全 文 ：第 12卷 第 2期
2 0 0 4年 4 月
中 国 生 态 农 业 学 报
Chinese Journal of Eco—Agriculture
Vo1．12 No．2
April， 2004
植物低温胁迫响应的生化与分子生物学机制研究进展
郭子武 李宪利 高东升 段成国
(山东农业大学 园艺学院 泰安 271018)
摘 要 综述 了植物对低温孙迫响直的生化与分子生物学机制 ，即低温信号激活某些抗冻基 因的表达 ，产 生特异
蛋白和渗透调节物质，使植物抗氧化孙迫 能力和渗透调节能力提高 ，保护 了植物细胞。而植物抗 寒性 的提高决定
于抗冻基因的表达 ，如何通过分子生物学手段提高植物抗冻基因表达的效应是培育植物抗寒 品系的关键。并展望
了该领域今后研 究的方 向。
关键词 低温孙迫 植物抗寒性 抗冻基因
Advance in the mechanism of biochemistry and molecular biology in response to cold stress of plant．GUO Zi—W u．LI
XiarrLi，GAO Dong—Sheng，DUAN Cheng—Guo(Colege of Horticulture，Shandong Agricultural University，Tai’an
271018)，CJEA，2004，12(2)：54～57
Abstract The signs of low temperature actix，ate the expression of some freezing tolerant genes of plant and the contents of
specific proteins and osmotic adjustment substances are raised，all of which elevate the antioxidant capacity and the osmotic
adjustment capacity and protect the plant cels，thus the expression of some freezing tolerant genes is the determinant of the
antifreeze capacity，SO it is critical for breeding antifreeze traits that enhances the level of the expression of freezing tolerant
genes．Finaly，the view of this domain in future is presented．
Key words (k,ld stress，Antifreeze capacity of plant，Freezing tolerant gene
低温是典型的环境胁迫因素之一 ，对植物生长发育有重要的影响 ，一般认为低温胁迫使植物光合作用
降低 ，呼吸作用增强，能量产生和物质合成受阻，消耗增强 ，植物处于饥饿状态 ，严重影响了植物正常生长发
育甚至导致死亡。但植物对低温胁迫的响应并非是完全被动的反应 ，而是一种积极主动的应激过程。低温
诱导了相关基因的表达 ，通过积累小分子抗性物质及抗氧化系统的活化等，缓解了低温胁迫造成的机械伤害
和生理伤害，提高了植物的抗性。
1 抗氧化 系统对低温胁迫 的生化 响应
低温下由于植物对 o，的利用能力降低，多余的o，能在代谢过程 中被转化成对植物有毒害作用的活性
氧(AOS)，在代谢旺盛部位(如呼吸链和光合电子传递链)活性氧生成量更高。故过剩的 02对需 02生物有
潜在毒性 ，必须通过植物抗氧化系统及时清除。植物抗氧化系统由许多酶和一些小分子组成 ，低温胁迫下
这些酶和小分子物质含量和活性均发生变化。对玉米研究表明低温胁迫下玉米超氧化物歧化酶(SOD)、过
氧化氢酶(CAT)等活性改变 ；糖 、抗坏血酸、谷胱甘肽含量也发生变化 。转 MnSOD基因玉米中因导入 了
MnSOD基因，使超氧化物歧化酶含量和活性均增强 ，因而抗寒力明显增强H 。经低温胁迫适应的玉米其抗
氧化系统活力增强，耐低温胁迫的能力明显提高，说明低温对这些酶有一定诱导作用 ，而低温诱导产生的酶
一 定程度缓解了植物氧化性伤害；但随氧化程度的加重 ，植物细胞受到伤害加重甚至死亡 ，酶合成的量降低
以及不断氧化 ，使酶含量和活性降低并最终失活。 。对甘蓝研究发现 1种约 10kD的冷凝蛋白，该冷凝蛋白
是 1种非特异依赖于 Ca 和 Mn 脂类转移蛋白，可在冻一融过程中保护类囊体活性 ，该蛋 白与 Ca”和 Mn
的螯合能力同植物抗冷能力密切相关 。小分子游离蛋 白的氧化对植物有保护作用 ，使植物避免因低温下
光合作用能力降低 ，合成碳水化合物减少而饥饿致死。脯氨酸是 1种亲水氨基酸 ，也是 1种渗透调节物质，
能缓解因低温脱水造成的渗透胁迫。分子伴侣也能提高植物抗寒能力，研究发现番茄和菠菜在低温下产
* 国家高新技术发展(863)计划项 目(2001AA247041)资助
**通讯作者
收稿日期 ：2003—03—06 改回日期 ：2003—04—12
第 2期 郭子武等：植物低温胁迫响应的生化与分子生物学机制研究进展 55
生 1种 70族的分子伴侣，这些分子伴侣能缓解低温对植物的伤害 ，提高其组织抗性 。故抗氧化系统可清
除低温胁迫产生的活性氧，调节细胞渗透势 ，维持细胞膨压，避免细胞胁迫致死。
2 相关基 因对低温胁迫 的响应
低温下植物的生理生化变化是植物低温应激反应结果。近年来多种植物中均发现与胁迫有关的基因以
及这些基因表达产物 ，而对模式植物拟南芥 “ 和低温敏感植物 引的研究多见报道。
利用拟南芥突变体研究植物基因对低温的响应 。拟南芥 的基因组较小，利用拟南芥及其各种突变体研
究其对低温胁迫的不同响应和低温下相关基因表达及其与抗冷能力的关系具有一定可行性 。拟南芥
的 hos2基因有 hos2—1、hos2—2和 hos2—3 3种突变体 ，由于 hos2基因位点的突变提高了低温胁迫下 RD29A
和其他一些基因的表达，而响应渗透调节和 ABA的基因则不受影响，遗传分析表明 hos2是 1个核内隐性基
因。与野生拟南芥相比，突变体 hos2—1在零上低温的抗冷能力低于野生型，但其不会减弱对春化作用 的响
应。拟南芥中 hos1突变产生 了突变体 hos1—1，从而导致抗冷基因 RD29A、COR47、COR15A、KINI和 ADH
的表达，这些基因虽在高盐 、脱落酸(ABA)、聚乙二醇的诱导下也能表达 ，但 hosl一1的这些基因表达仅受低
温诱导，遗传分析表明 hos1是 1个核内单隐性基因。笔者低温胁迫下用 RD29A启动子控制的荧光素酶报
告基因研究 hosl一1突变体结果表明，hosl一1的响应低温基因可在 19℃高温下被诱导并表达；相反野生拟南
芥响应低温的基因在 10℃乃至更低温度下不能表达。与野生拟南芥相 比，突变体 hosl一1不抗严寒，经 2d低
温适应后 hosl一1获得与野生拟南芥相同耐冷性且开花更早 ，表现出固有的春化特性。故 hosl和 hos2基因
对植物低温信号转导具有负调节作用，在缓解低温胁迫 、耐冷性和开花过程的基因表达中起关键作用 。研
究表明拟南芥中 ABI3基因的异常表达可提高植物抗冷能力和低温适应性，其在异常表达 的拟南芥 中可提
高低温和干旱胁迫基因对脱落酸的敏感性 ，即使在短时间使用少量的脱落酸，胁迫基因的表达也能明显提
高，同时 ABI3基因的异常表达还提高低温诱导的耐低温胁迫能力。与野生拟南芥相 比，转 ABI3植物适应
低温更快 ，明显提高耐极限低温的能力 ，故转 ABI3植物只需较低水平的脱落酸即可激活耐低温胁迫基因的
表达并保持较高的抗低温胁迫能力 。CBF基因为低温诱导后迅速表达的基因，其编码的转录激活子控制
着包括 C—repeat／脱水响应元件 DNA调节因子启动子基因的表达。转 CBF拟南芥中 CBF1和 CBF3的表达
可诱导低温调节的靶基因(COR)表达，提高未经低温适应的植物耐低温胁迫能力。拟南芥 CBF3基因的过
度表达提高了耐低温胁迫能力 ，且导致许多与低温胁迫有关的生理生化变化 ，如脯氨酸和可溶性糖(蔗糖、棉
籽糖、葡萄糖和果糖等)含量提高 ，而 P5CS转录体水平的提高则表明脯氨酸水平的提高 ，至少为部分因脯氨
酸合成的关键酶 △一二氢吡咯一5一羧酸酯合酶基因的表达，故 CBF3整体激活了低温适应的响应信号多种组
分‘ 。拟南芥 中 sfr6基因突变后导致其冷敏性 ，说 明 sfr基因是低温抗性 的必须基 因，经检测纯化 sfr2～
sfr7突变体低温诱导后基因的表达发现，sfr6突变体可被低温诱导的基因中缺少 KIN1、COR15a和 LTI78
基因，这些基因均包括启动子区的 C—repeat／脱水响应元件 ，而 sfr6突变体中不能缺失 KIN1，导致其能对渗
透胁迫 和 ABA产生响应。相 反低温诱导 基因 CBF1、CBF2、CBF3和 ATP5CS1的表达 ，因他们都 缺 失
CRT／DRE基序 ，故不受低温诱导。低温敏感品种 sfr6突变体基因的表达具有很强连锁性 ，有研究认为低温
诱导的sfr6突变体中包含 CRT／DRE基因 ，低温诱导‘失败是因低温使其 ca信号发生变化 ，但对低温诱导的
细胞色素结合态钙变化的研究发现，sfr6突变体中 Ca的变化与野生品种差异不显著。故 CRT／DRE结合蛋
白可能是其激活后才能在转录过程中发挥作用 ，而 SFR6蛋白是激活的关键因素。拟南芥 CBF族基因的
CBF2和 CBF3与 CBF1有高度相似性 ，其中 1个基因编码 了包含 AP2结构域的转录激活子基因 ，该激活子
基因与低温响应元件 CCGAC连接 ，诱导了某些低温调节基因的表达，提高了植物抗冷性，该基因还编码 了
AP2 DNA结合基序蛋白，该蛋白与 CBF1、CBF2和 CBF3蛋白相似 ，且包括 1种核内定位信号和酸性激活区
域。CBF2和 CBF3基因与 CBF1相连接 ，在 Iv染色体底臂构成 1簇 ，这些基因(CBF基因)高度相似并前后
顺序连接 ，具有相同转录位点的事实表明它们是同源的。同时 CBF1、CBF2和 CBF3基因表达模式也具一致
性 ，可被低温处理迅速诱导，并对脱落酸和水分胁迫无响应 ，这与多数植物低温诱导的基因特征相反，故基因
CBF2和 CBF3可行使转录激活子基因的功能 ，控制低温基因表达水平并通过不依赖于脱落酸的途径提高植
物抗寒能力 “ 。有研 究表 明低 温调节 的 CBF基因族 编码 的 AP2转录激 活子基因是低 温诱 导基 因
COR(cold—regulated)表达的早期阶段 ，而控制低温基因表达 的 DNA调节元件 为 CRT(C—repeat)／DRE，CBF
基因族的 CBF1与该元件紧密结合，其在转基因植物的过度表达激活了低温诱导基因 COR的表达 ，提高植
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物的抗冷性 。研究表明 CBF1与 CBF2和 CBF3同属-j,蛋白家族 ，其基因在染色体 IV的 72．8cm处 I司向
重复，该基因 3种 CBF转录水平在低温下 15min后明显提高，约 2h即可积累 COR基因转录体，同时 CBF转
录体也得以积累。CBF的启动子区域不包含 CRT／DRE序列和 CCGAC，且 CBF1的过度表达对 CBF3转录
体水平无影响，这表明 CBF族基因为非 自主调节 ，在 CBF基因诱导初级阶段含有 CRT／DRE基序的 COR基
因诱导需要低温刺激作为信号。脯氨酸对缓解低温胁迫伤害有重要作用 ，而脯氨酸的产生受基因调节，有研
究表明拟南芥中 Eskimol位点突变会导致脯氨酸积累，缓解了植物低温伤害，但它却不能有规律地增强几种
低温调节基因包括抗冷基因的表达。RNA凝胶分析表明 eskl突变体中脯氨酸积累受到基因包括脯氨酸合
成和降解基因转录水平的调节。拟南芥蛋 白类似激酶接受器基 因(rpk1)是 1个含有 1952bp的开放解读框
架 ，其编码了 1个 540个氨基酸残基的多肽 ，该多肽(RPK1)具有激酶接受器的 4个互不相同区域 ，即氨基酸
末段信号序列区，5个富含亮氨酸的胞外重复序列；膜形成区；细胞质蛋 白激酶区，该区包括蛋白激酶所有保
守的 11个亚区。rpkl基因在花 、茎、叶片和根部均有表达 ，研究表明用脱落酸处理 1h后即可诱导其表达 ，
该基因通常被多种环境胁迫 因子快速诱导，如脱水 、高盐和低 温等 ，这表 明它对胁迫的反应有普遍性。而
aba一1、abil一1、abi2—1、abi3—1突变体中脱水诱导该基因的表达，但未造成伤害，这表明脱水诱导的 rpkl基因为
脱落酸依赖型‘“ 。
低温敏感植物基因对低温的响应。对低温敏感植物易受到低温伤害，低温敏感植物的低温适应特性和低
温下基因表达特性的研究已多见报道 ’ 。对大麦研究发现 3种在顶端组织中表达的低温诱导基因，分别为
bltl01、blt4．9和 bltl4，且已分离出这 3种基因的表达产物 tuRN ，1个控制基因和 1个延长因子 lalpha，这 3种
基因的表达特点为 bltl01和 blt4．9仅在低温处理大麦中表达 ，且 bltl01在低温处理大麦多种组织中均可表达，
尤在顶端组织导管区表达最强烈 ，经验证 blt4．9是该低温诱导基因的启动子，而 bltl4在处理和对照中均有表
达，且仅在顶端组织皮层内层表达。尽管膜内控制基因表达强烈，由于编码非特异性膜脂转运蛋白基因 blt4．9
的表达受叶表皮和老化的顶端组织表皮限制 ，故任何 1种低温诱导基因均未表达。不同组织低温诱导基因表
达产物的分子特征虽完全不同，但这些表达产物与顶端组织导管区伤害和植物的成活密切相关，因此该区
bltl01和 bltl4强烈表达表明其对顶端组织耐低温能力有直接影响 。blt4．9为低温基因的启动子区域，该小
区域(1938bp)包含的序列基序中含有响应低温、脱落酸和其他环境因子序列。基因缺失分析表明42bp序列最
接近但并未包含在 CAAT和 TATA 框 内，而在茎外植体短暂基因表达系统中能提高低温对报告基因的响应。
利用核蛋白电泳分析(EMsA)进一步研究低温处理和对照 blt4．9的启动子区域和利用合成低聚核苷酸鉴定六
聚核苷酸研究结果表明，CCGAA在 42bp低温响应启动子区域内可作为迁移率低的结合蛋白复合体结合位点，
这种复合体在低温处理和对照植物核内提取物中均存在，是惟一一种含有该区域的蛋白复合体，低温响应 42bp
启动子区域内 CC~AAA基序的突变减少了对低温响应的基本水平。上游作用元件和 C~2,AAA是其他植物中
低温响应元件 ，本研究中 CCGAAA不与核蛋 白结台。六聚核苷酸和 CC~AAA存在于从第一个 ATG开始的
一 195bp~ ，包含在大麦低温响应基因 blt4．9中。小麦中分离的基因 tacr7不能被脱落酸和其他胁迫诱导如盐、
脱水及高温胁迫 ，而仅能被低温诱导，是一种低温特异(LTS)基因，与大麦基 因 pHVCR8(基因文库编码为
L28091)同源 ，编码高度疏水蛋白 TACR7具有单一跨膜区域且富含亮氨酸(>19％)，是文献中惟一描述过的低
温调节蛋白。tacr7基因转录分析表明，小麦由对照(25℃)转入低温(2℃)时其幼苗顶端组织和愈伤组织培养中
tacr7的转录体(630nt)大量积累，利用 pTACR7作探针的 Northern杂交，经盐、水分胁迫和高温胁迫处理其幼苗
与愈伤组织培养中未探测到 tacr7初级转录体。2℃低温时 tacr7初级转录体在抗低温胁迫小麦品种 HRWW
(FR；SDmut 16O29)顶端组织中积累量远高于温敏品种 ww(FS；SDmut 16169)顶端组织，差异显著并达极值
(为 30％±3％)⋯ 。小麦研究中还发现受光诱导的低温响应基因 wcrl2含有 1个 525bp的开放解读框架，其
编码了 1个 174个氨基酸的多肽；wcrl2编码的蛋白WCR12和早期光诱导蛋白ELIPs具有很高的序列同源性 ，
被认为是光胁迫诱导核内基因编码的叶绿体蛋白。在高光子流密度下 8℃低温时可诱导产生 wcrl2转录体，是
其他植物 ELIPs基因表达的典型模式。4℃低温乃至低光照下与对照相 比(20℃温度，中光强)wcrl2转录体水
平提高了 20倍。黑暗条件下 4℃低温可使 wcrl2转录产物(mPNAs)积累，并使其积累水平达到 20℃高光强下
水平，这表明低温下光照对 wcrl2转录体的积累并非是必须的。Southern杂交表明，wcrl2基因或相关同源基因
定位于小麦染色体 V上 。低温下常发生蛋白的解聚，使蛋白质变性失活，对小麦研究发现一种抗解聚因子
ADF是由TaADF基因编码的，抗解聚因子 ADF是 1种隐蔽的高能肌动蛋白，具有阻止核苷交换以及被诱导的
肌动蛋白解聚作用，离体磷酸化研究表明 TaADF是小麦 52kD激酶的底物。低温适应时期该激酶活性受低温
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的调节。Westem杂交表明TaADF仅在 Gramineae品种中积累，且耐低温小麦品种的积累水平高于不耐低温小
麦品种，这种积累受定位于染色体 5A位点的基因编码因子调节 ，该位点通常与植物耐低温能力有关。对低温
适应过程中 ADF活性与植物耐低温能力的关系研究表明，低温下可能需要细胞骨架的再建，再建后新模式可
能对提高植物耐低温能力起到关键作用 j。对菠菜研究发现低温适应基因 capl60编码 1种与低温适应密切
相关的酸性蛋白 CAP160蛋白，该蛋白有 780个氨基酸残基，与拟南芥胁迫调节蛋白rd29A和 rd29B有严格的
同源关系。菠菜与拟南芥基因结构不具相似性 ，这表明该低温胁迫基 因的分类不具高度保守性。capl60和
c~p85(另 1种菠菜低温胁迫蛋白)在农杆菌 35s启动子区域控制下转入烟草，转基因烟草细胞半致死温度与野
生烟草无差异，但胁迫下转基因烟草电解质外渗水平低于野生烟草，这表明低温对它的伤害较小。2种异源低
温胁迫蛋白的表达对低温胁迫无明显影响，这与低温胁迫是一种数量形状的本质一致 。对玉米研究表明，低
温诱导了玉米胚芽中编码 2种脯氨酸富集蛋白基因 HyRP(杂种脯氨酸富集蛋白)和 HRGP(羟脯氨酸富集糖蛋
白)的表达，编码 HyPRP基因表达受脱落酸和低温的调节，是依赖于脱落酸的基因；而与之相反特效低温处理
对编码 HRGP基因有正向影响，研究表明这 2种蛋白均明显提高玉米抗寒能力。
3 小结与讨 论
低温胁迫下基因表达的改变可诱导合成许多新的蛋白质，如多种酶改变植物代谢途径，使植物进入抗寒
锻炼 ；部分膜蛋白有稳定膜的作用 ；某些糖蛋白主要存在于液胞和细胞间隙阻止冰冻作用，使细胞液在低温
下处于过冷状态，从而保护细胞膜的稳定性，提高渗透调节能力 ，降低低温胁迫对细胞的伤害。而抗寒能力
由植物基因决定 ，已分离鉴定出许多与低温胁迫有关的基因及其产物，但其具体功能尚需进一步研究。低温
胁迫下植物的响应是多基因表达产生的响应综合，但并非是简单累加 ，研究低温响应相关基因间以及它们表
达的关系，使这些基因的表达效应达到最高，提高植物耐寒能力 ，延长植物耐受低温的时间，从根本上提高植
物抗寒性。可低温诱导的基因很多且大多已被克隆和鉴定 ，应用分子生物学手段，植物低温胁迫的响应生化
和分子生物学机制正被逐步阐明，但仍有许多问题亟待研究，如低温信号是如何被感知?低温胁迫下抗寒基
因的表达依赖于多种转录因子的调节，这些转录因子作用方式 的确定将有助于低温胁迫信号转导途径 的阐
明。如何更有效培育高品质抗寒植物品系?1个转录因子往往调控几个功能基因的表达 ，故植物抗寒育种
中与逐个改良和导入功能基因获得抗寒性的传统方法相 比，从改良或增强 1个关键转录因子 的调控能力着
手，或许是提高植物抗寒性更为有效的途径和方法。
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