全 文 ：* 湖南省高校青年骨干教师项目资助
**通讯作者
收稿日期：2004-11-30 改回日期：2004-12-31
活性污泥中微生物种群特性及对底物降解的影响研究*
聂艳秋 周 青**
（湖南工学院建工系 衡阳 421101）（江南大学工业生物技术教育部重点实验室 无锡 214036）
摘 要 简介了分离微生物培养基的选择以及PCR、ERIC、DGGE、TGGE、FISH、T-RFLP等种群特性测定方法，阐
述了活性污泥微生物的种群多样性、结构稳定性和功能稳定性等特性，指出活性污泥微生物种群多样性是结构稳定
性的基础，而结构稳定性是功能稳定性的前提，功能稳定性又是底物有效降解的保证；同时底物及环境因子的变化也影
响活性污泥群落结构及功能的稳定，并可能使种群多样性发生变化，结构稳定性与功能稳定性二者变化并不同步。
关键词 污水处理 种群特性 测定方法
PopulationcharacterizationofLicroorganisLinactivatedsludgeanditsinfluenceonsubstratedegradation.NIEYan-
Qiu（DepartmentofArchitectureEngineering，HunanInstituteofTechnology，Hengyang421101，China），ZHOUQing
（TheKeyLab.ofIndustrialBiotechnology，MinistryofEducation，SouthernYangtzeUniversity，Wuxi214036，China），
CJEA，2005，13（4）：25~28
Abstract ThechoiceofculturemediumofmicrobialisolationandmeasuringtechnologiesincludingPCR，ERIC，DGGE，
TGGE，FISHandT-RFLPareintroducedbriefly.Then，themicrobialpopulationcharacterizationsintheactivated
sludge，i.e.microbialdiversity，microbialcommunitystructurestabilityanditsfunctionstabilityarestated.Finaly，itis
pointedoutthatthemicrobialdiversityintheactivatedsludgeisthebaseofitscommunitystructurestabilitywhichisthe
preconditionofitsfunctionstabilitybeingtheguaranteeofefectivesubstratedegradation.Inreverse，thevarietyofsub-
strateandenvironmentfactorwilalsoafectthestabilityofcommunitystructureandfunction，andmaymakethepopula-
tiondiversitychange.Thechangeofthemicrobialcommunitystructurestabilitydoesntkeepinstepwiththatofitsfunc-
tionstability.
Keywords Wastewatertreatment，Populationcharacter，Measurementmethod
（ReceivedNov.30，2004；revisedDec.31，2004）
活性污泥处理污水过程实际是微生物对污水中底物的降解过程，深入了解活性污泥微生物的种群特
性，有助于提高污水处理系统效能，降低污水处理成本。本研究综述了污水处理生物反应器中活性污泥微
生物种群特性及群落结构的最新测定方法，初步探讨了活性污泥微生物种群间关系及微生物种群与底物间
的相互影响。
1 微生物种群特性及群落结构测定
活性污泥中微生物种群多样性、结构稳定性和功能稳定性在维护污水处理系统有效性中起着重要作
用。表示微生物种群特性的主要参数有指纹图谱条带数、操作分类单元数（Operationaltaxonomicunit，
OTU）、生物多样性指数（Diversityindex，H）和配对相似性系数（Pairwisesimilaritycoeficient，Cs），生物多
样性指数（H）与配对相似性系数（Cs）计算［6］式为：
HE-∑（ni／N）ln（ni／N） （1）
CsE2j／（a+b）*100 （2）
式中，ni为每个波峰面积，N为所有波峰面积，a、b为DNA指纹图谱的条带数目，j为2个图谱中共有的条
带数目。
1.1 微生物群落结构测定方法
培养基。为观察微生物种群特性，需对活性污泥样品进行培养。以含苯污水处理为例，对苯酚降解菌
第13卷第4期 中 国 生 态 农 业 学 报 Vol.13 No.4
2005年10月 ChineseJournalofEco-Agriculture Oct.，2005
进行培养的批式富集培养结合选择性培养基回收方法效果较差，不能把系统中优势功能菌分离出来。高平
平等［1］采用4种不同培养基分离焦化污水处理厂曝气池活性污泥中优势功能菌群发现，不同培养基回收优
势菌的能力不同，以污水为基础的培养基从活性污泥中回收的优势菌种群最多（30.8%~42.9%），表明用
合成培养基得到的降解菌并非完全是生态环境中优势功能菌。陈敏等［2］采用3种培养基进行上述实验并
对分离物进行种群多样性研究表明，以组成酵母抽提物为0.2%、蛋白胨0.1%、葡萄糖0.2%、pH7.0~7.5
的培养基比其他2种培养基更合适。同一曝气池活性污泥样品由于采用培养基不同，所观察到的细菌种群
多样性也不同。因此评价不同分离技术效果时，其关键是看该培养基能否从环境样品中分离到代表菌、优
势菌或主要功能菌［7］。
测定方法。传统测定方法检测速度慢且准确性差，难以及时指导生产实践。以聚合酶链反应（Poly-
merasechainreaction，PCR）技术为主的分子生物学方法因其快速、灵敏特点而被广泛应用。利用分子生物
学技术可及时监测微生物群落结构在不同冲击负荷下动态变化，进而可系统地优化群落结构并对群落结构
失调给出早期预警。肠细菌基因间共有重复序列（Enterobacterialrepetitiveintergenicconsensus，ERIC）最初
是在部分革兰氏阴性菌基因组中发现的（长度为126bp），以多拷贝形式存在于细菌基因组非编码区的反向
重复序列。该序列在细菌染色体上分布多态性允许设计特异引物对其进行扩增，并形成具种、属、菌株特异
性指纹图谱，以该序列中心保守区域（44bp）设计反向引物，无论进行纯菌还是混合细菌菌群基因组DNA扩
增，均能得到对模板遗传组成有足够敏感性和重复性好的ERIC-PCR指纹图谱，现已被广泛用于纯培养细
菌鉴别、分类、基因组多态性和系统进化等方面研究［3］；变性梯度凝胶电泳（Denaturinggradientgelelec-
trophoresis，DGGE）和温度梯度凝胶电泳（Temperaturegradientgelelectrophoresis，TGGE）为DNA指纹图谱
技术，因其可对长度一致、但碱基序列不同的DNA片段进行有效分离，该技术最初被用于基因点突变研究，
在有关TGGE／DGGE环境样品研究中通常用指纹图谱中条带数目多少反映微生物种群多样性，用条带染色
强度反映不同细菌种群丰度［4］；荧光原位杂交（Fluorescenceinsituhybridization，FISH）是利用特异DNA探
针，标以生物素、地高辛和荧光素，并进行原位杂交，其杂交定位信号用荧光显示，该方法敏感性强，操作简
易，可迅速得出结果，探针标记后稳定［5］；末段限制性片段长度多态性（Terminalrestrictionfragmentlength
polymorphism，T-RFLP）与末端限制性片段分析（Terminalrestrictionfragmentanalysis，TRFA）是指用限制
性内切酶切割不同个体基因组DNA后，含同源序列酶切片段在长度和数量的差异，为扩大T-RFLP使用范
围，可应用PCR技术，使原来不涉及限制性内切酶识别位点的DNA变异并适用于T-RFLP，其方法是在突
变位点附近设计1个引物，便于扩增后能被酶解［5］。
1.2 微生物种群特性
活性污泥微生物多样性是指一定时间活性污泥中所有种类微生物基因总和，对不同活性污泥采用一定
测试方法可得到相应种群多样性参数。陈敏等［2］对焦化污水处理系统活性污泥培养基分离物扩增，并用限
制性内切酶对PCR产物进行扩增rDNA限制性分析（AmplifiedrDNArestrictionanalysis，ARDRA）得出14
种不同操作分类单元数。高平平等［4］采用TGGE图谱研究同一系统得出9条主要条带，并从每条带选4个
转化子进行序列分析结果显示TGGE条带是由序列不同的片段组成，32个序列在97%相似性下分成16个
操作分类单元数。MartinEschenhagena等［8］用FISH技术和T-RFLP对具脱P功能的活性污泥中微生物种
群分子特性分析表明，起脱P作用的有机体不只1种，Tetrasphaeraspp.为主要聚P菌，其他可能聚P菌如
Microlunatus，Rhodocyclus也被检出。活性污泥微生物群落结构是指一定时间活性污泥中各种微生物组
成，群落结构稳定性是功能稳定性前提，因而对结构稳定性测定尤显重要。MartinEschenhagena等［8］比较2
个实验工厂活性污泥中聚P菌组成发现，二者存在微小差别，这表明运行模式不同，微生物群落结构亦不
同。高平平等［4］用TGGE技术对2个曝气池细菌种群动态变化测定结果发现，同一曝气池活性污泥的
16SrDNAV3-PCRTGGE指纹图谱基本一致，图谱间配对相似性系数为100%，且同一曝气池不同位点活
性污泥TGGE指纹图谱也完全一致，但功能不同曝气池活性污泥TGGE指纹图谱存在差异，配对相似性系
数为83.3%。高平平等［3］对焦化污水处理系统AB（污水二段生物处理）工艺2个曝气池微生物群落结构分
析表明，污水污染物负荷，特别是化学耗氧量（CODcr）发生一定程度变化，甚至出现矿物油冲击造成污泥不
能沉降和CODcr去除受阻，但ERIC-PCR指纹图谱反映出的系统微生物群落结构较稳定，苯酚和氰化物去
除效率变动并不剧烈。StamperDavidM.等［9］对膜生物反应器（Membranebioreactor，MBR）观察发现，水质
变化大时微生物种群变化较大，依据分析方法不同，种群间长期相似性为0%~25%，细菌种群虽不稳定，但
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膜生物反应器去除效率均达90%。ForneyL.J.等［10］认为微生物种群结构和功能不同归因于污水成分、污
水处理厂运行或活性污泥收藏后的操作不同，且活性污泥样品间存在时空差异，采用葡萄糖-蛋白胨混合物
培养35d后活性污泥结构发生明显变化，种群对底物利用以及采用DGGE和TRFA分析优势种群的
16SrDNA区别均很明显。KlattChristianG.等［11］利用2级厌氧膜生物反应器处理人工合成城镇污水对其
中微生物DGGE种群分析表明，稳定种群的变化在运行前7d即已开始，黄质菌属占种群主要部分（>50%
总带强度）。CarolinaCasserly等［6］研究发现上流式厌氧污泥床（Upflowanaerobicsludgebed，UASB）启动期
间细菌群落结构有较大变化，但细菌多样性仅少许增加，不同产CH4菌相对丰度有较大变化，故细菌16S
rRNA／细菌16SrDNA比率与允许最大有机负荷率相关，纠正了过去将许多厌氧污水处理系统失败归于缺
乏足够接种体的认识。活性污泥微生物种群功能性是指微生物对底物降解性能，是污水处理最直接利用的
种群特性。AnnetteF.Muttray等［12］对纸浆污水处理系统中复杂种群（树脂酸降解菌）———假单胞菌“Abi-
etaniphila”牛皮纸漂白厂污水（Bleachedkraftmilefluent，BKME-9）特性研究发现连续培养时，rRNA／rDNA
与BKME-9生长速率呈线性负相关。批培养时在BKME-9早期指数生长期间rRNA／rDNA有一峰值，突然
加碱后BKME-9的rRNA／rDNA值下降，pH冲击过后伴随BKME-9代谢活性和种群恢复，系统对树脂酸的
降解活性恢复。GavinColins等［13］采用厌氧颗粒污泥处理基于挥发性脂肪酸（Volatilefatacid，VFA）的人
工合成污水（负荷率为COD5kg／m3·d、环境温度18࠷、90d）试验表明，耐寒性生物发育良好。
2 微生物生长与底物降解的相互影响
不同生物反应器中由于生态环境不同，微生物种类、数量和代谢活性等方面均不相同，微生物之间、微
生物与其底物及环境因子之间形成了相互联系、相互制约的动态平衡体系，这种动态平衡形成和变化直接
影响着工艺运行效果。一是纵向影响，纵向影响定义为底物（环境因子）、细菌、原（后）生动物之间相互作
用。KlattChristianG.等［11］利用2级厌氧膜生物反应器处理污水，在膜生物反应器中加入淀粉、凝胶、聚乙
二醇、山梨聚糖和油酸后发现，膜生物反应器中细胞生物量增加，随之污染物去除率增加，出水COD、蛋白质
和糖类浓度降低，反过来促进了以胞外酶为中介的多糖（葡萄糖苷酸）和蛋白质（亮氨酸、氨基肽酸）水解。
GhyootWouter等［14］采用2级膜生物反应器去除有机物、N及P时发现，第1级大多数N、P靠生物结合去
除；第2级由于原、后生动物对功能菌过度掠食，导致N、P释回水中，出水溶解性CODcr增加。LuxmyB.S.
等［15］采用膜生物反应器处理污水，当pHE6，后生动物数多且稳定（1000~2000个／mL）时污泥积聚高，且
有大量后生动物粘附膜上，跨膜压力增加但比另2套（pH分别为5和7）低，因为介质为后生动物提供了合
适的小生境，后生动物特别是粘附膜上的后生动物对膜污染控制有重要意义。改变混合液悬浮固体浓度也
会带来较大影响。LuxmyB.S.等［16］研究发现随大型生物体特别是固着型和游泳型纤毛虫的增加，细菌种
群（1μm左右）减少较多，细菌数与大型生物数呈负相关，当高级生物体（原生动物和后生动物）数量高时
<10μm絮状体比例较小。活性污泥法中微型动物以掠食菌胶团、细菌营生，对控制菌胶团、减少污泥生成
量、捕食游离细菌、减少出水微生物含量和保持污泥沉降性、稳定性起着重要作用。二是横向影响，细菌种
群间相互影响主要表现为微生物之间相互提供生长因子，代谢或降解对方代谢抑制物，平衡pH，维持氧还原
电位或消除中间产物累积，解除反馈抑制等方式。厌氧过程中产CH4菌专性利用产氢、产乙酸菌代谢产物
乙酸和氢产生CH4；而产氢产乙酸菌则利用水解菌产物单糖、氨基酸、脂肪酸、甘油等产生乙酸和氢。细菌种
群间相互影响还表现在遗传信息交换，如炼油污水处理厂中萘降解质粒可以高频接合转移，使受体菌获得
降解污染物萘的性质。质粒转移可通过接合作用从携带质粒的细菌转移到无质粒细菌内，接合不受细菌种
属和质粒来源影响。质粒在污水处理厂生物相中传播，提高了污泥对环境变化抗性。三是优势种群演替的
综合作用影响，在各种污水处理反应器中优势微生物仅有几个种，其原因在于特定浓度或特定成分的水环
境适合一些种类微生物增殖，而少数种为争夺有限营养而分泌抑制性毒物，使其他微生物难以增殖。当外
界条件如水温、进水生化需氧量（BOD）、毒物负荷等发生变化时，有可能降低原有优势种代谢活性，引起新种
大量增殖形成新优势种。通过底物诱导作用，系统内混合微生物菌群出现复杂的种群演替过程，导致群落
结构改变，形成适应新环境的优势菌群，实现对资源充分利用。控制反应器运行条件可使某种或几种高效
降解菌（优势菌群）在其内占优势，同时形成多种属混合菌系协同作用的稳定生态体系，这是纵向影响与横
向影响综合作用的结果，通过高效优势降解菌与混合菌系的协同作用，进水中的有机污染物得以高效率降
解。对具体反应器而言可通过分析优势微生物种类及其环境条件改变时的群落结构变化，摸索反应器运行
时生物相不同平衡态，以实现污水处理系统的优化运行。
第4期 聂艳秋等：活性污泥中微生物种群特性及对底物降解的影响研究 27
3 小 结
活性污泥微生物具有种群多样性、结构稳定性和功能稳定性等多种特性，种群多样性是结构稳定性的
基础，而结构稳定性是功能稳定性的前提，功能稳定性又是底物降解的根本保证。反之，当底物或环境因子
突然变化，微生物功能稳定性相应改变，表明微生物群落结构发生了变化，但种群多样性的变化并不确定，
有些情况下变化较大，而有些情况下变化则较小。底物（环境因子）、细菌、原（后）生动物之间存在纵向作
用，细菌种群之间存在横向作用。根据生态学观点，环境因子对微生物个体的影响首先是影响某些敏感生
物，然后通过微生物之间相互作用逐步传递，最终当影响超过一定限度时才引起群落结构的波动。活性污
泥微生物优势种群的变化反映了群落结构的变化，是纵向影响与横向影响综合作用的结果。微生物群落结
构的改变与功能的变化并不同步，二者是否存在有规律的时差尚未见报道。
参 考 文 献
1 高平平，赵立平.微生物种群结构探针杂交评价不同培养基从活性污泥分离优势菌群的能力.微生物学报，2003，43（2）：264~270
2 陈 敏，赵立平.焦化污水处理系统中不同培养基分离的细菌种群多样性.微生物学报，2003，43（3）：366~377
3 高平平等.焦化污水处理系统微生物种群结构动态的ERIC-PCR指纹图谱分析.环境科学学报，2003，23（6）：705~710
4 高平平等.TGGE分析焦化污水处理系统活性污泥细菌种群动态变化及多样性.生态学报，2003，23（10）：1963~1969
5 蔡文琴.现代实用细胞与分子生物学实验技术.北京：人民军医出版社，2003.204~403
6 CarolinaCasserly，LeonardoErijman.MolecularmonitoringofmicrobialdiversityinanUASBreactor.InternationalBiodeterioration&
Biodegradation，2003，52：7~12
7 AlisonE.，McCaigA.，SusanJ.，etal.Impactofcultivationoncharacterisationofspeciescompositionofsoilbacteriacommunities.FEMS
MicrobiolEcol.，2001，35：37~48
8 MartinEschenhagena，MarkusSchupplerb，IsoldeRoskea.Molecularcharacterizationofthemicrobialcommunitystructureintwoactivated
sludgesystemsfortheadvancedtreatmentofdomesticefluents.WaterResearch，2003，37：3224~3232
9 StamperDavidM.，WalchMarianne，JacobsRachelN.Bacterialpopulationchangesinamembranebioreactorforgraywatertreatmentmon-
itoredbydenaturinggradientgelelectrophoreticanalysisof16SrRNAgenefragments.AppliedandEnvironmentalMicrobiology，2003，
69（2）：852~860
10ForneyL.J.，LiuJ.B.，etal.Structureofmicrobialcommunitiesinactivatedsludge：Potentialimplicationsforassessingthebiodegradabilityof
chemicals.EcotoxicologyandEnvironmentalSafety，2001，49：40~53
11KlattChristianG.，LaParaTimothyM.Aerobicbiologicaltreatmentofsyntheticmunicipalwastewaterinmembrane-coupledbioreactors.
BiotechnologyandBioengineering，2003，82（3）：313~320
12AnnetteF.Muttray，ZhontangYu，WiliamW.Mohn.PopulationdynamicsandmetabolicactivityofPseudomonasabietaniphilaBKME-9
withinpulpmilwastewatermicrobialcommunitiesassayedbycompetitivePCRandRT-PCR.FEMSMicrobiologyEcology，2001，38：21
13GavinColins，AdeleWoods，SharonMcHugh，etal.Microbialcommunitystructureandmethanogenicactivityduringstart-upofpsy-
chrophilicanaerobicdigesterstreatingsyntheticindustrialwastewaters.FEMSMicrobiologyEcology，2003，46：159~170
14GhyootWouter，VerstraeteWily.Reducedsludgeproductioninatwo-stagemembrane-assistedbioreactor.WaterResearch，2000，34（1）：
205~215
15LuxmyB.S.，KuboT.，YamamotoK.Sludgereductionpotentialofmetazoainmembranebioreactors.WaterScienceandTechnology，
2001，44（10）：197~202
16LuxmyB.S.，NakajimaF.，YamamotoK.Predatorgrazingefectonbacterialsizedistributionandflocsizevariationinmembrane-separa-
tionactivatedsludge.WaterScienceandTechnology，2000，42（3）：211~217
28 中 国 生 态 农 业 学 报 第13卷