) , 引
物分别为 : HSE1-5?F (5′-CAGAAGCTTTATGTATATTGTCTAC -
3′)、HSE1-5?R ( 5′-TGGAAGCTTAGAATGTGATGCTTGG -3′) 和
HSE6?F (5′-TGAAGCTTCCAGGTCTCATTCTTG-3′)、HSE6?R (5′-
CTGAAGCTTCTAGTCATATCACG -3′) 。扩增片段 HindⅢ酶切
422 云 南 植 物 研 究 29 卷
后 , 通过 Taq DNA 聚合酶 72℃延伸 20 min进行 3′末端α-
32 P dCTP标记。
参照 Mosser 等 (1988) 的方法 , 结合缓冲液中包含
5μg 或 10 μg纯化的 HsfA2 蛋白与 0 .5 ng末端标记的
HSE1-5 启动子片段或 HSE6 启动子片段 , 通过在正常的
结合反应体系中加入 100 倍过量 (50 ng) 的未标记寡核
苷酸片段来检测结合反应的特异性。室温 (26℃ ) 结合
1 h。结合产物于 5%非变性聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳 ,
以 0 .5×TBE 作为电泳缓冲液。
1.4 LeMTshsp: : GUS表达载体的构建及番茄的遗传转化
以所克隆的 LeMTshsp启动子为模板 , PCR 扩增该启
动子的 1.9 kb的 DNA 片段 ( 引物为 5′-ATT - 紑GTCGACAAT-
TAACCCTCACTAAAGGG-3′和 5′-AGA - ?GGATCCAATAACTT-
GCCGATTGAG-3′) , 扩增产物经 SalⅠ和 BamHⅠ双酶切
后 , 连入 pBI101 植物表达载体 , 从而构建成含 LeMTsh-
sp: : GUS 融合基因的植物表达载体 , 使 GUS 基因在
LeMTshsp启动子的驱动下表达。利用冻融法将构建的植
物表达载体转化农杆菌 LBA4404 , 叶圆盘法转化“中蔬 4
号”番茄 (Holsters 等 , 1978 ) , 获得的转基因番茄幼苗
移至田间育种。同时 , 将 pBI121 植物表达载体转化番茄
作为阳性对照。
1 .5 转基因植株的分子鉴定
提取转基因番茄叶片基因组 DNA , 利用 GUS基因特
异 引 物 5′-TCGATAACGTGCTGATGGTGC-3′和 5′-AC-
CGAAGTTCATGCCAGTCCAG-3′PCR 扩增 864 bp的片段。
1 .6 转基因番茄的胁迫处理
转基因番茄 T1 代幼苗经卡那霉素筛选后于 26℃温
室中培养至五叶期 , 用于各种逆境处理。热激及冷处
理 : 幼苗暴露于恒温培养箱中 39℃热激处理 3 h或 2℃低
温处理 48 h后 , 取其根及叶片用于 GUS染色 ; ABA 及重
金属处理 : 取等位叶浸没在 0 .10 mmol?L 的 ABA 或 0 .20
mmol?L 的 CdCl2 , CuSO4 , Pb ( CH3 COO) 2 , ZnSO4 中 26℃
处理 6 h后用于 GUS染色。幼苗经同等浓度的 ABA 及 Pb
(CH3 COO)2 浇灌一周后取其根用于 GUS染色。
1 .7 GUS 组织化学染色分析
GUS组织化学染色方法参照 Jefferson等 ( 1987)。将
转基因番茄的叶片或幼根放入盛有 X-Gluc 反应液 ( 50
mmol?L 磷酸 钠 缓 冲 液 , pH 7 .0 ; 0 .5 mmol?L K3 [ Fe
(CN) 6 ] ; 0 . 5 mmol?L K4 [ Fe ( CN) 6 ] . 3H2 O; 10 mmol?L
EDTA ; 0 . 1% Triton X-100; 2 mmol?L X-gluc) 的 1.5 ml 离
心管中 , 抽真空 , 37℃染色 16 h。组织用 70 %乙醇脱色 ,
然后观察拍照。
2 结果与分析
2 .1 LeMTshsp上游调控序列的酶切位点分析
EcoRⅠ是位于番茄 LeMTshsp cDNA 下游的单
一酶切位点。为获得适合于构建质粒文库的酶切
片段 , EcoRⅠ与能克隆入 pBSⅡKS ( + ) 的 8 种
酶分别双酶切番茄基因组 DNA , 进行 Southern杂
交。杂交结果显示 : KpnⅠ与 EcoRⅠ双酶切的基
因组 DNA 的杂交片段约 3 kb, 包括 2 kb左右的
上游调控序列 , 适合于构建质粒文库 ( 图 1 , 泳
道 4)。另外 , HindⅢ单酶切基因组的杂交片段
大小与 LeMTshsp cDNA 不一致 (图 1 , 泳道 10 ) ,
设计引物扩增基因组后测序 , 发现在 LeMTshsp
基因序列 ATG 后 201 bp 存在 245 bp 的内含子
(结果未显示 ) 。
2 .2 LeMTshsp启动子的克隆及序列分析
通过巢式 PCR 方法从质粒文库中克隆出 LeMT-
shsp上游 5′侧翼区 , 该片段包括起始密码子 ATG 上
图 1 Southern 杂交结果
10μg 基因组 DNA 由 EcoRⅠ , HindⅢ完全酶切或由 EcoRⅠ与不
同的酶 双酶 切。 1 . EcoRⅠ ; 2 . BamH Ⅰ?EcoR Ⅰ ; 3 . BglⅡ?
EcoRⅠ ; 4 . KpnⅠ?EcoRⅠ ; 5 . PstⅠ?EcoRⅠ ; 6 . SacⅠ?EcoR
Ⅰ ; 7 . SpeⅠ?EcoRⅠ ; 8 . XbaⅠ?EcoRⅠ ; 9 . XhoⅠ?EcoRⅠ ;
10 . HindⅢ。图左侧数字代表 DL15000 DNA marker。
Fig . 1 The result of Southern hybridization
Thegenomic DNA ( 10 μg) was digested with EcoR Ⅰ , HindⅢ , or
doubledigested with EcoRⅠand various restriction enzymes . 1 . EcoR
Ⅰ ; 2 . BamH Ⅰ?EcoR Ⅰ ; 3 . Bgl Ⅱ?EcoR Ⅰ ; 4 . KpnⅠ?EcoR
Ⅰ ; 5 . PstⅠ?EcoRⅠ ; 6 . SacⅠ?EcoRⅠ ; 7 . SpeⅠ?EcoRⅠ ;
8 . XbaⅠ?EcoRⅠ ; 9 . XhoⅠ?EcoRⅠ ; 10 . HindⅢ . The left
numbers represent DL15000 DNA marker .
5222 期 伊淑莹等 : 多胁迫诱导型启动子的分子克隆及其功能分析
游 1915 bp。在 PlantCARE ( http:??sphinx.rug.ac.be:
8080?PlantCARE) 及 TRANSFAC 数据库中分析所分
离的 LeMTshsp启动子序列 , 其中包括许多转录因子
结合的顺式调控序列 ( 图 2 )。保守的 TATA box
(TATAAA ) 位于起始密码子 ATG 上游 - 111 bp,
CAAT box 位于 - 418 bp。TATA box 近端的 5 个 AT-
rich (93% ) 区分别位于 - 301、 - 356、 - 435、 - 497
及 - 591 bp。另外两个远端 AT-rich (92% ) 区位于
-1600 bp附近。LeMTshsp 启动子区包括 6 个 HSEs,
其核心序列为 5′-nGAAn-3′(Amin等 , 1988)。最近
端的 HSE1 ( T - ?TTCTC ?GAGTC ?TTTTT ?TTCCCC ?TTCT )
位 于 - 154 bp。 HSE2 ( T - 斗GATGC 斗TTCT ) 、 HSE3
( A - 穀TTCTG 穀GAACA 穀TTCT )、 HSE4 ( C 穀TTCAC 穀GCAT )
及 HSE5 ( C - 符TTCTA 符GAAG) 位于 - 222 bp 至 - 160
bp。另外还发现远端的 HSE6 ( C - 笣TTCAT 笣GAAT)
位于 - 888 bp。 LeMTshsp启动子区除了 HSEs外还
有许多与胁迫相关的元件 , 如 ABA 反应元件
ABRE, 冷反应元件 C-repeat— DRE, activating pro-
tein 1 ( AP-1 )。该启动子的 GenBank 登录号为
AB239774。
图 2 番茄 LeMTshsp 启动子序列分析
推测的 TATA 盒、CAAT 盒以带有下划线的斜体字母表示 , 推测的顺式作用元件 HSE、AP-1、ABRE、C-repeat— DRE 以下划线标注。
HSE 核心元件 GAA?TTC 以矩形框标注 , 保守的 AT-rich 区以斜体的黑体表示。起始密码子 ATG 以黑体表示。
Fig . 2 Sequence analysis of LeMTshsp promoter in tomato
The putative TATA box and CAAT box are shown in italic letters with underlining . Putative transcriptional cis sequences ( HSE , activating protein 1
[AP-1] , ABA-responsive element [ ABRE ] , C-repeat— DRE) are indicated with underlining . Rectangular frames designate matches to the core
consensus GAA?TTC . The putative AT-rich regions are shown in italic and bold letters, and the ATG start codon is shown in bold letters .
622 云 南 植 物 研 究 29 卷
图 3 凝胶阻滞分析结果
标记的 LeMTshsp 启动子的 HSE 片段 (0 . 5 ng 的 HSE1-5 启动子片
段或 HSE6 启动子片段 ) 与不同浓度的 HsfA2 蛋白 ( 5 μg 或 10
μg) 温浴 , 特异性的竞争物使用 100 倍过量 ( 50 ng) 的未标记
启动子片段 HSE1-5 或 HSE6 (泳道 1 和 4)。2 , 3 . 标记的 HSE1-
5 启动子片段与 5μg 或 10μg 纯化的 HsfA2 蛋白反应 ; 5 , 6 . 标
记的 HSE6 启动子片段与 5μg 或 10μg纯化的 HsfA2 蛋白反应。
箭头所指为文中所述的 HsfA2: : DNA 复合物。
Fig . 3 The result of electrophoresis mobility shift assay
Labeled HSE fragments (0 . 5 ng of promoter fragment HSE1-5 or HSE6) of
the LeMTshsp promoter were incubatedwith increasing amounts of the pu-
rified HsfA2 (5μg and 10μg) . As a specific competitor ( in Lane 1 and
4) , a 100-fold excess (50 ng) of unlabeled promoter fragment HSE1-5 or
HSE6 were used . Lanes 2 to 3 , the labeled fragments HSE1-5 were in-
cubated with increasing amounts of the purified HsfA2 protein ( 5μg and
10μg, respectively) . Lanes 5 to 6 , the labeled fragments HSE6 were
incubatedwith increasing amounts of the purified HsfA2 protein (5μg and
10μg, respectively) . The arrow points to the specific HsfA2: : DNA
complexes mentioned in the text .
2 .3 凝胶阻滞分析结果
热激蛋白基因的转录活性依赖于热激因子
HSF 与高度保守的热激元件 HSE 的相互作用。番
茄 HsfA2 蛋白是典型的热诱导蛋白 , 被认为是番
茄热激应答的主要调节因子 (Port 等 , 2004)。为
了检测 LeMTshsp 启动子中预测的 HSE 是否具有
HSF 结合活性 , 分别扩增包含 HSE1-5 的启动子片
段及包含远端 HSE6 的片段用于凝胶阻滞分析。
如图 3 所示 , HsfA2-His6 融合蛋白可与 LeMT-
shsp启动子的 HSE 元件在体外特异结合 , 形成
DNA-蛋白质复合物。而且 , 随着 HsfA2 蛋白量的
增加 , 检测到的 DNA-蛋白复合体的量也逐步增加
(图 3 , 泳道 2 - 3, 5 - 6)。这种 HsfA2 的结合活性
能被 100 倍过量的竞争物 (未标记的 HSE1 - 5 启
动子片段或 HSE6 启动子片段 ) 所抑制 (图 3, 泳
道 1 和 4) , 表明热激转录因子 HsfA2 和 LeMTshsp
启动子 HSE 元件的结合是特异的。并且 TATA-box
近端 HSE1-5 比远端 HSE6 结合活性强。
2 .4 F转 LeMTshsp: : GUS 融合基因植株的获得
及分子鉴定
为了检测 LeMTshsp 启动子的活性 , 构建了
LeMTshsp: : GUS载体 (图 4 ) , 利用农杆菌介导
法转化番茄 , 获得了 12 个具有卡那霉素抗性的
转化株系。提取叶片基因组 DNA , 用 GUS 基因
特异性引物进行 PCR 分析 , 转基因植株均能扩
增出 864 bp的特异性产物 , 而非转化植株没有扩
增出条带 ( 图 5 )。结果表明 GUS 基因已经整合
在转基因植株基因组中。
2 .5 热激、低温、外源 ABA 及重金属胁迫条件
下 GUS 基因的表达
为了检测逆境条件下 LeMTshsp 启动子的活
性 , 我们对热激、低温、外源 ABA 及重金属胁
迫条件下转基因番茄叶片与根中的 GUS 表达进
行了测定。如图 6 所示 , 常温下未经处理的转基
因番茄叶片未检测到信号 , 根中除了分生组织区
图 4 植物表达载体 LeMTshsp: : GUS结构示意图
Fig . 4 Diagram of the plant expression vector LeMTshsp: : GUS
7222 期 伊淑莹等 : 多胁迫诱导型启动子的分子克隆及其功能分析
图 5 转基因番茄植株的 PCR 分析
M . DL2000 DNA marker ; 1 . 质粒阳性对照 ; 2～13 . 转基因植
株 ; ck . 未转基因的阴性对照植株。
Fig . 5 PCR analysis of transgenic tomato plants
M . DL2000 DNA marker ; 1 . Positive control , plasmid; 2 - 13 . Trans-
genic tomato plants; ck . Negative control , untransformed tomato plant .
外也未检测到蓝色。39℃热激条件下 , 叶片及根
中 GUS 染色非常强 , 与常温下 pBI121 转基因植
株 ( CaMV35S启动子驱动 GUS 表达 ) 接近 ; 2℃
低温处理条件下叶片及根中均能检测到明显的
GUS活性 ; 0 . 10 mmol?L 的 ABA 处理条件下的检
测到较弱的 GUS 信 号 ; 转基因 番茄经 Cd2 + 、
Cu2 + 、Pb2 + 、Zn2 + 常温条件下处理后 , 均能检测
到明显的 GUS 表达。
以上结果表明 : LeMTshsp启动子是典型的受
热激、低温、外源 ABA 及重金属胁迫条件引发
的诱导型启动子。
图 6 各种胁迫下转基因番茄叶片及幼根 GUS 组织化学染色结果
A . pBI121 转基因植株常温下的叶片 GUS 染色结果 ; B-H , 各种处理条件下 , LeMTshsp: : GUS 转基因番茄叶片 GUS染色结果 : B . 常温及
39℃热激 3 h 的转基因番茄叶片 ; C . 2℃低温处理 48 h 的转基因番茄叶片 ; D . 0 . 10 mmol?L 的 ABA 处理后 6 h 的转基因番茄叶片 ; E-H .
分别为 Cd2+ (E )、Cu2+ (F )、Pb2+ (G) 及 Zn2+ ( H) 处理的转基因番茄叶片。I . pBI121 转基因植株常温下的幼根 GUS 染色结果 ; J -N .
各种处理条件下 , LeMTshsp: : GUS 转基因番茄幼根 GUS 染色结果 : J . 常温下转基因番茄幼根 ; K . 39℃热激 3 h 的转基因番茄幼根 ; L .
2℃低温处理 48 h的转基因番茄幼根 ; M . 0. 10 mmol?L ABA 处理的转基因番茄幼根 ; N . 0. 20 mmol?L Pb2+ 处理的转基因番茄幼根。
Fig . 6 GUS staining in transgenic tomato leaves and roots after various stress treatments
A . GUS activity in pBI121transgenic tomato leaves at normal temperature . B-H . GUS activity in LeMTshsp: : GUS transgenic tomato leavesafter various
stress treatments: B . Leaves at normal temperature or heated at 39℃ for 3 h; C . Leaves treated at 2℃ for 48 h; D . Leaves treated at 0 .10 mmol?L
ABA for 6 h; E-H . Leavestreated by Cd2+ (E ) , Cu2+ ( F) , Pb2+ ( G) or Zn2+ ( H ) respectively . I . GUS activity in pBI121transgenic tomato roots
at normal temperature . J -N . GUS activity in LeMTshsp: : GUS transgenic tomato roots after various stress treatments: J . Roots at normal temperature;
K . Roots heated at 39℃ for 3 h; L . Roots treated at 2℃ for 48 h; M . Rootstreated by 0 . 10 mmol?L ABA; N . Roots treated by 0 .20 mmol?L Pb2+ .
822 云 南 植 物 研 究 29 卷
3 讨论
热激蛋白表达调控主要存在于转 录水平
(Wu, 1995 ) 。热激蛋白基因的转录活性依赖于
热激因子 HSF 与高度保守的热激元件 HSE 的相
互作用 , HSE 是 5′-nGAAn-3′五核苷酸核心重复
(Amin, 1988) 。HSF 与 HSE 的稳定结合至少需要
两个五核苷酸核心重复 , 单个 nGAAn无法稳定
的结合 HSF。本研究获得了番茄 LeMTshsp 起始
密码子上游 1915 bp的调控序列 , 包括了起始密
码子上游的 5′UTR 区 , PlantCARE 及 TRANSFAC
分析表明该序列除了具有保守的 TATA box 及
CAAT box外 , 还具有 6 组典型的 HSE 元件 , 其
中 5 组位于 TATA box 近端 ( - 128 bp 至 - 222
bp) , 另外 1 组位于 TATA box 远端 , 凝胶阻滞结
果表明 , HsfA2 蛋白与预测的 HSE 元件均具有结
合活性 , 且近端 HSE1-5 比远端 HSE6 结合活性
强。在许多大豆热激蛋白启动子区都发现了 AT-
rich区 ( Raschke等 , 1988) , 研究表明 , 在 Gm-
Hspl7 .3-B基因上游的 AT-rich 区 ( - 81 bp 至 -
306 bp) 具有类似增强子的功能 ( Baumann 等 ,
1987) 。 LeMTshsp启动子具有多个 AT-rich区 ( -
1915 bp至 - 280 bp) , 这些 AT-rich区可能对该基
因的表达具有增强作用。
Liu and Shono ( 2001 ) 对热处理的番茄叶片
进行 Northern杂交结果表明 , LeMTshsp是番茄 4
类小分子热激蛋白基因中表达最强的基因 ; 另
外 , Sabehat等 (1996) 研究发现 , 在热激后的番
茄绿果中累积大量的线粒体 sHSP。本文作者将
克隆的 LeMTshsp启动子与 GUS 基因融合导入番
茄 , 热激处理条件下 GUS 检测结果表明 , 该启
动子为热诱导强启动子 , 其活性与 CaMV35S 启
动子 类似。许多 热激蛋白在 低温 ( Neven 等 ,
1992; Krishna等 , 1995; Sabehat 等 , 1998 ) 条件
下有表达 , Liu and Shono ( 2001 ) 的研究表明 ,
LeMTshsp在 6℃冷处理下就具有表达 , 在 2℃时
表达更强 , 本研究中 , 在 2℃处理条件下检测到
明 显 的 GUS 活 性。另 外 , ABA ( Singla and
Grover, 1993; Coca 等 , 1996 ) 及重金属 ( Woll-
giehn and Neumann, 1999) 也能诱导部分热激蛋
白表达 , 本研究中 , 在外源 ABA 及重金属胁迫
条件下都检测到明显的 GUS 活性。以往的研究
结果表明 , HaHsp17 .7G4 启动子对 ABA 的应答
是通过 HSF3 实现的 ( Rojas 等 , 1999 )。许多资
料表明 AP-1 结合元件与 Cd 等重金属胁迫有关
(Alam, 1994) , 但是在酵母细胞中 , Cu 诱导的
CUP1 铜金属硫蛋白基因的活化是通过该基因启
动子区的 HSE 元件起作用的 ( Pe?a 等 , 1998 )。
而且 , hsp70 被热激和重金属 Cd 的超活化作用
是通 过 HSF 依 赖的 方式 实 现的 ( Saydam 等 ,
2003) 。是热激元件 HSE 还是预测的胁迫相关元
件 ( 如冷反应元件 C-repeat— DRE, ABA 反应元件
ABRE, activating protein 1 [ AP-1 ] ) 在 LeMTshsp
启动子的低温、外源 ABA 及重金属胁迫应答过
程中扮演更重要角色有待于进一步的研究。
已经发现 , 不少抗性基因 ( 如脯氨酸合成酶
系、活性氧清除酶系、渗调物合成酶系 , 以及热
激蛋白等 ) 可以在多种逆境下提高植物的抗性。
如果将受热激、低温、外源 ABA 及重金属胁迫
条件诱导的 LeMTshsp启动子与此类多功能抗性
基因融合 , 应用于植物基因工程 , 即可避免导入
基因的组成型表达 , 防止无谓的能量浪费 , 不影
响植物的正常生长发育 , 充分有效的发挥上述基
因的功能 , 从而更有效的提高植物抵抗多种逆境
的能力。
〔参 考 文 献〕
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032 云 南 植 物 研 究 29 卷