全 文 ：集约经营对毛竹林土壤固氮细菌群落
结构和丰度的影响∗
何冬华　 陈俊辉　 徐秋芳∗∗　 沈秋兰　 李永春　 毛新伟　 程　 敏
（浙江农林大学环境与资源学院浙江省森林生态系统碳循环与固碳减排重点实验室， 浙江临安 ３１１３００）
摘　 要　 为揭示集约经营对毛竹林土壤固氮细菌群落特征的影响，采用变性梯度凝胶电泳
（ＤＧＧＥ）和荧光定量 ＰＣＲ技术，分析集约经营 ０（ＣＫ）、１０、１５、２０、２５ 年毛竹林土壤固氮菌群
落结构和丰度的变化规律，并探讨了影响土壤固氮菌群落的主要环境因素．结果表明： 毛竹林
集约经营导致土壤 ｐＨ下降而速效养分积累；集约经营初期（１０ 年）和后期（２５ 年）土壤固氮
细菌的群落结构与对照相似，而中期的 １５年和 ２０年则与对照差异较大．固氮菌多样性指数和
丰度均呈现先减少后增加的趋势，经营 １５年时达到最小值；土壤固氮细菌表现出对集约经营
干扰的抵抗和恢复反应．冗余分析表明，土壤速效钾、水解氮、硝态氮和铵态氮的含量与固氮
菌群落结构的变化有较强的相关性，表明集约经营措施导致了土壤固氮细菌短期的变化，但
长期而言，不会对土壤固氮细菌产生不良影响．
关键词　 集约经营； 毛竹林； 固氮细菌； 变性梯度凝胶电泳； 实时荧光定量 ＰＣＲ
文章编号　 １００１－９３３２（２０１５）１０－２９６１－０８　 中图分类号　 Ｓ７１４．３　 文献标识码　 Ａ
Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｎ ａｂｕｎｄａｎｃｅ ａｎｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｉｌ Ｎ２⁃ｆｉｘｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａ ｉｎ
Ｐｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌａ ｓｔａｎｄｓ． ＨＥ Ｄｏｎｇ⁃ｈｕａ， ＣＨＥＮ Ｊｕｎ⁃ｈｕｉ， ＸＵ Ｑｉｕ⁃ｆａｎｇ， ＳＨＥＮ Ｑｉｕ⁃ｌａｎ，
ＬＩ Ｙｏｎｇ⁃ｃｈｕｎ， ＭＡＯ Ｘｉｎ⁃ｗｅｉ， ＣＨＥＮＧ Ｍｉｎ （Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｃａｒｂｏｎ Ｃｙｃ⁃
ｌｉｎｇ ｉｎ Ｆｏｒｅｓｔ Ｅｃｏｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｃａｒｂｏｎ Ｓｅｑｕｅｓｔｒａｔｉｏｎ， Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ａ＆Ｆ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｌｉｎ’ ａｎ ３１１３００，
Ｚｈｅｊｉａｎｇ， Ｃｈｉｎａ） ． ⁃Ｃｈｉｎ． Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｅｃｏｌ．， ２０１５， ２６（１０）： ２９６１－２９６８．
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ｇｒａｄｉｅｎｔ⁃ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ａｎｄ ｒｅａｌ⁃ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ （ ｑＰＣＲ） ｗｅｒｅ
ｅｍｐｌｏｙｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｎ ｓｏｉｌ Ｎ２⁃ｆｉｘｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａ ｉｎ ａ ｍｏｓｏ ｂａｍ⁃
ｂｏｏ （ Ｐｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌａ） ｐｌａｎｔａｔｉｏｎ． Ｓｏｉｌ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｍｏｓｏ ｂａｍｂｏｏ
ｓｔａｎｄｓ ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ ０ （ＣＫ）， １０， １５， ２０， ａｎｄ ２５ ｙｅａｒｓ ｏｆ ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ． Ｉｔ ｗａｓ ｆｏｕｎｄ ｔｈａｔ ｉｎ⁃
ｔｅｎｓｉｖｅ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｃａｕｓｅｄ ａ ｓｔｒｏｎｇ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｉｎ ｓｏｉｌ ｐＨ ｂｕｔ ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｉｎ ｓｏｉｌ ａｖａｉｌａｂｌｅ ｎｕ⁃
ｔｒｉｅｎｔｓ． Ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｎ２⁃ｆｉｘｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｏｉｌｓ ｈａｖｉｎｇ ｒｅｃｅｉｖｅｄ １０ ａｎｄ ２５
ｙｅａｒｓ ｏｆ ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｗｅｒｅ ｑｕｉｔｅ ｓｉｍｉｌａｒ ｔｏ ｔｈａｔ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ＣＫ； ｈｏｗｅｖｅｒ， ｔｈｏｓｅ ｆｒｏｍ １５ ａｎｄ
２０ ｙｅａｒｓ ｏｆ ｉｎｔｅｎｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｄｉｆｆｅｒｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ＣＫ． Ｗｉｔｈ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｔｉｍｅ ｏｆ ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ， ｔｈｅ
ａｂｕｎｄａｎｃｅ ａｎｄ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｎｉｆＨ ｇｅｎｅ ａｔ ｆｉｒｓｔ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ， ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｍｉｎｉｍｕｍ
ｖａｌｕｅｓ ｂｅｉｎｇ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ａｆｔｅｒ １５ ｙｅａｒｓ ｏｆ ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ， ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｅｖｅｎｔｕａｌ ｒｅｓｉｌｉｅｎｃｙ ｏｆ
Ｎ２⁃ｆｉｘｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａ ｔｏ ｄｉｓｔｕｒｂａｎｃｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ． Ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ
ｔｈａｔ ｓｏｉｌ ａｖａｉｌａｂｌｅ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ， ａｖａｉｌａｂｌｅ ｎｉｔｒｏｇｅｎ， ｎｉｔｒｉｔｅ ｎｉｔｒｏｇｅｎ， ａｎｄ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｗｅｒｅ
ｍｏｒｅ ｃｌｏｓｅｌｙ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ Ｎ２⁃ｆｉｘｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ
ｏｔｈｅｒ ｓｏｉｌ ｉｎｄｉｃｅｓ ｍｅａｓｕｒｅｄ． Ｉｎ ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ， ｔｈｅ ｓｏｉｌ Ｎ２⁃ｆｉｘｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ ｗａｓ ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ
ａｆｆｅｃｔｅｄ ｂｙ ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｓｈｏｒｔ ｔｅｒｍ， ｂｕｔ ｃｏｕｌｄ ｒｅｃｏｖｅｒ ｉｎ ｔｈｅ ｌｏｎｇ ｔｅｒｍ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ； Ｐｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌａ ｓｔａｎｄ； Ｎ２⁃ｆｉｘｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａ； ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ
ｇｒａｄｉｅｎｔ⁃ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ （ＤＧＧＥ）； ｒｅａｌ⁃ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ．
∗国家自然科学基金项目（４１２７１２７４）资助．
∗∗通讯作者． Ｅ⁃ｍａｉｌ： ｘｕｑｉｕｆａｎｇ＠ ｚａｆｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
２０１４⁃１２⁃０８收稿，２０１５⁃０７⁃０６接受．
应 用 生 态 学 报　 ２０１５年 １０月　 第 ２６卷　 第 １０期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｅｃｏｌｏｇｙ， Ｏｃｔ． ２０１５， ２６（１０）： ２９６１－２９６８
　 　 毛竹（Ｐｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌａ）又称楠竹（Ｐｈｙｌ⁃
ｌｏｓｔａｃｈｙｓ ｐｕｂｅｓｃｅｎｓ），是中国分布最广、面积最大的主
要经济竹种，主要分布在长江以南地区．第八次全国
森林资源连续清查（２００９—２０１３年）结果显示，现阶
段，我国竹林面积达 ６０１×１０４ ｈｍ２，其中毛竹林的面
积为 ４４３×１０４ ｈｍ２，占竹林面积的 ７０％，并且由于毛
竹自然扩展和人为更新，面积还将继续增加．毛竹用
途广泛、经济价值高，已成为我国南方地区特别是山
区农民主要的经济来源之一，也是现代林业的优势
和支柱产业．为了追求更高的经济效益，许多天然竹
林由粗放型经营逐渐转变为集约型经营，而集约经
营的主要特征为施用化肥，如尿素和复合肥．集约模
式短期内可使竹林生产力明显提高，然而，化学品的
长期过量投入导致的土壤养分失衡、土壤酸化、有害
物质积累、生物多样性衰退等负面影响也日益显现，
给生态系统本身与环境带来了巨大压力和严重威
胁［１］ ．如土壤中积累的养分元素通过挥发、径流、渗
滤等途径进入竹林周边水体，对大气和水体质量产
生严重威胁［２］，竹林土壤水土流失增加［３］ ．随着种植
年限的延长，土壤酸度逐渐增强［４］，土壤质量出现
了不同程度的退化［５］ ．此外，长期集约经营也降低了
土壤微生物的活性，促使竹林微生态提前退化［６］ ．近
年来，竹林集约经营引起的土壤微生物及相关生态
功能的变化广受关注［６－８］，土壤氮素循环过程大都
与微生物有关，其中固氮微生物又是整个循环中的
重要环节．生物固氮是固氮微生物利用自身的固氮
酶系统将空气中的氮气转化为氨的过程，而固氮微
生物对保障土壤植物可利用氮素供应具有重要贡
献，其群落结构组成对土壤氮素固定及维持氮素循
环平衡具有重要意义［９］ ．据不完全统计，生物固氮占
全球植物所需氮素的 ３ ／ ４［１０］ ．
毛竹集约经营可能会改变土壤固氮微生物的群
落结构，影响毛竹林生态系统氮素循环．对于毛竹林
固氮微生物的研究，目前已报道的文献主要应用传
统的平板培养方法［１１－１３］，从毛竹根际分离得到固氮
菌并加以鉴定，同时从生理生化特征、温度、ｐＨ、碳
源对其生长情况方面加以研究，由于该方法获得的
可培养固氮菌种类较少，导致多样性不高，无法较全
面地表征毛竹林土壤固氮菌群落状况，而基于功能
基因分子手段的毛竹林土壤固氮菌群研究几乎未见
报道．固氮微生物主要在固氮酶铁蛋白的催化作用
下固定空气中的氮气，而编码固氮酶铁蛋白亚基的
ｎｉｆＨ基因相对保守，可作为研究固氮微生物多样性
的理想遗传标志［１４］ ．为了揭示毛竹集约经营对毛竹
林土壤固氮细菌的影响，本研究通过选取不同集约
经营历史的毛竹林地，采用聚合酶链式反应（ ｐｏｌｙ⁃
ｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）、变性梯度凝胶电泳（ｄｅ⁃
ｎａｔｕｒｉｎｇ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ＤＧＧＥ）及荧光定
量 ＰＣＲ（ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ， ｑＰＣＲ）
方法，研究毛竹林土壤固氮细菌数量及种群结构的演
变趋势，并利用冗余分析方法探讨其主要影响因素，
研究结果可为毛竹林土壤管理和施肥提供理论依据，
对促进毛竹林地可持续发展具有重要意义．
１　 研究区域与研究方法
１􀆰 １　 研究区概况
研究区位于浙江省遂昌县（２８°１３′—１８°４９′ Ｎ，
１１８°４１′—１１９°３０′ Ｅ），属亚热带季风气候区，多年平
均气温 １６．８ ℃，无霜期 ２５１ ｄ，降水量 １５１０ ｍｍ．母岩
为由花岗岩变质的片麻岩石，坡度 ２０° ～２５°，土壤深
厚、疏松，土层厚度大于 １ ｍ．毛竹密度为 １８００
株·ｈｍ－２左右，１９８９ 年之前为竹林开发阶段，仅劈
山、垦复，不施肥． １９８９—２０００ 年施肥方法为：大年
（留养新竹年）６ 月在每株毛竹的上方开环形沟，施
用尿素（或碳铵）４５０ ｋｇ·ｈｍ－２；２０００—２０１０ 年施用
配方肥，每年用量为尿素 ４５０ ｋｇ·ｈｍ－２、过磷酸钙
３８０ ｋｇ·ｈｍ－２、氯化钾 ７５ ｋｇ·ｈｍ－２；２０１０ 年之后每
年施用毛竹专用肥（福建中化生产）７５０ ｋｇ·ｈｍ－２和
尿素 ４５０ ｋｇ·ｈｍ－２ ．
１􀆰 ２　 样品采集与处理
于 ２０１３年 ９月，按生态控制原则，选择生长历
史一致但集约经营历史不同的毛竹林，随机取样法
采集各处理（０ ～ ２０ ｃｍ）土壤样品．选择由同一农户
经营、并位于同一山上毛竹林地，施肥管理措施一
致，但不同地块开始集约经营（主要是施肥和翻耕）
的时间分别为：粗放经营 （未施肥对照）、 ２００３、
１９９８、１９９３ 和 １９８８ 年，相当于集约时间分别为 ０
（ＣＫ）及 １０、１５、２０、２５年等 ４个时间梯度（处理）．每
个年份毛竹林分别选取 ３ 个标准样地（即为 ３ 个重
复），每个样地采集表层（０～２０ ｃｍ）的多点混合样品
（按“Ｓ”形线，选取 ５ 个点，就地混合为一个样品），
过筛（２ ｍｍ）后装入密封袋，放入冰盒带回实验室．
样品分为 ２ 份，１ 份放到－７０ ℃冰箱，经冷冻干燥
后，用于提取土壤细菌总 ＤＮＡ，供土壤固氮微生物
群落结构分析使用；另外 １份于室内自然风干，研磨
过筛后用于土壤基本理化性质分析．
１􀆰 ３　 主要试剂与引物
土壤微生物总 ＤＮＡ 提取试剂盒 ＰｏｗｅｒＳｏｉｌ®
２６９２ 应　 用　 生　 态　 学　 报　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 ２６卷
ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ 购于美国 Ｍｏ Ｂｉｏ 公司； Ｂｏｖｉｎｅ
Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ （２０ ｍｇ·ｍＬ－１ ）、质粒提取试剂盒
ＭｉｎｉＢＥＳＴ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ， ＳＹＢＲ® Ｐｒｅｍｉｘ
Ｅｘ ＴａｑＴＭ， Ｐｒｅｍｉｘ ＴａｑＴＭ均购于宝生物工程公司
（ＴａＫａＲａ，大连）；Ｇｏｌｄｖｉｅｗ购于上海赛百盛（ＳＢＳ）公
司；荧光染料 ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎⅠ购于美国 Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 公
司；ｐＥＡＳＹ⁃Ｔ３载体购于北京全式金生物技术有限
公司；引物由生工生物工程（上海）有限公司合成．
１􀆰 ４　 分析方法
１􀆰 ４􀆰 １土壤化学性质分析　 土壤化学性质分析参照
文献［１５］进行．其中，土壤 ｐＨ值测定采用 １ ∶ ２．５ 土
水比，用酸度计测定；土壤硝态氮采用 ＫＣｌ 浸提⁃紫
外分光光度法；铵态氮采用 ＫＣｌ 浸提⁃靛酚蓝比色
法；碱解氮采用碱解扩散法；有效磷采用盐酸⁃氟化
铵溶液浸提，钼锑抗比色法测定；速效钾采用醋酸铵
提取，火焰光度计测定；有机质含量采用重铬酸钾容
量法．
１􀆰 ４􀆰 ２土壤总 ＤＮＡ 的提取 　 采用 ＰｏｗｅｒＳｏｉｌ® ＤＮＡ
Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ试剂盒提取土壤总 ＤＮＡ．称取 ０．５０ ｇ 于
－７０ ℃保存的冷冻干燥土壤样品，按试剂盒说明书
进行提取．经 １％（ｍ ／ ｖ）的琼脂糖凝胶电泳检测 ＤＮＡ
片段大小，并用微量分光光度计检测其浓度和纯度．
提取后的 ＤＮＡ样品保存于－２０ ℃ ．
１􀆰 ４􀆰 ３土壤固氮细菌的 ＰＣＲ⁃ＤＧＧＥ分析　 目的片段
扩增采用巢式 ＰＣＲ的方法．ＰＣＲ扩增所用引物见表
１．以第一轮 ＰＣＲ产物为模板进行第二轮 ＰＣＲ扩增，
得到 ３２０ ｂｐ 的扩增产物．２５ μＬ 反应体系如下：１０×
Ｐｒｅｍｉｘ Ｔａｑ １２． ５ μＬ，引物（１０ μｍｏｌ·Ｌ－１）各 ０． ２５
μＬ，模板 ＤＮＡ ０．３ μＬ，Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ，
２０ ｍｇ·ｍＬ－１）０．２ μＬ，用无菌双蒸水补足至 ２５ μＬ．
ＰＣＲ 扩增程序参见文献［１８］．反应设置阴性对照
组，取 ４ μＬ ＰＣＲ产物经 １．２％（ｍ ／ ｖ）琼脂糖凝胶电
泳检测产物及其纯度．
使用 ＤＣｏｄｅＴＭ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓ⁃
ｔｅｍ（Ｂｉｏ⁃Ｒａｄ） ，在８％的聚丙烯酰胺和变性梯度为
表 １　 ＰＣＲ扩增所用引物
Ｔａｂｌｅ １　 Ｐｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
巢式 ＰＣＲ
Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ
引物
Ｐｒｉｍｅｒｓ
序列（５′⁃３′）
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ （５′⁃３′）
参考文献
Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ
第一步 ＦＧＰＨ１９ ＴＡＣＧＧＣＡＡＲＧＧＴＧＧＮＡＴＨＧ ［１６］
Ｆｉｒｓｔ ｓｔｅｐ ＰｏｌＲ ＡＴＳＧＣＡＴＣＡＴＹＴＣＲＣＣＧＧＡ ［１７］
第二步 ＡＱＥＲ ＧＡＣＧＡＴＧＴＡＧＡＴＹＴＣＣＴＧ ［１７］
Ｓｅｃｏｎｄ ｓｔｅｐ ＰｏｌＦ⁃ＧＣ∗ ＴＧＣＧＡＹＣＣＳＡＡＲＧＣＢＧＡＣＴＣ ［１７］
Ｒ＝Ａ ／ Ｇ； Ｎ＝Ａ ／ Ｇ ／ Ｃ ／ Ｔ； Ｈ＝Ｔ ／ Ｃ ／ Ａ； Ｙ＝Ｃ ／ Ｔ； Ｓ ＝Ｇ ／ Ｃ． ∗ ＧＣ 夹 ＧＣ
ｃｌａｍｐ ＣＧＣＣＣＧＣＣＧＣＧＣＣＣＣＧＣＧＣＣＣＧＧＣＣＣＧＣＣＣＣＣＧＣＣＣＣ．
４０％～ ６５％凝胶上进行电泳 ［ １００％变性胶含用 ７
ｍｏｌ·Ｌ－１尿素和 ４０％（ｖ ／ ｖ）去离子甲酰胺］．胶厚度
为 １ ｍｍ，电泳缓冲液为 １×ＴＡＥ．在 ６０ ℃、８０ Ｖ 条件
下电泳 １４ ｈ 后，ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎⅠ染色 ３０ ｍｉｎ，用 Ｇｅｌ
ＤｏｃＴＭ ＥＱ凝胶成像系统（Ｂｉｏ⁃Ｒａｄ， ＵＳＡ）拍照保存，
并使用 Ｑｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ ４．５．１ 软件（Ｂｉｏ⁃Ｒａｄ， ＵＳＡ）进
行分析．
１􀆰 ４􀆰 ４土壤固氮细菌丰度分析 　 用 ＣＦＸ９６ＴＭ Ｒｅａｌ⁃
Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ⁃Ｒａｄ， ＵＳＡ）仪器对土壤固氮微生
物 ｎｉｆＨ基因进行荧光定量 ＰＣＲ扩增，每个样品 ３次
重复，引物为 ＡＱＥＲ和 ＰｏｌＦ，２０ μＬ反应体系组成如
下：２×ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ １０ μＬ，５０ μｍｏｌ·Ｌ－１上
游和下游引物各 ０．２ μＬ，模板 ＤＮＡ １．０ μＬ，无菌双
蒸水 ８．６ μＬ．荧光定量 ＰＣＲ 条件：９５ ℃预变性 １０
ｍｉｎ；９５ ℃变性 １５ ｓ，５５ ℃退火 １０ ｓ，７２ ℃延伸 １５ ｓ，
３５ 个循环；溶解曲线过程 （ ６５ ℃ 到 ９５ ℃， ０􀆰 ２
℃·ｓ－１）．标准曲线制作：将测序获得的已知种属的阳
性克隆子扩增培养后提取质粒 ＤＮＡ，经 Ｎａｎｏｄｒｏｐ®
ＮＤ⁃１０００ 测定， ｎｉｆＨ 基因重组质粒浓度为 ３０１
ｎｇ·μＬ－１，计算其拷贝数为 ８．１８×１０１０ ｃｏｐｉｅｓ·μＬ－１，
以 １０ 倍梯度对重组质粒进行梯度稀释 （ １０－３ ～
１０－８），每个梯度 ３ 次重复，所得标准曲线扩增效率
（Ｅ）为 ９７．３％，相关系数（Ｒ２）为 ０．９９９．
１􀆰 ４􀆰 ５ ＤＧＧＥ 条带测序和系统发育分析　 选取发生
主要变化的条带切割，置于 １．５ ｍＬ 离心管中，加入
５０ μＬ无菌去离子水，４ ℃，过夜．用 ＰｏｌＦ（不含 ＧＣ
夹）和 ＡＱＥＲ 引物扩增， ＰＣＲ 产物用纯化试剂盒
（Ｔａｋａｒａ）纯化后与 ｐＥＡＳＹ⁃Ｔ３ Ｖｅｃｔｏｒ（全金式生物技
术公司，北京）连接，转化到 Ｔｒａｎｓ１⁃Ｔ１ 感受态细胞
中，涂在含有 Ｘ⁃Ｇａｌ、ＩＰＴＧ、氨苄青霉素的 ＬＢ 琼脂平
板上进行蓝白班筛选，用菌落 ＰＣＲ方法检测阳性克
隆子．阳性克隆菌液送上海生工生物技术公司进行
测序，序列通过 ＮＣＢＩ 进行 Ｂｌａｓｔ 比对分析，获取相
近典型菌株序列．然后利用 Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ １．８１ 和 Ｍｅｇａ
４􀆰 ０中的邻接法建立固氮微生物 ｎｉｆＨ基因的系统发
育树．将所得序列提交 ＧｅｎＢａｎｋ（ＮＣＢＩ）数据库得到
序列号：ＫＰ２２２２４９～ＫＰ２２２２５９．
１􀆰 ５　 数据处理
采用 Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ ２００３软件对数据进行处理
和绘图，ＳＰＳＳ １８．０ 分析相关性（Ｐｅａｒｓｏｎ 法），采用
Ｑｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ 进行 ＤＧＧＥ 指纹图谱分析， 采用
ＣＡＮＯＣＯ ４．５．１ 软件对 ＤＧＧＥ 揭示的细菌群落结构
进行主成分分析（ＰＣＡ），并结合环境因子进行冗余
分析（ ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ ａｎａｌｙｓｉｓ，ＲＤＡ）；使用多样性指数
３６９２１０期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 何冬华等： 集约经营对毛竹林土壤固氮细菌群落结构和丰度的影响　 　 　 　 　 　
表 ２　 长期集约经营毛竹林土壤理化性质
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｓｏｉｌ ｐｈｙｓｉｃａｌ ａｎｄ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｍｏｓｏ ｂａｍｂｏｏ ｓｔａｎｄｓ ｕｎｄｅｒ ｌｏｎｇ⁃ｔｅｒｍ ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ
处理
Ｔｒｅａｔ⁃
ｍｅｎｔ
ｐＨ（Ｈ２Ｏ） 有机质
Ｏｒｇａｎｉｃ ｍａｔｔｅｒ
（ｇ·ｋｇ－１）
碱解氮
Ａｖａｉｌａｂｌｅ Ｎ
（ｍｇ·ｋｇ－１）
速效磷
Ａｖａｉｌａｂｌｅ Ｐ
（ｍｇ·ｋｇ－１）
速效钾
Ａｖａｉｌａｂｌｅ Ｋ
（ｍｇ·ｋｇ－１）
硝态氮
ＮＯ３ － ⁃Ｎ
（ｍｇ·ｋｇ－１）
铵态氮
ＮＨ４ ＋ ⁃Ｎ
（ｍｇ·ｋｇ－１）
ＣＫ ４．４８±０．０１ ４０．２４±３．１２ ７２．７２±１．２１ １．１４±０．０７ ３６．６７±４．０４ １９．３１±１．０５ １７．７±２．１７
１０ ａ ４．１５±０．１２ ５６．０４±１．７１ １２１．０３±９．７８ １．７４±０．６４ ３１．３３±０．５８ １３．０３±１．４０ １６．３５±３．０２
１５ ａ ４．１０±０．０６ ４３．２０±１．２５ ８１．４７±３．７０ ２．０１±０．１７ ３４．３３±０．５８ ４０．５８±２．８５ １８．４４±１．５３
２０ ａ ４．１６±０．１４ ３８．５０±７．４３ ７０．７６±０．７５ ２．２４±１．２２ ４８．５０±０．７１ ５２．０２±６．２４ １８．４３±０．９８
２５ ａ ３．９９±０．０８ ４３．７０±３．８１ ９３．４０±１．０ ２．８９±０．０１ ６８．５０±７．７８ ７８．２２±１．８９ ２１．９０±３．１６
来评价微生物群落的多样性［１９］，其计算公式为：
Ｈ ＝－ ∑（ｎｉ ／ Ｎ）ｌｎ（ｎｉ ／ Ｎ）
式中：ｎｉ为每条电泳条带光密度峰值；Ｎ 是同一泳道
中所有条带光密度峰值总和，电泳条带光密度峰值
通过 Ｑｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ 软件获取．
２　 结果与分析
２􀆰 １　 土壤理化性质
不同集约经营历史毛竹林土壤样品的理化性质
结果见表 ２．随着集约经营年限的增加，土壤 ｐＨ 整
体呈下降趋势，而土壤速效磷、速效钾和硝态氮含量
逐步增加；土壤有机质和碱解氮在集约经营 １０年时
比对照高，其余年限变化不大．与硝态氮不同，铵态
氮在不同经营年限土壤中变化较小．
２􀆰 ２　 长期集约经营对土壤固氮细菌丰度的影响及
其与土壤理化性质的关系
采用荧光定量 ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）检测不同集约经营
年限毛竹林土壤固氮微生物 ｎｉｆＨ 基因丰度的变化，
每克干土的 ｎｉｆＨ基因丰度处于 １．９３×１０６ ～ ４．３０×１０６
个拷贝数之间（图 １）．土壤固氮功能 ｎｉｆＨ基因的拷贝
数随着经营时间的延长，表现为先下降后回升的规
律，１５年时达最低值，此后固氮细菌数量开始增加，
但２５年时土壤固氮微生物ｎｉｆＨ基因丰度还是低于
图 １　 长期集约经营毛竹林土壤固氮细菌 ｎｉｆＨ基因丰度
Ｆｉｇ．１　 Ａｂｕｎｄａｎｃｅ ｏｆ ｎｉｆＨ ｇｅｎｅ ｉｎ ｓｏｉｌｓ ｏｆ ｍｏｓｏ ｂａｍｂｏｏ ｓｔａｎｄｓ
ｕｎｄｅｒ ｌｏｎｇ⁃ｔｅｒｍ ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ．
对照组．利用 ＳＰＳＳ软件分析了 ｎｉｆＨ基因数量与土壤
理化性质的相关性，结果显示，土壤固氮细菌 ｎｉｆＨ
基因数量与土壤硝态氮含量呈显著负相关性（ ｒ ＝
－０．５２３，Ｐ＜０􀆰 ０５），但是与其他指标之间没有显著相
关性．
２􀆰 ３　 长期集约经营下土壤固氮细菌群落结构和多
样性的变化
ＤＧＧＥ结果如图 ２ 所示，不同处理土壤样品在
ＤＧＧＥ图谱中电泳条带的数目、亮度、迁移的位置均
存在一定程度的差异．５个处理中，共出现 ２３条不同
位置的条带，对照以及不同集约经营时间毛竹土壤
ｎｉｆＨ基因片段依次为 １４、１２、８、１１ 和 １３ 条，条带数
目随着集约时间的变化规律与 ｎｉｆＨ 基因的拷贝数
一致，先下降后回升．虽然分析集约过程中条带变化
发现，条带 ９ 和 １８ 是所有样品的共性条带，其中条
带 ９亮度明显高于其他条带，说明对应的固氮细菌
是所有土壤中的绝对优势物种．而条带 ３、４、１３、１４
对应的种群在集约经营后的 １５ 年消失，但在 ２５ 年
后又出现；而条带１０和２０等对应的固氮细菌主
图 ２　 毛竹林土壤固氮细菌群落的 ＤＧＧＥ分析
Ｆｉｇ．２　 ＤＧＧＥ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｏｉｌ ｎｉｔｒｏｇｅｎ⁃ｆｉｘｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｏｍｍｕｎｉ⁃
ｔｙ ｉｎ Ｐｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌａ ｓｔａｎｄｓ．
４６９２ 应　 用　 生　 态　 学　 报　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 ２６卷
表 ３　 长期集约经营毛竹林土壤细菌多样性指数
Ｔａｂｌｅ ３　 Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｉｎｄｉｃｅｓ ｏｆ Ｎ２ ⁃ｆｉｘｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａ ｉｎ ｓｏｉｌｓ ｏｆ
ｍｏｓｏ ｂａｍｂｏｏ ｓｔａｎｄｓ ｕｎｄｅｒ ｌｏｎｇ⁃ｔｅｒｍ ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ
处理
Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
Ｓｈａｎｎｏｎ 指数
Ｓｈａｎｎｏｎ
ｉｎｄｅｘ （Ｈ）
均匀度指数
Ｅｖｅｎｎｅｓｓ
ｉｎｄｅｘ （Ｅ）
丰富度指数
Ｒｉｃｈｎｅｓｓ
ｉｎｄｅｘ （Ｄ）
ＣＫ ２．５３±０．２８ ０．９６±０．０６ １．４１±０．１９
１０ ａ ２．２３±０．３９ ０．８９±０．０９ １．２１±０．２３
１５ ａ １．４９±０．４９ ０．７２±０．１２ ０．７４±０．２８
２０ ａ １．９６±０．３５ ０．８２±０．０９ １．０５±０．１９
２５ ａ ２．３６±０．１６ ０．９２±０．０４ １．２８±０．１０
要出现在 １５年和 ２０年．说明随着集约经营的进行，固
氮细菌的种类及其对应的数量均有一定程度的回升．
　 　 根据 ＤＧＧＥ图谱中每条条带的位置和亮度，对
不同集约经营历史毛竹林土壤固氮细菌 ｎｉｆＨ 基因
多样性指数进行分析．从表 ３ 可以看出，ＣＫ 处理的
Ｓｈａｎｎｏｎ多样性指数、均匀度指数和丰富度指数均
高于集约经营的 ４ 个处理；经营 １０ 年和 １５ 年林地
各相应指数均不同程度的降低，而到了 ２０ 年和 ２５
年均有所恢复．表明随着集约经营年限的增加，多样
性指数先减少后增加，施肥初期抑制了固氮细菌的
多样性．
２􀆰 ４　 供试土壤固氮细菌群落结构与环境因子的冗
余分析及土壤理化因子间的相关分析
以 ＤＧＧＥ条带为响应变量组———物种 （ ｓｐｅ ⁃
图 ３　 毛竹林土壤固氮细菌群落结构的冗余分析
Ｆｉｇ．３　 Ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｎｉｔｒｏｇｅｎ⁃ｆｉｘｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｏｍｍｕ⁃
ｎｉｔｙ ｉｎ ｓｏｉｌｓ ｏｆ Ｐｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌａ ｓｔａｎｄｓ．
ＡＮ：碱解氮 Ａｖａｉｌａｂｌｅ Ｎ； ＡＫ：速效钾 Ａｖａｉｌａｂｌｅ Ｋ．下同 Ｔｈｅ ｓａｍｅ ｂｅｌｏｗ．
ｃｉｅｓ），以理化性质作为解释变量———环境因素（ｅｎ⁃
ｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ），从 ７个环境因子（表 ２）中筛选出 ４ 个
变量分别是：速效钾、碱解氮、铵态氮和硝态氮，对不
同集约年限毛竹林土壤 ＤＧＧＥ 条带的冗余分析（ｒｅ⁃
ｄｕｎｄａｎｃｙ ａｎａｌｙｓｉｓ， ＲＤＡ）结果如图 ３所示．
此二维排序图中，样本与环境因子反映在同一
个图上，便于直观地看出物种分布与环境变量间以
图 ４　 基于毛竹林土壤固氮细菌 ＤＧＧＥ条带序列的 Ｎ⁃Ｊ系统发育树
Ｆｉｇ．４　 Ｎｅｉｇｈｂｏｒ⁃ｊｏｉｎｉｎｇ ｔｒｅｅ ｏｆ ｎｉｔｒｏｇｅｎ⁃ｆｉｘｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌａ ｓｔａｎｄｓ．
５６９２１０期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 何冬华等： 集约经营对毛竹林土壤固氮细菌群落结构和丰度的影响　 　 　 　 　 　
及与样本三者之间的关系．ＣＫ 与 １０ 年样地较为接
近，集约经营 １５ 年和 ２０ 年土壤固氮细菌群落结构
在第一排序轴上与 ＣＫ 差异较大，而 ２５ 年样地与
ＣＫ的变异较小，主要在第二排序轴上存在差异，表
明长期的集约经营导致样品土壤中固氮群落结构发
生了较大的改变．根据 Ｃａｎｏｃｏ的 ｆｏｒｗａｒｄ分析及蒙特
卡洛置换检验，７ 个环境因子中 ４ 个因子与群落结
构相关性较大，其中土壤速效钾含量与固氮菌群落
的相关性最强（Ｐ ＝ ０． ０８６），但未达显著水平（Ｐ ＞
０􀆰 ０５），土壤硝态氮、碱解氮和铵态氮含量的影响虽
然也未达显著水平（Ｐ＞０．０５），但大于其他环境因
子．ＲＤＡ分析结果显示，土壤速效钾和铵态氮对 ２５
年样地固氮细菌影响最大，硝态氮对 ２０年样地固氮
细菌影响最大，而碱解氮则对 ＣＫ 和 １０ 年样地固氮
细菌均有影响．第一排序轴（Ａｘｉｓ １）和第二排序轴
（Ａｘｉｓ ２）分别解释了样本中 ２０．１％和 １１．２％的变异，
两个排序轴共解释了 ３１．３％的总变异．选取筛选出
来的 ４组环境因子进行相关分析发现，速效钾与硝
态氮的含量呈极显著相关，铵态氮与硝态氮、速效钾
的含量显著相关，说明毛竹林地土壤中理化因子相
互关联，共同影响固氮微生物的组成．
２􀆰 ５　 土壤固氮菌 ｎｉｆＨ基因测序及系统发育分析
利用 ＭＥＧＡ ４．０ 软件基于 ＤＧＧＥ 条带序列，进
行 Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ验证系统发育分析，邻接法（ ｎｅｉｇｈｂｏｒ⁃
ｊｏｉｎｉｎｇ， Ｎ⁃Ｊ）构建系统发育树，结果如图 ４．从系统发
育树可见，集约经营毛竹林土壤中的固氮菌群种群
多样性较为单一，１１个条带的近源种均归类于不可
培养细菌（ ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ） ｎｉｆＨ 基因片段，与
慢生根瘤菌（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．）亲缘关系较近．对
照组土壤中主要固氮菌种群（条带 ４、９、１９）与已知
的脱氮慢生根瘤菌株 （ Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ
ｓｔｒａｉｎ）的遗传距离较近．
３　 讨　 　 论
毛竹林长期集约经营过程中土壤呈酸化现象
（表 ２），而速效养分总体呈积累趋势．土壤有机质和
碱解氮同步振荡变化的规律：集约经营早期先增加
（１０ 年）、后下降（１５ 年和 ２０ 年）、最后又回升（２５
年）．１０ 年毛竹林土壤有机质和碱解氮均明显提高，
可能是由于施肥初期结合翻耕促进了土壤中地下鞭
根的分解，因为其在没有施肥和翻耕的情况下分解
很慢；另一方面，施肥促进毛竹生长，增加根系分泌
量，使土壤有机质和碱解氮同步增加．继续施肥和翻
耕使有机质进一步分解，土壤有机质和碱解氮逐渐
下降．而 ２５ 年时有机质的小幅回升，可能与毛竹生
产量提高后，枯落物和根系分泌物的增加有关，此
外，碱解氮的明显提高还与长期施用氮肥有关． ２５
年时土壤有效磷、速效钾和硝态氮含量是对照的 ２～
４倍，然而对于集约经营的竹林而言，土壤有效氮、
磷、钾水平并不高，特别是磷低于 ３ ｍｇ·ｋｇ－１，根据
土壤养分分级指标［２０］，该地属于严重缺磷等级．本
试验得到的不同集约经营毛竹林土壤固氮菌门类与
李刚等［２１］发现呼伦贝尔沙地混播模式下土壤固氮
菌群落结构主要隶属于变性菌门具有一致性，文都
日乐等［２２］研究发现呼伦贝尔草原土壤固氮菌也有
类似的结果，且其发现慢生根瘤菌是主导菌群，说明
在一定的分类水平上毛竹林与草原土壤固氮菌种群
具有相同之处．然而，该地区毛竹林土壤大多数固氮
菌属于未能培养的类群，其生理特性未知，要确定其
种属和具体的生态功能还需要进一步的研究．
实时荧光定量 ＰＣＲ 和 ＰＣＲ⁃ＤＧＧＥ 分析结果一
致，随着集约经营时间增加，土壤固氮细菌功能基因
的丰度和多样性指数均表现为先下降后回升的规
律，主成分分析结果显示，ＣＫ、１０ 年和 ２５ 年的处理
群落结构有较高的相似度，而 １５ 年和 ２０ 年则与前
一组差异较大，其中 １５ 年样地与所有处理差异最
大．秦华等［７］对雷竹林长期集约经营（１５ 年）研究发
现，随着集约经营时间增加，土壤氨氧化古菌活性和
丰度均有恢复的趋势，类似的现象也发生在设施蔬
菜栽培过程中的土壤氨氧化细菌丰度变化［２３］ ．已有
研究表明，植被类型和土壤性质均能影响土壤固氮
菌［９］，文都日乐等［２２］对呼伦贝尔 ５种草地类型土壤
固氮微生物 ｎｉｆＨ 基因多样性及群落结构特征的研
究表明，不同草地之间土壤固氮微生物差异明显，这
不仅是植物的影响，土壤性质的差异也是原因之一．
本研究毛竹林集约经营过程中，只有初期因为施肥、
除去林下杂草和灌木使植物群落发生变化，３ 年之
后林下基本无植被，因此，后期阶段土壤性质的变化
是影响土壤固氮细菌的主要因素．可能是因为毛竹
林地固氮菌群在前期对环境的生态适应机制偏向于
Ｒ⁃对策种群，使得群落数量的变化随着环境的细微
变化发生较大的变动，而随着经营年限的延长，其又
偏向于 Ｋ⁃对策转变，群落数量迈向恢复的趋势．
冗余分析发现，土壤速效钾和铵态氮对 ２５年样
地固氮细菌影响最大，硝态氮对 ２０年样地固氮细菌
影响最大，而碱解氮则对 ＣＫ和 １０ 年样地固氮细菌
均有影响．但以上冗余分析结果以及毛竹林植被的
变化规律均不能很好地解释土壤固氮菌随着集约经
６６９２ 应　 用　 生　 态　 学　 报　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 ２６卷
营时间先下降后回升的规律的变化，可能是因为各
影响因素之间相互作用太复杂之故．土壤固氮细菌
对集约经营干扰的响应总体表表现为抵抗（ ｒｅｓｉｓｔ⁃
ａｎｃｅ）和恢复（ ｒｅｓｉｌｉｅｎｃｅ）的现象．许多研究证明，微
生物具有对环境干扰的抵抗和恢复的本能［２４－２６］，
Ｄｅｎｇ等［２７］发现，低浓度笓污染土壤中甲烷氧化细
菌仍具有恢复力，且其多样性增加，但高浓度笓污染
土壤时甲烷氧化细菌的多样性下降，且不再恢复，表
明干扰强度过大可超出微生物的恢复能力． Ｆｒｅｎｋ
等［２５］应用处理污水和清水灌溉对土壤细菌群落结
构的影响为期 ３ 年的试验发现，短期内处理污水的
季节灌溉能改变土壤微生物群落结构，而 ３ 年试验
结束时，虽然处理污水灌溉的土壤养分积累明显，但
其细菌群落结构与清水灌溉土壤没有差异．微生物
对环境干扰的抵抗和恢复现象通常发生在干扰因子
消失后，土壤微生物能回复到起始的状态；而毛竹集
约经营则持续进行，干扰因子没有消失，土壤固氮细
菌同样也出现抵抗和恢复现象．说明在某种干扰持
续存在的情况下，土壤固氮细菌也有一定的抵抗和
恢复能力．处理污水灌溉的土壤养分积累明显［２５］，
说明干扰消失后土壤性状没有完全回复到起始状
态．本研究毛竹林集约经营过程中土壤养分的积累
与 Ｆｒｅｎｋ等［２５］情况类似，毛竹林的集约经营对土壤
固氮细菌的干扰强度不是很大，推测 ２５年后的某个
阶段土壤固氮细菌能可能恢复到对照的状态．
４　 结　 　 论
长期集约经营过程中土壤固氮细菌群落结构、
多样性及数量发生了变化，集约经营初期劈除林下
杂灌、施肥、翻耕等措施导致固氮细菌 ｎｉｆＨ 基因多
样性和数量均呈现显著降低，而随着经营年限的增
加多样性和丰度有所恢复，但仍旧低于初期水平．长
期而言，现有的集约经营措施不会对土壤固氮细菌
产生不良影响，但土壤的酸度和有效磷水平偏低，建
议改良土壤酸度以提高有效磷水平，或将过磷酸钙
改为钙镁磷肥．
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ｍｕｎｉｔｙ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｓ ｉｎ Ｐａｃｈｉｃ Ｕｄｉｃ Ａｒｇｉｂｏｒｏｌｌ
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作者简介　 何冬华，男， １９８８年生，硕士研究生． 主要从事土
壤生物与生物化学研究． Ｅ⁃ｍａｉｌ： ｚｊｎｌｄｘｈｄｈ＠ １６３．ｃｏｍ
责任编辑　 肖　 红
８６９２ 应　 用　 生　 态　 学　 报　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 ２６卷