全 文 ：植物生理学通讯 第 40 卷 第 5期，2004 年 10 月 643
植物抗冻基因
李璐 王晓军 赵民安*
中国科学院新疆理化技术研究所，乌鲁木齐 830011
The Antifreezing Genes in Plants
LI Lu, WANG Xiao-Jun, ZHAO Min-An*
Xinjiang Technical Institute of Physics & Chemistry, Chinese Academy of Sciences, Urumqi 830011
提要 介绍植物抗寒冻基因研究中一些已分离和鉴定出的低温诱导表达基因及其抗寒功能、低温信号转导以及调控方式
的研究进展。
关键词 植物抗寒性；低温诱导表达基因；低温信号转导；基因调节；基因工程
收稿 2003-12-29 修定 　 2004-04-05
* 通讯作者(E-mail:deerlyee@hotmail.com,Tel:0991-
3813610)。
植物在低温下一般会遭到不同程度的伤害。
温度又是决定植物地域分布的主要限制因素，每
年由于低温寒害引起的作物损失巨大，而传统的
抗寒育种方法对提高植物抗寒性的作用不大。目
前用传统育种方法得到的最耐寒的小麦品种抗寒能
力与上世纪早期所研制的品种抗寒能力基本上是一
样的[ 1 ]。因此，长期以来，人们从生理学、形
态学、生物化学、生物物理学等多个方面对植物
抗寒机制进行了广泛的研究。特别是近 20 年来，
采用分子遗传学研究手段，大量冷诱导表达的基
因已分离出来，并证明这些基因对提高植物的抗
寒性有一定的作用。人们还对这些抗寒基因表达
的启动和调节因子作了进一步探索，初步提出低
温信号转导以及调控路径的模型，从而为采用基
因工程手段进行植物抗寒育种及有关生理的研究提
供了新的启示。本文对这一领域的研究进展作一
介 绍 。
1 已分离和鉴定的冷诱导基因
Weiser[2]最先提出植物在低温锻炼过程中基因
表达会发生改变的观点，并指出植物的低温适应
性可能需要两个条件，即特异基因的转录激活和
在最大抗寒过程中新蛋白质的低温诱导合成。
Guy等[3]最先证实菠菜在低温锻炼中基因表达确实
发生了改变。随后，有人又相继证明低温锻炼可
以诱发许多基因表达[4,5]。迄今为止，人们已经分
离出的冷诱导表达基因列于表 1。
在这些基因表达的产物中，一些已证实是有
已知酶活性的蛋白，它们可能对提高抗寒性有一
定程度的作用[5]。如拟南芥的fad8基因[6]和大麦的
blt4基因[5]，它们分别编码脂肪酸去饱和酶和一种
脂肪迁移蛋白。通过这种脂肪酸去饱和酶或脂肪
迁移蛋白改变质膜的组成以提高膜的冷稳定性。
表1 植物中已分离鉴定的冷诱导基因
材料 基因 文献
拟南芥 (Arabidopsis thaliana) fad8 6
cor15a 4
cor6.6 7,8
cor78 9
cor47 8
欧洲油菜 (Brassica napus) BN15 10
BN28 11
hsp90 12
苜蓿(Medicago sativa) cas18 13
cas15 13
大麦 (Hordeum vulgare) HV A1 14
PT59 15
pA086 15
blt4 5
blt14 16
小麦(Triticum aestivum) cor39 17
wcs120 18
wcs200 19
马铃薯(Solamam commersonii) pA13 20
菠菜 (Spinacia oleracea) cap85 21
cap160 22
植物生理与分子生物学 Plant Physiology and Molecular Biology
植物生理学通讯 第 40 卷 第 5期，2004 年 10 月644
还有一些基因，如菠菜的hsp70 基因[23]和欧洲油
菜的hsp90 基因[12]，编码一种分子伴侣，它们可
以起稳定蛋白的作用，从而抵御由冰冻诱导产生
的变性现象。此外，各种编码信号转导和调控蛋
白的基因，包括激活细胞间接分裂的蛋白激酶，
Ca2+依赖性蛋白激酶和14-3-3蛋白(即色氨酸酪氨
酸羟化酶依赖性激活蛋白)等，在低温胁迫中也同
样发挥作用[5]。它们可能是通过控制冷诱导基因
的表达或调节抗冻蛋白的活性而影响植物的抗寒能
力。
从氨基酸的相似性来说，虽然这些低温诱导
合成的多肽划分为不同的类别，但它们在不同的
植物中却表现出不少共性。如：具有极强的亲水
性，在沸腾的缓冲溶液中仍保持溶解状态；具有
比较简单的氨基酸组成，或少数几种氨基酸重复
多次排列；许多还包含一段特殊的区域，能够形
成亲水脂性的a-螺旋。如拟南芥的cor15a基因，
它编码一种15 kD 的新多肽，合成后运送至叶绿
体基质片层中加工成 9.4 kD 的成熟多肽，称为
COR15am [4]。COR15am 是高度亲水性的，在沸
水中仍保持溶解状态。它富含Ala、Lys、Glu 和
A s p 残基，占整个蛋白组成的 6 0 % 以上，不含
Pro、Met、Trp、Cys、Arg、Gln 和 His 残基，
而且整个COR15am蛋白是由一个由13种氨基酸组
成的序列重复 4 次排列组成。与此类似的是，大
麦的冷相关基因HVA1[14]编码的产物是一种22 kD
的新多肽，也具有极强的亲水性。它富含 Ala、
Thr和 Lys残基，占整个蛋白组成的50%以上，不
含 Pro、Trp、Cys 和 Phe 残基，它由一个由 11
种氨基酸组成的序列重复 9 次排列组成。
2 抗冻基因产物的功能
植物在低温驯化过程中诱发合成的蛋白在抗
寒中的作用可分为3类：(1)行使酶的作用，催化
合成一些关键渗透调节物质(如脯氨酸合成酶)，
或是降解冰冻诱导的变性蛋白，为新蛋白的合成
储备原料(如巯基蛋白酶类); (2)新合成的蛋白质附
着于膜表面或位于膜脂间，对膜起冷稳定作用(如
LEA蛋白等); (3)作为在信号转导和低温诱导基因表
达过程中起调节作用的蛋白质因子(如 CBF1 等)。
以下就目前一些已鉴定的冷诱导基因在抗寒中的功
能作介绍。
2.1 拟南芥的COR基因 在拟南芥所有高效表达的
冷相关基因中研究最多的是 COR 基因，又称 LTI
基因、KIN 基因、RD 基因或 ERD 基因[4]。COR
基因由4个基因族组成，每个基因族又是由2个基
因一前一后串联组成。其中 COR7 8、COR1 5 和
C O R 6 . 6 家族的偶基因编码新发现的多肽，而
COR47 家族的偶基因则编码 LEAII 类蛋白的类群
蛋白。而且Thomashow[4]和 Hughes 等[5]的研究还
表明 COR15 家族的 COR15a 基因是与其它 COR 基
因相互作用而提高植物抗寒性的。
拟南芥的 COR15a 基因在低温、干旱及受脱
落酸(ABA)诱导的胁迫中都表达[4]。如前所述，
它编码一种15 kD 的多肽，在输入叶绿体基质片
层中后加工成9.4 kD 的成熟多肽(COR15am)。为
了鉴定COR15a基因是否具有抗冻性，Artus等[24]构
建了一种组成型表达 COR15am 多肽的转基因植
物，并将这种未经低温驯化的转基因植物与野生
型植物的叶绿体的耐冻性进行比较的结果表明，
前者比后者提高了 1~2℃。而且 COR15am 的作用
不仅仅限于叶绿体。同样从这种未经低温驯化的
转基因植物的叶片中分离出的原生质体，其忍耐
低温限度也由 -8~-4℃提高到 -9~-5℃。同时，
Artus等[24]用双醋酸荧光素染料检查原生质体存活
率的实验表明，COR15a 基因的表达可以稳定膜
的结构。但这种作用只局限于 -8~-4℃，当温度
在 -4~-2℃范围内时，原生质存活率明显下降。
而Steponkus等[25]发现，在-8~-4℃低温下所造成
的膜系统伤害主要是由于形成了六角形 II 相脂。
因此，Artus等[24]推断 COR15a基因的表达可减少
膜遇冷时所产生的由脂双层向六角形II相转变的
发生率，但对“膨胀诱发的细胞破裂”很少或
几乎没有作用。
目前，对 COR15a 基因在提高膜冷稳定性中
的具体机制还不清楚。而且由于目前研究[4]只给
出了COR15am 简单的氨基酸组成和一级结构，因
而很难分析其是否具有酶活性。这也就为
COR15am 蛋白的作用机理留下许多假想的空间。
COR15am 可能是直接作用于叶绿体膜的内膜而增
加整个膜系统的冷稳定性。但是如前所述，
COR15am 是定位在叶绿体基质片层中的[4]，它如
何能减少整个膜系统由脂双层向六角形II相转变的
发生率呢？Steponkus等[26]提出了一种COR15a作
用机制的假说。他们推测，整个膜系统向六角形
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II相转变的发生率往往是由最易形成六角形II相
形式的膜结构决定的。这种膜称为整个防御系统
中“最弱环节”。而叶绿体膜是一种双层膜，它
与原生质膜都易遭到 LOR-H Ⅱ形式的损伤。假设
叶绿体膜的内膜正是这种“最弱环节”的话，那
么定位于叶绿体基质上的 COR15am 只要通过改变
绿体膜内膜的弯曲性，就可以推迟整个冰冻引起
的六角形II相的形成，或降低形成六角形II相的
温度。当然，COR1 5 a m 也可能是通过间接作用
来提高膜的冷稳定性。例如，它可能通过调节一
些与抗冻性有关的蛋白(如参与糖或脂代谢的酶)的
活性来增强细胞内保持水分的能力，从而提高膜
稳定性。但这些只是一些假想，还需用实验来证
明。
尽管组成型表达COR15a 基因在组织水平(如
叶绿体)和细胞水平(如原生质体)上提高植物抗寒性
的作用已十分明显，但这种作用效果还较小[24]。
而且，用 COR15a 单独表达的方法对提高整体植
物抗寒性的作用更是不明显[27]。这是由于抗寒这
一生理作用本身就是由多基因作用的结果[1]。事
实上，在低温锻炼过程中拟南芥的多种基因能被
激活，而这些被激活的基因中至少应同时含有 4
种不同族的 COR 基因[4,5]。
2.2 菠菜和甘蓝的冷保护蛋白 早在1975年，Volger
和 Heber[28]就报道，菠菜和甘蓝在低温锻炼过程
中合成一种多肽，它能高效保护分离的类囊体膜
在体外免受反复冻融的损伤。这些所谓的冷保护
多肽只在经冷驯化的植物中发现，表明它们都是
由COR基因编码的。Hincha等[29]随后的研究表明
冷保护多肽在冷冻过程中是通过降低膜的渗透性，
而在解冻过程中则是通过增加膜的膨胀性来保护膜
免受损伤的。但当时由于分离纯化方法的困难，
无法弄清楚在低温锻炼过程中是单个蛋白起作用，
还是多个多肽共同作用的结果。
近几年来，在研究菠菜和甘蓝的冷保护蛋白
方面有了重大进展。Sieg等[30]从低温锻炼过的甘
蓝中纯化出一种单一的冷保护蛋白，这种蛋白分
子量为7 kD，在沸水中仍保持着溶解性，而且推
断可能是由一种冷诱导基因COR所编码的(因为这
种蛋白只存在于经冷驯化的而不存在于未经冷驯化
的植物中)。但由于这种蛋白的氨基酸序列还不清
楚，因而无法知道它与上面所说的 COR 基因所编
码的亲水多肽是否具有同源性。另外，还需要用
一些直接证据来证明这种冷保护蛋白是否对保护膜
免受冻害有作用。
2.3 编码LEA蛋白基因的功能 胚胎发生后期富集
蛋白(LEA)出现在胚发育后期，随种子脱水成熟其
含量增加。在干旱、高盐或低温胁迫下，L E A
蛋白基因在各种植物的营养器官也被诱导[14]。陈
善福和舒庆尧[31]推测 LEA 蛋白可能有以下三方面
的作用：(1)作为脱水保护剂。由于LEA蛋白在结
构上富含不带电荷的亲水氨基酸，一方面，它们
可能像脯氨酸作用一样，通过与细胞内的其它蛋
白质发生相互作用，稳定这些蛋白的结构[32]; 另一
方面，它们可能给细胞内束缚水提供了一个结合
衬质，从而使细胞结构在脱水中不致遭受更大的
破坏。(2)作为一种调节蛋白[32]参与植物的渗透调
节。(3)通过与核酸结合而调节细胞内其它基因的
表 达 。
大麦的LEA蛋白基因hva1编码一种LEA III
类蛋白，尽管目前还没有直接证据证明冷驯化过
程中基因hva1的表达有提高抗寒性的作用，但已
有证据证明 hva1 与耐旱性有关。Xu 等[33]报道将
H V A 1 基因转入到水稻中可得到高水平的表达，
且其抗旱性和抗盐性明显提高。考虑到耐缺水与
耐寒性之间的关系，他们推断hva1基因可能也是
一种抗寒基因，它能减少因冰冻诱导的细胞脱水
带来的损伤。另外，Imai 等[34]报道马铃薯基因
le25在酵母中表达对提高细胞的耐寒性和耐盐碱性
都有作用。而且，作为对冷敏感植物的马铃薯不
经低温锻炼时le25表达处于一种极低的水平，而
经过低温锻炼后，它几乎完全表达[35]。以上表明
LEA 类蛋白基因对提高植物抗寒性可能有作用。
2.4 植物的AFPs 抗冻蛋白(antifreeze protein, AFP)
是存在于许多抗冻生物中的高效抗冻生物活性物
质。这些蛋白的特性表现为它们都具有“热滞”
活性，能降低冰点温度而对熔点温度没有影响，
从而导致溶液的熔点和冰点之间出现差值，这种
差值就是热滞活性(thermal hysteresis activity,
THA)。由于这种热滞活性导致 AFP 吸附在冰核表
面而抑制冰晶生长。而且，当温度降到溶液冰点
以下时，AFP 能影响冰晶的形状并抑制重结晶。
鱼类的 AFP 研究较早，目前鱼类中已发现了
包括含糖的抗冻糖蛋白(AFGP)和不含糖的Ⅰ ~ Ⅳ
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型AFP 在内的 5种 AFP[36]。昆虫中也发现了比鱼
类 AFP 活性更高的不含糖的 AFP，也称热滞蛋白
(thermal hysteresis protein, THP)。
在植物中也存在冷诱导蛋白，它与鱼类和昆
虫的 AFP 有不少类似的性质，认为也是一种抗冻
蛋白[37,38]。它们也具有热滞活性，并且这种热滞
活性已经在包括双子叶植物和单子叶植物在内的
20多种经低温锻炼的植物细胞液中检测到[37]。国
内还有从雪莲和沙冬青中分离到有一定活性的植物
AFP 的报道[39~41]，并观察到沙冬青 AFP 的冰晶类
似于鱼类的冰晶形态[39]。Antikainen 和Griffith[42]
在经低温锻炼的黑小麦流动的非原生质体中发现了
6种 AFP 蛋白，它们的分子量有 16~35 kD 不等。
其中4种分子量较大的多肽活性较高；另2条多肽
抗冻活性较低。含有二硫键的多肽用 D T T 处理
后，其抗冻性并不消失。这些多肽富含 A s p /
Asn、Glu/Gln、Ser、Thr、Gly、Ala，均缺
少 His，Cys 的含量达 5% 以上。这些 AFP 都是
病理蛋白[37]。Antikainen 和Griffith[42]用N末端氨
基酸测序和免疫分析方法已获知其中2个AFP是同
内切几丁质酶病原相关的蛋白，2个是同内切-b-
1,3-葡聚糖酶病原相关的蛋白，2个是同T甜蛋白
病原相关的蛋白。同时Griffith等[43]和Urrutia等[38]
发现同极区鱼(AFP 热滞值：0.5~1.5℃)和昆虫
(AFP 热滞值：3~6℃)相比，植物 AFP 活性较低
(热滞值通常为0.2~0.5℃)。Griffith和McIntyre[44]
根据抗冻植物抗冻性的研究，提出抗冻植物形成
了一种特殊的控制胞外冰晶形成的机制，即抗冻
蛋白和冰核聚物质的协同作用。抗冻蛋白降低冰
点，减缓冰晶形成的速度；冰核聚物质促进冰晶
的形成。这样，在冰冻温度下，通过这两种物
质的协同作用调控胞外水结冰的速度和冰晶的形
态，从而减缓或避免结冰造成的对细胞的机械损
伤及渗透胁迫。
总的来说，抗冻蛋白对提高抗冻植物的抗冻
性可能是十分重要的。Urrutia等[38]结合自己的研
究工作，认为 AFP 在植物中可能具有下列功能：
抑制冰重结晶；降低冰晶的生长速度；在某一特
定温度下可降低结冰水的百分比；保护膜系统及
阻止细胞内冰晶的形成。Antikainen等[45]根据他们
在黑小麦 AFP 研究中的结果，推测 AFP 可能主要
起两种作用：一种是屏障作用，即避免增长的冰
晶侵入叶表皮及细胞内；第二种是抑制冰的重结晶。
3 抗冻基因表达的调节
3.1 CBF/DREB1转录活化因子调节抗冻基因的表
达 对基因表达的最初研究认为，由于低温和干旱
胁迫激活一定冷相关基因的启动子，从而表达冷
调节基因[46]。随后，Yamaguchi-Shinozaki 和
Shinozaki[47]在拟南芥中发现了COR基因的调节元
件 CRT/ D R E，并首先证实，这个冷调节元件由
9 bp 组成，并有一段核心保守序列 CCGAC。此
种调节元件除了对低温作出反应外，还能对干
旱、高盐等作出反应而使基因表达。随后，
Stockinger等[48]首次测出结合于CRT/DRE的蛋白
的编码序列。这种结合蛋白被称为 CBF1，它含
有一个 AP2/EREBP-DNA 结合区域[49,50]。此外，
Liu 等[50]进一步证实，CBF1 属于一个基因家族，
此基因家族编码 3 个相关的转录活化因子，分别
称为 CBF1、CBF2、CBF3 或 DREB1b、DREB1c
和 DREB1a。Gilmour等[49]还发现编码这些转录活
化因子的基因都位于拟南芥的第 4 染色体上，并
与它们的靶基因，即由CRT/DRE 控制的 COR6.6、
COR15a、COR47 或 COR78 基因相分离(这几个
cor 基因分别相应地位于第 5、2、1 和第 5 染色
体上)。这种含有 CRT/DRE 调控元件并由 CBF/
D R E B 1 转录活化因子诱导表达的基因称为 CBF
调控元。
在正常条件下是观察不到野生型的 COR6.6、
COR15a、COR47 或 COR78 基因表达的。但Jaglo-
Ottosen 等[27]发现在转基因的拟南芥中，由于
CBF1/DREB1b 或 CBF3/DREB1a 基因的超表达，
不仅使上述含有CRT/DRE 调节元件的冷相关基因
能在正常温度环境中表达，而且，当给以低温刺
激时，这种转基因拟南芥的 COR 基因的表达水平
比野生型的显著增强，其耐寒能力也随之大大增
加。
如上所说，CBF/DREB1 蛋白既然能在正常
温度下诱导含有CRT/DRE 的冷调节基因转录，那
为什么在正常温度下又观察不到这些 COR 基因表
达呢？研究发现，在放入低温环境后不到
15 min，CBF/DREB1 开始转录，随后 1~2 h 由
CRT/DRE 调控的基因才开始转录，由此可见CBF/
DREB1 基因本身也是由低温诱导的[49,50]。因此
Gilmour等[49]提出了一种假说，认为存在一种转录
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因子 ICE，它是 CBF/DREB1 表达的启动子。这
种蛋白在正常温度环境中是以非活化状态存在的。
当植物面临低温胁迫时，ICE 蛋白或与之相作用
的蛋白就被激活，诱导 C B F / D R E B 1 基因的转
录，随后诱导 C B F 调控元的表达。
CBF 调控元的表达可以保护细胞免受低温以
及包括干旱在内的其它胁迫的伤害。但 CBF 调控
元是如何完成这一功能的目前还不是很清楚。迄
今只鉴定出 6 种由 CRT/DRE 控制的基因(KIN1、
COR6.6/KIN2、COR15a、COR47/RD17、COR78/
RD29a 和 ERD10)，并且只直接证明出 COR15a 基
因的作用机制[24,26]。此外还有研究表明，CBF 调
控元的表达不仅只是提高膜的冷稳定性。例如，
在拟南芥中超表达 CBF3 既能提高 COR 蛋白的含
量，也能提高脯氨酸(Pro)以及糖类物质的含量[51]。
不少实验表明，许多植物在低温锻炼过程中 Pro
和糖类物质含量提高可以增强植物的抗寒性。因
此可以看出，CBF/DREB1 调控蛋白在低温锻炼过
程中作为“枢纽开关”调节着多种组分的活性。
3.2 SFR 和 ESKIMO1 抗冻基因的调节 Warren
等[52]通过化学诱导基因突变的方法在拟南芥中发
现了 7 种冷敏基因——SF R 基因。随后 Xi n 和
Browse[53]也通过化学诱导基因突变的方法分离出
低温诱导的组成型突变体。他们发现，一种突变
体eskimo1(esk1)无论经不经过低温锻炼，其抗寒
性都有提高。未经低温锻炼的esk1 突变体中Pro
的折叠水平是未经低温锻炼的野生型植株的 3 0
倍；整个可溶性糖的折叠水平是未经低温锻炼的
野生型植株的 2 倍；而编码缺水应激蛋白的冷相
关基因 RAB18 的转录折叠水平是未经低温锻炼的
野生型植株的 3 倍。Pro 和糖以及 RAB18 蛋白的
增加可能与抗寒能力的增加有关。由于esk1突变
体对所测试的 4 种 CRT/DRE 调节的冷相关基因的
表达没有影响，因此Xin和 Browse[53]推断，必然
存在一种平行的或分支的信号通路，这种通路能
激活一系列与低温诱导相关的基因，并且某一条
通路的激活不需要其它组分的支持就会对抗寒性的
变化有显而易见的影响。因为esk1突变体不能超
表达由 CRT/DRE 调节的冷相关基因，因此他们推
断esk1突变体可能有一个与CBF低温诱导通路不
同的信号通路。ESK1 的作用机制目前还不清楚，
但已有的研究结果证明，ESK1可能是低温锻炼的
负调节元件[52]。
3.3 低温信号转导 在低温信号传递途径中，Ca2+
是重要的第二信使[13,54~56]。当拟南芥或苜蓿等面
临低温胁迫时，细胞外储存的 Ca2+ 流入细胞内使
细胞质的Ca2+ 含量水平快速增加。这种Ca2+ 浓度
的短暂性增加是诱发抗寒性植物冷适应基因表达和
抗寒性提高所必需的[55,57,58]。拟南芥中一些受低温
调节的基因，如CRT/DRE控制的cor6.6的完全表
达必需依赖于Ca2+水平的增加[13,54,56]。Monroy 等[59]
发现当 Ca2+ 螯合剂 BAPTA，或 Ca2+ 通道阻断剂
如La3+ 抑制了低温诱导的Ca2+ 输入时，低温诱导
的cas15基因的表达减弱，同时苜蓿的冷适应能力
降低；而当Ca2+ 离子载体A2318 促使 Ca2+ 迅速流入
细胞时，则细胞不经过低温锻炼在25℃下也可诱
导cas15表达。虽然钙离子的流入和冷适应基因表
达的激活之间的具体步骤还不清楚，但Monroy 等[59]
已证实此过程与蛋白的磷酸化作用有关。他们发
现低温诱导苜蓿cas15基因表达可被蛋白激酶抑制
剂星形孢菌素抑制，并在25℃下，也可被蛋白磷
酸酶抑制剂冈田酸诱导。低温引起蛋白磷酸酶2A
(PP2A)活性迅速下降的过程也是必需依赖Ca2+ 输
入。由以上可以推知，是低温引发 Ca2+ 输入，导
致细胞中 Ca2+ 水平增加，从而抑制了 PP2A 的活
性，使得一个或多个蛋白质发生磷酸化作用，进
而诱导冷调节基因表达，激活冷适应过程。
4 抗寒基因工程
迄今为止，植物抗寒基因工程的研究已在以
下4 个方面取得了成果：(1)鱼类抗冻基因途径；
(2)脂肪酸去饱和代谢关键酶基因途径；(3)超氧物
歧化酶基因途径；(4)糖类基因途径。以下逐一加
以介绍。
4.1 鱼类抗冻基因途径 自1989年Cutler等[60]用极
地鱼黄盖鲽 AFP 处理植物组织明显改善了马铃薯
和拟南芥属等植物的抗寒性以来，植物转鱼类抗
冻基因工程蓬勃发展。Hightower 和 Baden[61]将
afa3、Spa-afa5基因导入烟草和番茄中，获得转
基因植株。afa3和Spa-afa5是北极比目鱼的2种
具有序列重复特性的抗冻基因。afa3是人工合成
的序列，含有 3 个重复，每个重复是富含丙氨酸
的11个氨基酸。Spa-afa5基因编码截短的葡萄球
菌 A 蛋白基因与 afa5 基因之间的那段融合基因
(afa5基因是具有5个重复的afa3的衍生物)。转
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afa3 基因植株的叶子表达出高稳定态的 mRNA，
但在组织提取物中没有检测到抗冰晶化作用。然
而在Spa-afa5 转基因番茄组织中检测到mRNA 与
融合蛋白，并证明Spa-afa5融合蛋白具有抗冰晶
化作用。
Georges等[62]人工合成了一段黄盖鲽AFP基因
双链结构，插入载体 pGCST 中构成与 CAT 嵌合
的质粒载体，采用电激法成功地导入玉米原生质
体中，其表达的蛋白能与 AFP 抗血清特异结合，
说明有 AFP 蛋白序列的表达存在。
总之，AFP 作为高效的抗冻生物活性物质，
其在基因工程上的应用有着十分看好的前景。
4.2 脂肪酸去饱和代谢关键酶基因途径 膜脂相变
温度与植物抗寒性关系密切。一般具有较高膜脂
不饱和度的植物，其相变温度较低，从而在较低
温度下保持膜流动性，维持正常的生理功能[63]。
导入脂肪酸去饱和代谢关键酶基因后，其表达产
物能使一部分饱和脂肪酸催化成不饱和脂肪酸，
从而提高膜脂不饱和度，提高植物抗寒能力。
Gibson和Arondel[6]报道了拟南芥中一个受低
温诱导的脂肪酸去饱和酶基因fad8。它编码合成叶
绿体w-3 去饱和酶，与另一拟南芥脂肪酸去饱和
酶基因fad7有 75%的同源性，两者的叶绿体 w-3
去饱和酶彼此功能可以互补，共同催化膜脂中脂
肪酸的去饱和。Kodama 等[64]将 fad7 基因转入烟
草中，Fad7 蛋白超表达，烟草中C16∶2 和 C18∶3 不
饱和脂肪酸增加，相应的前体 16∶2 和 18∶3 减
少。将转基因植物在低温 1℃下培养数天后转入
25℃下培养，其生长受抑程度明显减轻，低温引
起的缺绿症也减轻许多。
4.3 超氧物歧化酶基因途径 在植物的组织中存在
一些活性氧，如超氧自由基(O2－·)等。这些活性氧
会造成植物细胞脂质过氧化，破坏细胞正常代
谢。此外，活性氧还可能诱发植物冻害[65 ]。为
研究超氧物歧化酶(SOD)在耐冻中的作用，早在
1989 年 Bowler 等[66]就把烟草的Mn-SOD cDNA 导
入苜蓿中，发现转基因植物的 S O D 活性增强。
1993年，McKersie等[67]用根瘤农杆菌介导法，将
烟草的 Mn-SOD cDNA 导入苜蓿中后发现，转基
因植株不仅抗冻性增强，而且对除莠剂的抗性也
增强，其后代在冻害胁迫后生长比没有转基因植
株快得多。他们认为是 Mn-SOD 抑制了超氧自由
基的产生，从而提高抗寒能力。
4.4 糖类基因途径 糖类与植物抗寒性关系密切。
抗寒性强的植物一般积累较多的可溶性糖，其对
防止脱水后的蛋白质变性具有保护作用；胞间糖
类通过影响冰晶生长来减轻寒害，保护细胞及其
内膜系统。H i n c h a 等[ 2 9 ] 将细菌焦磷酸酶
(phyrophophatase)基因与酵母菌的转化酶(b-呋喃
果糖苷酶)基因转化到烟草中后发现，可溶性碳水
化合物在转基因植株叶中积累，其表达细菌焦磷
酸酶的植株耐霜力比野生型烟草提高 1.2℃，而表
达酵母菌转化酶基因的烟草植株耐霜力也有所提
高。
5 展望
从本文介绍中可以得到以下几个结论，并引
出今后可能取得进一步进展的问题。
(1)植物在冷驯化过程中基因表达会发生改
变，诱发许多冷诱导蛋白，并已有部分抗冻基因
被分离和鉴定。
(2)植物在低温驯化过程中诱发合成的蛋白在
抗寒中的作用分为 3 类：一是行使酶的作用，催
化合成一些关键渗透调节物质；二是新合成的蛋
白质组入膜内或附着于膜表面，对膜起稳定作
用；三是作为在信号转导和低温诱导基因表达过
程中起调节作用的蛋白质因子。
(3)拟南芥的COR15a 基因对其抗冻性有着重
要作用，但目前对其在植物遇寒冻时稳定膜结构
的具体机制还不清楚，需要进一步深入研究；同
时在拟南芥抗冻基因调控方面还有许多不十分清楚
之处，也待进一步研究。
(4)植物中同样存在AFPs 蛋白，推测这些蛋
白有以下功能：降低原生质溶液冰点以尽量避免
植物体内形成冰晶；抑制冰晶的重结晶；修饰胞
外冰晶的生长形态；调节原生质体的过冷状态，
使过冷点降低等。但其具体作用机制还不很清
楚，有待进一步探讨。
研究植物抗冻基因最大的意义在于采用基因
工程手段改变一些非耐寒性植物的抗冻能力。目
前，在抗冻基因工程方面已从鱼类抗冻基因途
径、脂肪酸去饱和代谢关键酶基因途径、超氧物
歧化酶基因途径、糖类基因途径等 4 个方面取得
了一定的进展。其潜在的应用前景是不言而喻
的。
植物生理学通讯 第 40 卷 第 5期，2004 年 10 月 649
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