全 文 ：第 26 卷 第 4 期
2011 年 12 月
湖南科技大学学报(自然科学版)
Journal of Hunan University of Science ＆ Technology(Natural Science Edition)
Vol． 26 No． 4
Dec． 2011
刺糖菌素发酵工艺条件研究 ①
王能强1，黎小军2
(1．湖南科技大学 生命科学学院，湖南 湘潭 411201;2．新余学院 医学与生命科学学院，江西 新余 338000)
摘 要:刺糖菌素是由多刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)产生的次级代谢产物，是一种具有触杀及摄食毒性的广谱
杀虫剂．通过单因素实验和正交实验对菌株 Saccharopolyspora spinosa CT205 发酵产刺糖菌素的发酵条件进行了优化．结果表
明:该菌产刺糖菌素的发酵培养基添加可溶性淀粉、黄豆饼粉、Na2B4O7 和 CoCl2 可提高刺糖菌素的发酵单位，且得出发酵培
养基的初始 pH、摇瓶装量和接种量分别以 7． 0，30 mL /250 mL和 10%为最佳．正交实验分析得到最优的发酵培养基为葡萄糖
3． 0%、可溶性淀粉 3． 0%、棉籽粉 1． 0%、黄豆饼粉 1． 0%、CoCl20． 1 mg /L、NaB4O7 0． 1 mg /L．优化之后刺糖菌素的发酵单位达
到了 90． 21 μg /mL，比优化前提高了 78． 5% ．
关键词:刺糖菌素;杀虫剂;多刺糖多孢菌
中图分类号:Q93 文献标识码:A 文章编号:1672 － 9102(2011)04 － 0112 － 05
刺糖菌素(Spinosad)是由多刺糖多孢菌
(Saccharopolyspora spinosa)有氧发酵的胞内次级代
谢产物，其主要活性成分为刺糖菌素 A 组分
(spinosad A)和刺糖菌素 D组分(spinosad D)．多刺
糖多孢菌是一种新型的放线菌［1］，最初由一位化学
家在加勒比海度假时从一个废弃的甘蔗制甜酒厂附
近土壤中分离得到的，通过对其发酵液的抗蚊虫幼
虫活性测定发现了刺糖菌素． 刺糖菌素是一种具有
较强杀虫能力且无残留的新型杀虫剂，能有效防治
绝大部分鳞翅目、直翅目、双翅目和鞘翅目害虫． 因
其具有杀虫谱广、活性高、对非靶标动物无害和分解
产物安全等优点，于 1999 年获得美国“总统绿色化
学品挑战奖”［2］． 2005 年美国环保局批准将多杀菌
素用作储粮防护剂［3］，2008 年欧盟批准多杀菌素可
用于有机作物［4 － 5］．
影响刺糖菌素合成的因素较多，如碳源、氮源、
无机盐、微量元素、培养温度等．目前，国内外有关于
多刺糖多孢菌利用碳氮源、无机盐和前体情况的研
究报道如 Mertz等［1］，胡旭华等［6］，贺玉平等［7］和赵
伟等［8］，但对多刺糖多孢菌发酵产刺糖菌素所需的
发酵培养基单一组分的考察水平较少．此外，不同菌
株的遗传背景和代谢特性不同，刺糖菌素合成所需
的发酵条件也往往有差异．
鉴 于 此，本 文 以 实 验 室 保 存 的 菌 种
Saccharopolyspora spinosa CT205 为出发菌株，对其产
刺糖菌素的发酵工艺条件进行了研究，以获得最佳
的摇瓶发酵控制参数，为以后的中试放大以及工业
化生产提供可参考的技术参数和理论依据．
1 材料与方法
1． 1 菌种
Saccharopolyspora spinosa CT205(由 Saccharopolyspora
spinosa诱变获得) ，由本实验室保存．
1． 2 培养基
1)斜面培养基(g /L) :葡萄糖 5，麦芽糖 4，玉米
浆 5，酵母膏 3，MgSO4·7H2O2，琼脂 20;pH6． 7．
2)种子培养基(g /L) :葡萄糖 5，麦芽糖 4，玉米
浆 5，酵母膏 3，MgSO4·7H2O2;pH6． 7．
211
①
收稿日期:2011 － 01 － 14
基金项目:湖南省教育厅一般项目(09C380)
通信作者:王能强(1978 －) ，男，江西瑞昌人，硕士，讲师，主要从事微生物工程和环境微生物研究． E － mail:wang_780214@ 126． com
3)发酵培养基(g /L) :葡萄糖 60，棉籽粉 25，玉
米浆 20，油酸甲脂 10，CaCO3 5;pH6． 7．
1． 3 培养方法
1)斜面培养法:从原斜面上用接种环挑取孢子
到试管斜面上，30 ℃培养 8 d后放于冰箱保存．
2)种子培养法:从斜面上用接种铲铲几铲刺糖
菌素琼脂块于装有 50 mL 种子培养基的 250 mL 摇
瓶中，使其在 30 ℃，200 r /min 的回转摇床上培养
3 d．
3)摇瓶发酵培养法:以 15%的接种量从种子培
养液中吸取若干毫升于装有 40 mL 发酵培养基的
250 mL摇瓶中，然后在 30 ℃，200 r /min 的回转摇
床上培养 8 d．
1． 4 刺糖菌素发酵单位的测定方法
取发酵液若干毫升，以 1 ︰ 1 比例(v /v)加入甲
醇后，浸泡数小时，离心，取上清液，采用高效液相
(HPLC)测定其发酵单位．色谱条件:流动相为甲醇
︰乙睛︰水 = 6 ︰ 3 ︰ 1，色谱柱型号为 ODS － C18，
流速为 1． 0 mL /min，检测波长为 250 nm．
2 结果与分析
2． 1 复合碳源对发酵的影响
研究了 3%的葡萄糖分别与 3%的蔗糖、可溶性
淀粉、木糖、麦芽糖、糊精、葡萄糖构成的复合碳源对
刺糖菌素发酵的影响(其他培养基成分不变，下
同)．其实验结果如图 1．
1 － soluble starch，2 － dextrine，3 － xylose，4 － maltose，5 －
sucrose，6 －对照
图 1 碳源对刺糖菌素发酵的影响
Fig． 1 Effect of compound carbon source on spinosad
fermentation
图 1 表明，葡萄糖除与木糖构成的复合碳源的
发酵单位比单一的以葡萄糖作碳源低外，其他的组
合都要比单一的碳源高，且以葡萄糖与可溶性淀粉
构成的复合碳源为最高，其刺糖菌素的发酵单位达
到了 70． 62 μg /mL，且与单一碳源葡萄糖相比提高
了 14． 24 μg /mL．
2． 2 复合氮源对发酵的影响
研究了 1． 5%的棉籽粉分别与 1． 0%牛肉膏、
(NH4)2SO4、鱼粉、花生饼粉、黄豆饼粉构成的复合
氮源对刺糖菌素发酵的影响．其实验结果如图 2．
1 － beef extract，2 －(NH4)2 SO4，3 － fish meal，4 － peanet mill，
5 － soybean mill，6 －对照
图 2 氮源对刺糖菌素发酵的影响
Fig． 2 Effect of compound nitrogen source on spinosad
fermentation
图 2 表明，复合氮源能提高刺糖菌素的发酵单
位，其中黄豆饼粉 +棉子粉为最好，产量达到 73． 36
μg /mL 左右，且与单一氮源棉子粉相比提高了
30. 24 μg /mL．
2． 3 培养基中添加金属离子对发酵的影响
在发酵培养基中添加 0． 5 mg /L 的金属离子盐
KNO3，FeSO4 · 7H2O，CuSO4，ZnSO4，Na2B4O7，
CoCl2，MnSO4，MgSO4·7H2O进行摇瓶发酵，考查这
些金属离子盐对刺糖菌素发酵的影响． 其实验结果
如图 3．
1 －对照，2 － CoCl2，3 － Na2B4O7，4 － ZnSO4，5 － CuSO4，6 －
FeSO4·7H2O，7 － MnSO4，8 － MgSO4·7H2O，KNO3
图 3 金属离子对刺糖菌素发酵的影响
Fig． 3 Effect of compound nitrogen source on spinosad
fermentation
图 3 表明，添加金属离子盐 ZnSO4，Na2B4O7，
CoCl2 对刺糖菌素的发酵单位有所提高，特别是
Na2B4O7，CoCl2 的提高幅度比较大，提高幅度有
10%左右．而其他金属离子的添加反而降低了刺糖
311
菌素的发酵单位．
2． 4 发酵工艺条件对刺糖菌素发酵的影响
2． 4． 1 不同时间的变温发酵试验
对于大多数次级代谢产物来讲，菌体生长和产
物合成的最适温度往往不同，且作者通过预实验得
出菌株 Saccharopolyspora spinosa CT205 最适的生长
温度为 30 ℃，刺糖菌素生物合成的最适温度为 28
℃ ．因此本文研究采用变温发酵的方法来提高刺糖
菌素的发酵单位．试验过程为从发酵的第 3 d 开始，
每隔 1 d 从正常培养温度 30 ℃的摇床上拿出 2 瓶
到 28 ℃的摇床上培养到结束，通过测定刺糖菌素的
发酵单位来考查不同时间的变温对发酵的影响． 结
果见图 4．
图 4 变温时间对发酵单位的影响
Fig． 4 Effect of time of change temperature on spinosad
fermentation
图 4 表明，变温发酵能显著的提高刺糖菌素的
发酵单位，且得出从发酵的第 4 d 开始变温的效果
最佳，其发酵单位达到了 66． 96 μg /mL，比原来的发
酵单位提高了 13． 78 μg /mL．
2． 4． 2 培养基初始 pH值对发酵的影响
采用 10 种初始 pH 值来考查发酵培养基不同
的初始 pH值对刺糖菌素发酵的影响． 其实验结果
如图 5．图 5 表明，当培养基的初始 pH 值为 7． 0 时
刺糖菌素的发酵单位最高．
图 5 初始 pH值对发酵单位的影响
Fig． 5 Effect of pH of production medium on spinosad
fermentation
2． 4． 3 摇瓶装量对发酵的影响
用 250 mL 三角瓶分别装入 20 mL，30 mL，40
mL，50 mL，60 mL 和 70 mL 的发酵培养基，按 15%
的接种量接入摇瓶进行发酵培养，其实验结果见图
6．从图 6 可以看出在 250 mL 三角瓶中装 30 mL 是
最好的．因为摇瓶装量越高传氧系数越低不利于供
氧，而装量太少容易增加发酵液的蒸发．
图 6 摇瓶装量对发酵的影响
Fig． 6 Effect of the capacity of medium in 250 mL flask on
spinosad fermentation
2． 4． 4 接种量对发酵的影响
分别采用 5%，10%，15%，20%的接种量来考
查接种量对发酵的影响．结果见图 7．图 7 表明 10%
的接种量为最好．
图 7 接种量对发酵的影响
Fig． 7 Effect of sizes of the inoculum on s on spinosad
fermentation
2． 5 正交试验
由以上的实验得出最佳的复合碳、氮源为可溶
性淀粉 +葡萄糖，黄豆饼粉 +棉籽粉;且在培养基中
添加金属离子的盐 Na2B4O7，CoCl2 能提高刺糖菌素
的发酵单位．为了考查这些因素的相关性，采用正交
设计进行考察．各因素水平见表 1．正交试验的结果
见表 2．
411
表 1 正交 6 因素 3 水平实验设计
Tab． l The experiment design of 6 factors and 3 levels of orthogonal
水平
因素
葡萄糖 可溶性淀粉 棉子粉 黄豆饼粉 CoCl2 Na2B4O7
% % % % mg /L mg /L
1 3． 0 3． 0 2． 0 0． 5 1． 0 0． 1
2 4． 0 2． 0 1． 5 1． 0 0． 5 0． 5
3 5． 0 1． 0 1． 0 1． 5 0． 1 1． 0
表 2 正交试验设计及结果
Tab． 2 Result s of orthogonal design for the biosynthesis of spinosad
试验号 葡萄糖(A) 淀粉(B) 棉子粉(C) D 黄豆饼粉(E) CoCl2(F) Na2B4O7(G) 发酵单位 /(μg /mL)
1 1 1 1 1 1 1 1 59． 26
2 1 2 2 2 2 2 2 67． 17
3 1 3 3 3 3 3 3 53． 43
4 2 1 1 2 2 3 3 53． 01
5 2 2 2 3 3 1 1 26． 66
6 2 3 3 1 1 2 2 22． 53
7 3 1 2 1 3 2 3 35． 83
8 3 2 3 2 1 3 1 47． 10
9 3 3 1 3 2 1 2 26． 93
10 1 1 3 3 2 2 1 78． 07
11 1 2 1 1 3 3 2 31． 83
12 1 3 2 2 1 1 3 28． 21
13 2 1 2 3 1 3 2 73． 65
14 2 2 3 1 2 1 3 50． 68
15 2 3 1 2 3 2 1 35． 74
16 3 1 3 2 3 1 2 43． 48
17 3 2 1 3 1 2 3 46． 44
18 3 3 2 1 2 3 1 61． 20
19(对照) 6． 0% 2． 5% 49． 90
K1 53． 00 57． 22 42． 20 46． 20 39． 20 51． 34
K2 43． 71 44． 98 48． 79 56． 18 47． 63 44． 27
K3 43． 50 38． 01 49． 22 37． 83 53． 37 44． 60
R 9． 50 19． 21 7． 02 18． 35 14． 17 7． 07
由正交表极差分析(表 2)可知:(1)菌株 CT205
发酵 生 产 刺 糖 菌 素 的 最 佳 培 养 基 组 成 为
A1B1C3E2F3G1，即葡萄糖 3． 0%、可溶性淀粉 3．
0%、棉籽粉 1． 0%、黄豆饼粉 1． 0%，CoCl2 0． 1
mg /L，NaB4O7 0． 1 mg /L．(2)RB ＞ RE ＞ RF ＞ RA ＞ RG
＞ RC，即淀粉是影响菌株 CT205 发酵生产刺糖菌素
最重要的因素，其余依次为黄豆饼粉、CoCl2、葡萄
糖、Na2B4O7 和棉籽粉的初始质量浓度．
2． 6 验证实验
经过上述的单因素和正交实验，得到优化后的
最佳发酵培养基组合和发酵条件，在上述最佳条件
下进行多次摇瓶实验进行综合的验证，得出刺糖菌
素的发酵单位为 90． 21 μg /mL，比优化前(50． 54
μg /mL)提高了 78． 5% ．
3 结论
综上研究得知，菌株 Saccharopolyspora spinosa
CT205 发酵产刺糖菌素的最适培养基组成为葡萄糖
3． 0%，可溶性淀粉 3． 0%，棉籽粉 1． 0%，黄豆饼粉
1． 0%，CoCl2 0． 1 mg /L，NaB4O7 0． 1 mg /L，玉米浆
2. 0%，油酸甲酯 1． 0%，CaCO30． 5%，初始 pH7． 0;
刺糖菌素生产的最适培养条件为 250 mL 三角瓶中
装 30mL培养基，接种量 10%，培养温度为 30 ℃培
养3 d，然后在 28 ℃再发酵培养 5 d． 在上述条件下
511
进行刺糖菌素的生产，刺糖菌素的发酵单位由原来
的 50． 54 μg /mL 提高到 90． 21 μg /mL，提高了
78． 5% ．
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Study on the technological conditions of spinosad fermentation
WANG Neng － Qiang1，LI Xiao － Jun2
(1． College of Life Science，Hunan University of Science and Technology，Xiangtan 411201，China;
2． Medical and Biological Engineering Department，Xinyu University，Xinyu 338000，China)
Abstract:Spinosyns are secondary metabolites from the aerobic fermentation of Saccharopolyspora spinosa．
Spinosyn is a kind of broad － spectrum insecticide，which has contact and ingestion toxicity on insects．
Optimization of spinosyn fermentation conditions was carried out through mono － factor and orthogonal experiments
by strain Saccharopolyspora spinosa CT205． The results showed that fermentation medium which added soluble
starch、soybean mill、Na2B4O7 and CoCl2 improve spinosyn fermentation unit，and the optimum fermentation medium
initial pH、inoculum and the capacity of medium in 250mL flask were 7． 0、10%(v /v)and 30mL，respectively． The
results of orthogonal experiment showed that the optimal fermentation medium were:glucose 3%，starch 3%，
cottonseed meal 1． 0%，soybean mill 1． 0%，CoCl2 0． 1mg /L，NaB4O7 0． 1mg /L． Under the optimal condition
mentioned above，the fermentation unit of spinosyn is 90． 21μg /mL，which is increased by 78． 5% compared with
the value before optimization．
Key words:spinosyn;insecticide;Saccharopolyspora spinosa
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