全 文 ：第 l2卷 第 l期
2 0 0 4年 1月
中 国 生 态 农 业 学 报
Chinese Journal of Eco—Agriculture
Vol l2 No．1
Jan ． 2004
植物抗寒性基因工程研究进展
王瑞云 贺润喜 岳文斌 任有蛇
(山西农业大学农学院 太谷 030801)(山西农业大学动物科技学院 太谷 030801)
摘 要 导入 外源基 因提高植 物抗逆 胜 已成为现 代植物 育种 主要手段 ，阐述 了动物抗：东蛋 白及 其转基 因植物 、植
物冷诱导基 因 、脂肪酸去饱和酶基 因、SOD基 因、脯氧酸基 因、植物抗 东蛋 白及 其转基 因植物抗 寒性 基因工程 的研
究进展。
关键词 动物 植物 抗寒基 因 转基 因植 物
Advances in gene engineering of plant for cold resistance．WAN( Rui—Yun，HE Run—Xi(Agricultural Colege of Shanxi
Agricultural University，Taigu 030801)，YUE Wen—Bin，REN You She(Animal~％ience and Technology Colege of
Shanxi Agricultural University，Taigu 030801)，CJEA，2004，12(1)：26～29
Abstract W ith the development of biotechnology，the conduction of foreign gene for plant breeders has become a primary
method to improve the plant stress tolerance．This paper reviews the recent advances in plant cold resistance including an—
tifreeze genes of animals and its transgenetic plants，cold—regulated genes，fatty acid desaturase gene，SOD gene，proline
gene，antifreeze genes of plant and their transgenetic plants．
Key words Animal，Plant，Antifreeze gene，Transgenetic plants
低温冻害使许多植物生存受到严重危害 ，全球每年因低温冻害造成的农作物损失高达数千亿元。 ，研究
并提高植物抗寒力具有重要理论和现实意义 随着生物技术的发展 ，导入外源基因提高植物抗逆性已成为
现代植物育种的主要手段。近年来转基 因植物的研究取得巨大进展 ，已获得转基因植物百余种，涉及 50多
个物种 。本文综述了国内外植物抗寒性基因工程及其转基因植物抗寒育种研究进展。
l 动物抗冻蛋白(AFP)及其转基因植物
动物抗冻肽(Antifreeze peptide，简称 AFP)是秋冬季节一些寒带鱼类和极地小动物体内产生的一类多肽
或糖肽物质，它能吸附于微小冰晶表面，在分子水平上抑制冰晶的形成，从而降低动物体液的冰点 ，使其能
在低于冰点 的环境生活。目前已发现的抗冻肽可分为 4类 ：I富含丙氨酸重复序列，具有 a一螺旋结构的多
肽 ，以美洲拟鲽的 AFP为代表 ；1富含胱氨酸具有 p一折叠结构的多肽，以绒杜父鱼的 AFP为代表 ；Ⅲ氨基酸
组成无明显偏向性 ，无一定二级结构的多肽，以美洲大绵的 AFP为代表 ；Ⅳ抗冻糖肽 (Antifreeze glycopep—
tide，简称 AFGP)，主要代表为南极鳕鱼，可产生类似于糖三肽多聚体的 AFGP。利用鱼类抗冻蛋白基因对
植物进行遗传转化的研究始于20世纪80年代末期，1987年Davies等将抗冻基因AFP整合到Ti质粒上，用
叶圆片法转化郁金香 、烟草和油菜等获得一定抗冻力。Curler等用冬比目鱼溶液处理植物组织 的研究表明，
用 AFP真空浸润马铃薯、欧洲油菜和拟南芥叶片可使叶片自发冰点显著降低，说明AFP具有抗成核作用；
用 AFP处理雀麦草及其悬浮培养细胞，可降低任何给定温度下冰冻的可冻水量，表明 AFP有低温保护作
用 ；AFP能降低冰晶形成的速度 ，在某些极地鱼中发现的类型 I抗冻蛋 白(AFPs)可防止组织细胞 中冰晶的
形成，并已通过转基因技术使 AFPs在一些转基因植株中得到表达，如已在转基因烟草中证明AFPs的积累
具有低温特异性 ，它抑制冰晶的形成。鱼类抗冻蛋 白基因转入烟草和番茄已获得较好表达 ，Georges F．等 ⋯’
将人工合成的黄盖鲽鱼抗冻蛋白基因导入玉米原生质体 ，在植物细胞中获得表达。Hightower R．等’“利用
农杆菌将比目鱼体内抗冻蛋白(AFP)基因转入番茄，发现转基因番茄不但稳定转录 AFP的 mRNA，还产生
一 种新的蛋 白质 ，这种转基因番茄的组织提取液在冰冻条件下能有效阻止冰 晶增长 。Kimberly等将类型 I
鱼类抗冻蛋白基因转移至烟草中并在低温下检测到抗冻蛋白活性。费云标等已获得某些转鱼类抗冻蛋白
*国家948项目(2001—374)和山西农业大学育种基金项 目(200242)部分研究内容
收稿 日期 ：2002—12—31 改回 日期：2003—01—31
第 1期 王瑞 云等：植物抗寒性基因工程研究进展
基因的植物。黄永芬等获得转美洲拟鲽抗冻基因 AFP的番茄，且低温下转基因植株长势优于对照，致死温
度比对照降低 212，一系列检测表明 AFP已整合到转化番茄基因组并获得表达。
2 植物抗寒基因及其转基因植物
2．1 植物冷诱导基因及其转基因植物
目前已分离鉴定的植 物冷诱导基 因见表 1。Weiser认为植物在适应 低温过 程 中基因表达发生改变 ：
Guy等研究发现冷驯化能诱导和增加一些基因的表达 ，使多种基因表达发生改变。这些冷诱 导基因表达的
产物可分为两类，一是调控蛋白，调控寒冷信号传导、抗寒基因表达和抗寒蛋白活性；二是功能蛋白，与植物
抗寒性的提高直接相关。目前已在烟草、番茄、水稻和玉米等作物中发现抗渗透胁迫的转录因子 DREB：
Mohapatra等、Houde等在苜蓿中已分离到多种冷驯化特异的cDNA，对脱落酸诱导(ABA)、脱水或热休克处
理诱导的转录累积与冰冻耐受性明显正相关。冷驯化能诱导多种 COR蛋白基因表达，如拟南芥在冷驯化过
程中能产生 COR6．6，COR15a，COR78以及与 LEA(Late—embryogenesis abundant)蛋白同源的 COR47。Tho—
mashow M． 研究发现拟南芥受低温 、干旱或 ABA处理时能诱导 COR15a蛋 白基因表达产生 15kD的多
肽，此多肽与叶绿体结合后转变为94kD的多肽 COR15am。Artus N．N．等 ” 使 COR15am多肽在转基因拟
南芥中大量表达后 ，与野生型相 比转基因植物分别提高叶绿体和原生质体的耐寒冷性 ，并增强原生质膜稳定
性，减轻寒冻损害。Imai R．等 “ 将西红柿 Le25基因转入酵母中使其大量表达后，显著提高酵母细胞耐寒
性。Liu Q．等 从玫瑰中分离得到 DRE(脱水反应因子，The dehydration—responsive element)结合蛋白
DREB1A、DREB2A 的 cDNA，并将 DREB1A 的 cDNA转 入拟 南 芥 中，大 大提 高 拟 南芥 抗 冻 力。Jaglo—
Ottosen K．R．等“ 将拟南芥 中分离得到的 CBF1(C—repeating binding factor)蛋白基 因导入 未经冷驯化 的拟
南芥中，可诱导其冷诱导 基因在常温下表达 。KasugaM．等 研 究表明用 冷诱 导基因rd29A的含DRE的启
表 1 已分离鉴定 的植物冷诱导基 因
Tab 1 The identified cold—regulated genes from plants
28 中 国 生 态 农 业 学 报 第 l2卷
动子启动 DREB1A、用组成性强启动子 35SCaMV启动 DRE1A或 CBF1在转基 因植物中均有表达 ，且提高
植物抗寒力 。20世纪 90年代苏联通过植物基 因工程使凝霜细菌变异 ，从而使一般植物在 一5℃ 以下存活，
并已育成<3℃种植的西红柿 ，在主要蔬菜上市前 2个月成熟结果。Thomashow等将 CBF1基因导人拟南芥
诱导了一系列低温调节蛋 白的表达 ，使未经低温驯化植株具有较强抗寒能力 ，从而能抵御较寒冷天气 =转
基因植株可在高等植物中获得 ，在低等植物中成功获得也见报道。Wada H．等 将抗寒兰菌的 desA基因导
入寒冷敏感的兰菌后增强其抗寒力。同年 Murata等将抗冷兰藻 ．Synechocystis的 desA基因，导人寒冷敏感
的兰绿藻 Anacystis nidulans中改变其抗寒力和膜脂组成 。
2．2 脂肪酸去饱和酶基因及其转基因植物
不同高等植物质膜中脂肪酸不饱和程度和冷敏感性密切相关，膜脂中心位置顺式双键的存在可把相变
温度降至接近 0"C，有些酶可催化饱和脂肪酸中顺式双键的形成 ，将编码这些酶的基因导入植物体 内使其获
得抗冷性状 。Murata N．等 将南瓜藤和拟南芥属得到的甘油 3一磷酸酰基转移酶基因 ，导人烟草 中明显
改变磷酸酰甘油的脂肪酸组成并提高其抗寒力。Polashock J．等 “ 将酵母的 A一9脂肪酸去饱和酶基 因，Ko—
dama H．等 将拟南芥的编码 ∞一3脂肪酸去饱和酶的 fad基因，Ma J．等卫 将菠菜的硬脂酰基载体蛋 白去饱
和酶 SAD基因，分别导人烟草中均增强转基 因烟草的抗寒性。Kodama H．等 玎 将拟南芥叶绿体 m一3脂肪酸
脱氢酶基因 fad7导人烟草中增强转基因烟草抗冷性。刘丹等利用脂肪酸去饱 和的关键酶 (SAD )基 因对烟
草进行遗传转化，结果表明转基因烟草抗寒性明显增强。Murata将抗冷植物拟南芥转酰酶GPAT(3一磷酸甘
油脂酰转移酶)转至烟草，大大提高烟草抗寒性。Ishizaki等向烟草转入蓝细菌 Anacystis nidulans的脂肪酸
去饱和酶基因 DELTA9，降低烟草细胞质膜的饱和脂肪酸水平 ，大大提高植株抗冷性 。Lilius C．等 将源于
大肠杆菌的胆碱脱氢酶基因即 betA导人烟草 ，使转基因植株中甘氨酸甜菜碱干物质量提高到 5t~mol／g，明显
改善其抗冻性。Hayashi H．等 将 编码来 自 Arthrobacter globiJormis或 A，pascens的胆碱氧化 酶的基 因
COdA导入拟南芥获得抗冻害转基因植株 。
2．3 超氧化物歧化酶基因、脯氨酸基因及其转基因植物
低温逆境下细胞 内活性氧的产生和清除平衡遭到破坏 ，膜系统稳定性受到影响，活性氧积累使膜脂发生
过氧化和脱脂作用，从而破坏膜结构，超氧化物歧化酶(SOD)可清除活性氧，维护膜系统稳定性。Breusegem
等报道利用质体转化技术将拟南芥的FeSOD和 Nicotina plumbaginUblia的MnSOD基因，导入玉米获得抗
寒转基因玉米 。脯氨酸是水合能力较强的氨基酸，其含量增加有助于细胞持水和生物大分子结构的稳定
有研究将拟南芥脯氨酸脱氢酶反义 RNA的cDNA转入拟南芥，以抑制脯氨酸降低，实现其高水平表达，结
果显著提高转基因植株对低温和高盐 的耐受性 。
2．4 植物抗冻蛋白(植物 AFP)
Kurkela S．等 从经 4V或 ABA处理的拟南芥中分离到 2个基因 Kinl和 Kin2，2个基因对应的蛋白质
同冬 比目鱼的 AFP结构相似，推测这 2个基因可能具有一定的抗冻基因性质。1992年加拿大 Grifith等
首次报道从经低温锻炼可忍受细胞外结冰的冬黑麦中发现内源性 AFP。同年美 国圣母大学 Duman实验室
在多种植物中发现有热滞效应的蛋白质 。1994年后费云标等从常绿抗冻植物沙冬青(AmmopiptanthlS
， o s)叶片中分离到抗冻蛋白 。同年卢存福从高山植物唐古红景天叶片及其悬浮培养细胞 中获得抗
冻活性蛋白质(AFP)。Urrutia M．E．等‘ 和 Duman J．G．等 发现植物较动物中存在 AFP更普遍 ，是抗冻
植物对冬季低温较为普遍的适应机制 。北印第安那州研究的 23种被子植物及常绿植物 中秋冬季均可检测
到 AFP，但夏季这种 AFP消失。欧 白英(SO]Ibl?l dulcamara)茎汁液表现出与动物 AFP同样抑制冰重结晶
的活性 ，免疫印迹反应证 明这种植物的 AFP同黄粉虫(Tenebrio molitor)AFP有共同抗 原决定位点 研究
人员进一步从冬季欧 白英枝条中分离到相对分子质量为 67kD的抗冻糖蛋白(AFGP)，是迄今动植物中得到
的相对分子质量最大的AFP。AFP不仅存在于被子植物中，且裸子植物、蕨类植物及苔藓植物中均发现有
抗冻活性的特异蛋白质。另外低等植物包括真菌和细菌 中也存在 AFP 。已研究的绝大多数植物材料 中
AFP活性大大低于鱼类和昆虫 ，所研究的植物虽多达几十种 ，但真正被分离纯化出来的 AFPs尚不多 =据报
道冬季常绿乔木北海道黄杨能忍耐 ～23．9℃低温 ，若能从其中提取出抗寒基因并转入其他植物 ，无疑将极大
地提高转基因植株抗寒性 ，因为植物内源 AFPs基因更适合在植物体内表达。因此如何从植物 中分离出更
多的、活性更高的AFP，并通过遗传转化将其导人抗寒性弱或不抗寒植物中进而获得抗寒性强的转基因植
株，将是今后植物抗寒性基因工程研究的主要内容之一。
第 1期 王瑞 云等 ：植物抗寒性基 因工程研究进展 29
参 考 文 献
1 邓江明等 植物抗冻机理研究新进展：抗冻基因表达及其功能．植物学通报，2000，18(5)：521～530
2 计灵巧等 植物遗传转化技术的应用 生物学通报，2001，36(2)：6～8
3 陈得波等 植物抗寒基因工程研究进展．生物技术通报，2001，36(4)：14～20
4 马建忠 植物的冷诱导基因．农业生物技术学报，1996，4(1)：8～14
5 蒋 明 植物基 因工程在农业中的应用 生物学通报 ，2000，35(6)：14～16
6 焦芳婵等 转基因改良植物的胁迫耐性 生物技术通讯，2001，12(2)：137
7 程焉平 转基 因植物的研究与应 用 吉林农业科学 ，2001，26(5)：26～30
8 Chou Kuo-Chen Energy—optimized structure of antifreeze protein and its binding mechanism M ol Biol ，1 992，223：509～ 5 1 7
9 Davies P L ，Choy L Hew Biochemistry of fish antifreeze protein FASEB，1990，4：2460～ 2468
10 Georges F ，Saleem M ，Cutler A J．Design and cloning of a synthesis gene for the flounder antifreeze protein and its expression in plant
cels Gene，1990，91(2)：159～165
1 1 Hightower R ，Cathy B ，Ranela D．Expression of antifreeze proteins in transgenic plants Plant Mol Biol，1991，I7(5)：1013～1021
1 2 Thomashow M F Arabidopsis thaliana as a model for studying mechanisms of plant cold tolerance Arabidopsis Cold Spring Harbor．NY ：
Cold Spring Harbo r Laboratory Press．1994 807～834
13 Artus N N．，Vemura M ．，Steponkus P L ，et al Constitutive expression of the cold—regulated Arabidopsis thaliana COR15a gene affects
both chloroplast and protoplast freezing tolerance Proc Natl Acad Sci USA，1996．93：13404～ 13409
14 Imai R ，Chang L．，Ohta A ， el al A lea—class gene of tomato congers salt and freezing tolerance when expressed in Saccharomyces
cerevisiae Gene．1996，l70：243～ 248
15 Liu Q．，Kasuga M ，Sakuma Y ，et al Two transcription factors，DREB1 and DREB2，with an EREBP／AP2 DNA binding domain sepe—
rate two cellular signal transduction pathways in drought and low temperature—responsive gene expression，respectively，in Arabidopsis Plant
Ce11．1998．10：l391～ l406
16 Jaglo-Otosen K．R ，Gilmour S J ，Zarka D G Arabidopsis CBF1 0verexpressi0n induces COR gene and enhances freezing tolerance
Science， 1998，280：104～ l06
17 Kasuga M ，Liu Q．，Miura S ，el al Improving plant drought，salt，and freezing tolerance by gene transfer of a single stres—inducible tran
scription factor Nature Biotechnology，1999，17：287～291
18 Wada H ．Gombo s Z．．Murata N Enhancement of chilling tolerance of a cyanobacterium by genetic manipulation of fatty acid desaturation
Nature，1990，347(6289)：200～203
19 M urata N．，Ishizaki—Nishizawa O ，Higashi S ，et al Genetically engineered alteration in the chilling sensitivity of plants Nature，1992，
356(6371)：710～713
20 Polashock J ，Lipson D ，Berkowitz G ，et al Expression of yeast 一9 fatty acid desaturase activity enhances chilling resistance in tobacco
Supplement to Plant Physio1．1993．102：1 60
21 Kodama H．，Horiguchi G ，Nishiuchi T ，et al Fatty acid desaturation during chilling acclimation is one of the factors involved in conferring
low—temperature tolerance to young tobacco leaves Plant Physiol，1995，107(4)：1 177～ 1185
22 Ma J ，Liu D ，Tang P Cloning of Spinach SAD gene，its construction and transformation to tobacco Supplement to Plant Physiol，1 996，
111(2)：814
23 Kodama H Genetic enhancement of cold tolerance by expression of a gene for chloroplast“J一3 fatty acid desaturase in transgenic tobacco Plant
Physiol，1994，105：601
24 Lilius C ， Holmberg N ， Btilow L Enhanced NaCI stress tolerance in transgenic tobacco expressing bacterial choline dehydrogenase
Biotechnology， 1996，14：177
25 Hayashi H ．，Alia M ustardy L Transformation of Arabidopsis thaliana with the codA gene for choline oxidase：accumulation of glycinebetaine
and enhanced tolerance to salt and cold stress．Plant，1997，12：133
26 Kurkela S．．FranckM ．Cloning and characterization of a coldandABA-inducibleArabidopsis gene PlantMolecularBiology，1990，15(1)：137～ 144
27 Close T J．Dehydrins：Emergence of a biochemical role of a family of plant dehydration proteins Physiol Plant，1996，97(4)：795～803
28 Dewald D．B．，Mason H S ，Mulet J E The soybean vegetive storage protein VSP a and VSP B are acid phosphatases active on polyphos—
phates Biol Chem ，1992，267(22)：15958～15964
29 Yamaguchi shinozaki T ，Urao T ，Shinozaki K ．Regulation of genes that are induced by drought stress in Arabidopsis thaliana Plant Res ．
1995．108(1)：127～ 136
30 urrutia M．E ，Duman J G ，Knight C A Plant thermal hysteresis proteins Biochim Biophy Acta，1992，1121(1)：199～206
3 1 Duman J G ，Olsen T M Thermal hysteresis protein activity in bacteria，fungi，and phylogenetically diverse plants Cryobiology，1 993，30
(3)：322～328