全 文 ：百日草几丁质酶基因片段克隆及其序列分析
张振鲁1，2，3，张佳诗2，隋 丽2，李启云2，王金刚3，盛 岩1* ，杜 茜2* ，汪洋洲2
(1．中国人民大学环境学院，北京 100872;2． 吉林省农业科学院植物保护研究所 /农业部东北农作物有害生物综合治理重点实验室，吉林长春
130033;3．东北农业大学园艺学院，黑龙江哈尔滨 150030)
摘要 ［目的］克隆百日草几丁质酶的基因片段，并对其序列进行分析。［方法］以百日草“梦境”系列为材料，提取其叶片总 ＲNA，并根
据其他植物几丁质酶基因保守序列设计简并引物，通过 ＲT-PCＲ克隆百日草几丁质酶基因片段( ZEchi) ，并对该基因序列进行分析。
［结果］克隆得到的片段长度为 227 bp，共编码 75个氨基酸残基;核苷酸同源性分析表明，ZEchi与已报道的其他植物几丁质酶基因同源
性达 70%以上，其中与葡萄的同源性最高，为 74% ;氨基酸同源性分析表明，该几丁质酶多肽属于 18 家族几丁质酶，且与已报道的其他
植物几丁质酶氨基酸序列具有 70%以上的相似性;氨基酸聚类分析表明，该几丁质酶多肽与白车轴草和蒺藜苜蓿的几丁质酶聚类; 生物
信息学分析表明，由该基因片段编码的多肽为非跨膜蛋白，主要含 α螺旋和随机线圈螺旋等二级结构。［结论］该研究为进一步研究几
丁质酶基因的功能奠定了基础。
关键词 百日草;几丁质酶基因;克隆;序列分析
中图分类号 S681． 9 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611( 2013) 25 －10256 －03
Gene Cloning and Sequence Analysis of Chitinase Gene in Zinnia elegans
ZHANG Zhen-lu et al ( School of Environment and Natural Ｒesources，Ｒenmin University of China，Beijing 100872)
Abstract ［Objective］The aim was to clone and analyze the sequence of chitinase gene segment in Zinnia elegans． ［Method］Using the
“Dreamland”series of Z． elegans as materials，the total ＲNA of the leaves was extracted from． The degenerate primers were designed accord-
ing to the conservative sequences of chitinase gene in other plants，and the chitinase gene segment of Z． elegans ( ZEchi) was cloned by ＲT
－ PCＲ，and then the gene sequence was analyzed． ［Ｒesult］The cloned segment was 227 bp and encoded 75 amino acid residues; homology
analysis of the nucleotides showed that the sequence of ZEchi had more than 70% similarity with those of other reported plants’chitinase
gene，and it had the highest homology with Vitis vinifera of 74% ; homology analysis of the deduced amino acids showed that the chitinase poly-
peptide belonged to the 18 family chitinase and the sequence had more than 70% similarity with those of other reported plants’chitinase; ami-
no acids cluster analysis showed that the chitinase polypeptide was clustered together with Trifolium repens and Medicago truncatula; bioinfor-
matics analysis showed that the polypeptide was not a transmembrane protein and mainly contained two secondary structure of alpha helix and
random coil． ［Conclusion］The study laid a foundation for the further study on the function of chitinase gene．
Key words Zinnia elegans; Chitinase gene; Clone; Sequence analysis
基金项目 农业部转基因重大专项( 2013ZX08004-004) ;吉林省科技厅科技
条件与平台建设—吉林省科技基础条件平台建设项目
( 20122105) ;吉林省农科院植保所青年基金项目 ( zbs2010-01) 。
作者简介 张振鲁( 1988 － ) ，男，山东滨州人，硕士研究生，研究方向: 农
业微生物与分子生物学，E-mail: zhangzhenluwenchao@ 163．
com。* 通讯作者，盛岩，副教授，从事生态学研究，E-mail:
shengyan@ ruc． edu． cn;杜茜，副研究员，从事农业微生物研究，
E-mail: dqzjk@163． com。
收稿日期 2013-07-24
几丁质酶(Chitinase，EC3． 2． 1． 14)是微生物、昆虫及植
物中广泛存在的一种可降解几丁质的糖苷酶。由于具有降
解真菌细胞壁的主要成分几丁质的作用，而植物体内却不存
在几丁质［1］，因此认为几丁质酶在植物抗真菌病害中有重要
作用，从而使得该酶得到广泛研究［2］。在正常情况下植物体
内的几丁质酶含量非常低，但当植物受到外源因子如真菌、
细菌、病毒及其他因子的影响后，植物体内的几丁质酶含量
和活性会迅速升高［3］，特别是在 β-1，3-葡聚糖酶的协同作用
下可明显抑制真菌的生长［4］。而植物几丁质酶基因除在植
物抗病、抗虫中起重要作用外，还在植物发育、共生固氮［5］和
抗冻［6］等方面也发挥重要作用，而关于植物几丁质酶基因的
克隆最早是由 Broglie等以菜豆为材料完成的［7］。随着人们
对其生化特性、作用机理和表达调控等方面的研究逐渐深
入，几丁质酶逐渐成为分子生物学和植物抗病基因工程领域
的研究热点［8］。
百日草(Zinnia elegans Jacq．)为菊科百日草属一年生草
本植物，是世界著名草花，因其花大色艳、花期长，在园林中
被广泛应用，是绿化的主栽种之一。但在其生长周期中易发
生叶斑病、黑斑病、花叶病和白粉病等病害，严重影响其观赏
价值。该试验以百日草“梦境”系列为试材，根据 GenBank中
收录的其他植物几丁质酶基因设计引物，从百日草叶片 cD-
NA中克隆几丁质酶基因，并与已知植物几丁质酶基因序列
进行同源性比较，为进一步研究该基因功能奠定基础。
1 材料与方法
1． 1 材料 试验于 2012年 5月至 2012年 11月在吉林省农
业科学院植物保护所生物农药实验室进行。百日草“梦境”
系列，购于内蒙古赤峰园艺公司，百日草黑斑病菌即百日草
链格孢真菌(Alternaria zinniae)由实验室分离保存。
DNA胶回收试剂盒购自 Axygen;DNA Marker 购于北京
全式金生物科技有限公司;ＲNA提取试剂购于大连宝生物有
限公司;DNA消化酶 DNaseⅠ和反转录试剂盒购于 Fermentas;
DEPC购于鼎国生物科技有限公司;PCＲ相关试剂及卡那霉
素、氨苄青霉素均购于上海生工生物工程公司。
1． 2 总 ＲNA提取及第一链 cDNA合成 取经百日草链格
孢真菌处理后 24 h的百日草叶片，用 ＲNAiso Plus总 ＲNA提
取试剂(TaKaＲa公司)提取叶片总 ＲNA，具体步骤按说明书
进行。将提取的 ＲNA用 DNaseⅠ消化其中的 DNA，电泳检测。
以经 DNaseⅠ处理的 ＲNA为模板，利用 Fermentas公司的 Ｒe-
vertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 进行第一链 cDNA 合
成，具体操作根据说明书进行。
责任编辑 朱琼琼 责任校对 卢瑶安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2013，41(25):10256 － 10258，10398
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2013.25.082
1． 3 引物设计 从 GenBank中搜索出 9种植物的 ClassⅢ几
丁质酶基因的氨基酸序列和 cDNA 序列，通过 DNAMAN 软
件进行序列比对，发现 3 段相对保守的序列:YWGQNG，W
(IV)QFYNN和 YGGVML，根据这 3 段保守序列找到相对应
的 cDNA序列，通过 Prime 5． 0设计 2对简并引物(5-3):
ZE1F:TACTGGGGCCAＲAACGG
ZE1Ｒ:AＲCATNACWCCTCCATA
ZE2F:TGGＲTTCAＲTTCTACAATAA
ZE2Ｒ:AGCATNACWCCWCCGTA
1． 4 百日草几丁质酶基因中间片段分离 利用巢式 PCＲ
进行扩增，首先以 ZE1F /ZE1Ｒ为引物进行扩增，PCＲ反应体
系为:cDNA 1． 0 μl、5 U /μl Taq DNA 聚合酶 0． 5 μl、2． 5
mmol /L dNTPs 2． 0 μl、10 × buffer 2． 5 μl、2． 5 mmol /L MgCl2
2． 0 μl、10 μl /L ZE1F 1． 0 μl、10 μl /L ZE1Ｒ 1． 0 μl、ddH2O
10． 0 μl。PCＲ反应程序为:94 ℃预变性 5 min;94 ℃变性 30
s，51 ℃复性 30 s，72 ℃延伸 30 s，35 个循环;72 ℃延伸 10
min。然后将第 1轮 PCＲ反应产物稀释 50 倍作为第 2 轮反
应模板，以 ZE2F /ZE2Ｒ为引物，退火温度为 48 ℃，进行第 2
轮 PCＲ反应，反应体系、条件与第 1轮反应相同，然后用 1%
的琼脂糖凝胶电泳检测 PCＲ产物。用 Axygen公司 的 DNA
凝胶回收试剂盒回收目的片段，将目的片段连接至 pMD18-T
载体(TaKaＲa)后转化感受态细胞，挑取白色单菌落于 LB液
体培养基中，37 ℃、180 r /min 振荡培养 12 h，对菌液进行
PCＲ检测，阳性菌液送上海生工公司测序。
2 结果与分析
2． 1 百日草叶片总 ＲNA提取 试验用 ＲNAiso Plus提取试
剂盒提取百日草叶片中的总 ＲNA，电泳检测结果(图 1)表
明:有明显的 18S、28S和 5S 3个条带，说明提取的总 ＲNA完
整，无降解，经紫外分光光度计检测:ＲNA 的浓度为 2． 36
mg /ml，OD260 /OD280值为 1． 89，说明 ＲNA 质量较好，可用于
ＲT-PCＲ反应。
图 1 百日草叶片总 ＲNA
2． 2 百日草几丁质酶基因片段克隆 用 ZE1F /ZE1Ｒ 和
ZE2F /ZE2Ｒ作为引物进行巢式 ＲT-PCＲ扩增，可得到较为特
异的 PCＲ产物。PCＲ产物通过 1%的琼脂糖凝胶电泳检测，
得到约 200 bp的 DNA片段，与预测的目的片段大小基本一
致(图 2)。
注:M． DNA Marker;1． ＲT-PCＲ产物。
图 2 克隆百日草几丁质酶基因琼脂糖电泳结果
用 Axygen公司的 DNA 凝胶回收试剂盒回收扩增到的
目的片段，并将其与 pMD18 － T vector 载体连接，然后转化至
大肠杆菌 DH5α中。挑取转化平板上的单菌落于具有 Amp
抗性的 LB液体培养基中，37 ℃过夜培养后进行菌液 PCＲ，
并用电泳检测 PCＲ产物，结果如图 3 所示，从菌液中扩增出
约 200 bp的片段，证明克隆载体中插入了目的片段。将阳性
菌液送上海生工公司测序，测序结果为 ZEchi 的长度为 227
bp，序列见图 4。
注:M． DNA Marker;1．菌液 PCＲ产物;2．阴性对照。
图 3 菌液 PCＲ产物电泳图谱
2． 3 百日草几丁质酶序列分析
2． 3． 1 百日草几丁质酶基因序列及其氨基酸序列的同源性
分析。将由 227 bp组成的 ZEchi 基因的核苷酸序列及其编
码的 75个氨基酸序列在 http:/ /blast． ncbi． nlm． nih． gov上进
行 blast同源性检索分析，结果表明 ZEchi与葡萄、番茄、蒺藜
苜蓿、大豆、白车轴草等几丁质酶基因相应区段的核苷酸序
列及其编码氨基酸序列的同源性都在 70%以上，充分说明
ZEchi为植物几丁质酶基因家族的成员，blastp 结果显示
ZEchi为 18家族几丁质酶基因。
2． 3． 2 百日草几丁质酶基因氨基酸序列的同源性分析。利
用 DNAMAN软件将其他 9种植物的几丁质酶基因编码的氨
基酸序列及 ZEchi基因所编码的氨基酸序列进行同源聚类
分析，结果如图 5 所示。由图 5 可知，所有比对的几丁质酶
7520141 卷 25 期 张振鲁等 百日草几丁质酶基因片段克隆及其序列分析
注:横线部分为引物位置。
图 4 ZEchi基因测序结果
具有 65%的同源性，且分别在 69%和 93%的分枝点上分成
两组。对同源性 69%分枝点上的组进行聚类分析，发现百日
草几丁质酶与白车轴草(Trifolium repens)和蒺藜苜蓿(Medi-
cago truncatula)的同源性高达 78%。
表 1 ZEchi与其他植物几丁质酶核苷酸及氨基酸序列的同源性比较
种名(拉丁名)
GenBank
登录号
与 ZEchi核苷酸
序列同源率∥%
与 ZEchi氨基酸
序列同源率∥%
葡萄(Vitis vinifera) AJ291507
ACH54087
74 70
葡萄(Vitis vinifera) XM002264867
BAC653261
74 70
番茄(Solanum lycop-
ersicum)
XM004234164
XP004234212
73 71
蒺藜苜蓿(Medicago
truncatula)
XM003592107
XP003592155
73 71
白车轴草(Trifolium
repens)
AJ011941
CAB65476
73 79
大豆(Glycine max) XM003556091
XP003540115
71 73
2． 3． 3 百日草几丁质酶基因氨基酸序列的生物信息学分析。
2． 3． 3． 1 百日草几丁质酶基因片段的跨膜螺旋信号分析。
用 TMHMM 2． 0 在线软件(http:/ /www． cbs． dtu． dk /services /
TMHMM/)对氨基酸序列进行跨膜螺旋信号分析，该软件是
针对每个氨基酸残基的跨膜螺旋信号和最后可能性结论的
预测两方面进行分析的，结果如图 6 所示，该序列中并未检
测到跨膜螺旋信号，说明此多肽片段非跨膜蛋白。
2． 3． 3． 2 百日草几丁质酶多肽二级结构的预测。将百日草
几丁质酶基因片段的氨基酸序列用 SPOMA程序进行蛋白质
二级结构的预测，结果如由图 7和表 2，可看出该几丁质酶片
段主要由 α螺旋(h)和随机线圈螺旋(c)组成，分别占 36%
和 40%，此外还含有少量的 β转角(t)和伸展链(e)。
图 5 10种植物几丁质酶氨基酸序列的同源性聚类分析
图 6 百日草几丁质酶基因跨膜螺旋信号分析
图 7 百日草几丁质酶多肽二级结构分析
(下转第 10398页)
85201 安徽农业科学 2013年
参考文献
［1］COLBECK S C． The layered character of snow covers［J］． Ｒev Geophys，
1991，29(1):81 －96．
［2］DOMINE F，ALBEＲT M，HUTHWELKEＲ T，et al． Snow physics as rele-
vant to snow photochemistry ［J］． Atmospheric Chemistry and Physics，
2008，8(2):71 －78．
［3］NOLIN A W，STＲOEVE J C． The changing Aledo of the Greenland ice
sheet:Implications for climate change［J］． Annals of Glaciology，1997，25:
51 －57．
［4］NOLIN A W，DOZIEＲ J． Estimating Snow Grain Size Using AVIＲIS Data
［J］． Ｒemote sensing of Environment，1993，44:231 －238．
［5］张茂根．颗粒统计平均粒径及其分布的表征［J］．高分子材料科学与工
程，2000，16(5):1 －4．
［6］TEＲENCE ALLEN． Particle Size Measurement［M］． Third Edition． Lon-
don:Chapman and Hall Ltd．，1981．
［7］姜腾龙，赵书河，肖鹏飞，等．基于实测数据的不同雪粒径光谱分析
［J］．冰川冻土，2009，31(2):227 －232．
［8］郭忠明．雪粒径遥感反演研究进展［J］．冰川冻土，2011，33(3):539 －
545．
［9］郝晓华，王杰，王建．北疆地区不同雪粒径光谱特征观测及反演研究
［J］．光谱学与光谱分析，2013，33(1):190 －194．
［10］郭忠明，王宁练，毛瑞娟．基于 MODIS 反演祁连山七一冰川雪粒径
［J］．地理科学，2013，33(3):378 －384．
［11］杨与广，刘志辉．天山北坡融雪期土壤湿度特征及其影响因子［J］．干
旱区研究，2012，29(1):
檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪
173 －178．
(上接第 10258页)
表 2 百日草几丁质酶多肽的二级结构分析结果
类型 数目 比例∥%
Alpha hellx (Hh) 27 36． 00
Extended strand (Ee) 11 14． 67
Beta turn (Tt) 7 9． 33
Ｒandom coll (Cc) 30 40． 00
2． 3． 3． 3 百日草几丁质酶多肽三级结构的预测。用 SWISS
－ MODEL同源建模方法，对百日草几丁质酶多肽的三级结
构进行分析，结果如图 8所示。在该三维结构图中可清晰地
看到两段 α螺旋及其中的其他二级结构。
图 8 百日草几丁质酶多肽的三维模型
3 结论与讨论
几丁质酶作为植物体内一种与防御相关的次生水解酶，
能催化真菌细胞壁的主要成分之一几丁质的水解，从而抑制
真菌的生长，因此，该酶是植物广谱防御机制的一个重要成
分［9］。自 1986年 Broglie首次从菜豆中分离到几丁质酶基因
以来，许多已分离的植物几丁质酶基因已用于转基因工程来
增强转基因植物的抗病性，如根据 Sela － Buurlage等的报道，
转几丁质酶基因的烟草提高了对真菌病害的抗性［4］。
该研究首次成功的从百日草中克隆到几丁质酶基因的
片段，其 blastn 结果显示，该片段与葡萄(登录号为
EU935006、AB105374)、辣椒(登录号为 AF435024)和白羽扇
豆(登录号为 Y16415)等的 ClassⅢ的几丁质酶基因序列都有
70%以上的同源性，因此根据植物几丁质酶蛋白氨基酸序列
的结构特征分类［10 －11］，推测所克隆到的百日草几丁质酶基
因属于 ClassⅢ类几丁质酶基因。
对该片段的氨基酸序列进行生物信息学分析可知，该序
列的二级结构主要包括 α螺旋和随机线圈螺旋，但序列中不
含跨膜螺旋信号和信号肽结构。这可能与所克隆片段在完
整几丁质酶基因中的位置有关，信号肽序列一般在酶的 N
端，而在克隆该片段时笔者设计的引物在基因靠近 C端的保
守区域，因此该片段检测不到信号序列。此外关于百日草几
丁质酶基因的全长及其结构与功能还有待于进一步的研究。
参考文献
［1］MANOCHA M S，ZHONGUA Z． Immunocyto chemical and cyto-chemical
localization of chiticase and chitin in the infected hosts of a biotrophic my-
coparasite，Piptocephalis virginiana［J］． Mycologia，1997，89(2):185 －194．
［2］SHIBUYA N，MNAMI E． Oligosaccharide signaling for defense response in
plant［J］． Physiol Mol Plant Pathol，2001，159:223 －233．
［3］LINTHOＲT H J M． Pathogenesis － related proteins of plants［J］． Critical
Ｒeviews in Plant Sciences，1991，10:123 －150．
［4］SELA-BUＲＲLAGE M B，PONSTEIN A S． Only specific tobacco (Nicoti-
ana tabacum)chitinase and β-1，3-glucanases exhibit anti-fungal activity
［J］． Plant Physioly，1993，101:857 －863．
［5］张志忠，吴菁华，吕柳新，等．植物几丁质酶及其应用研究进展［J］．福
建农林大学学报:自然科学版，2005，34(4):494 －499．
［6］STＲESSMANN M，KITAO S，GＲIFFITH M，et al． Calcium interacts with
antifreeze proteins and chitinase from cold-acclimated winter rye［J］． Plant
Physiol，2004，135:364 －376．
［7］BＲOGLIE K E，GAVNOＲ J J，BＲOGLIE Ｒ M． Ethylene-regulated gene ex-
pression:molecular cloning of the genes encoding an endochitinase from
Phaseolus vulgaris［J］． Proceedings of the National Academy of Sciences of
the USA，1986，83(18):6820 －6824．
［8］王全伟，曲敏，张海玲，等．菜豆几丁质酶基因 Bchi的克隆及其在转移
基因烟草中的表达［J］．分子植物育种，2008，6(1):53 －58．
［9］VAN LOON L C，VAN STＲIEN E A． The families of pathogenesis-related
proteins，their activities and comparative analysis of PＲ-1 type proteins
［J］． Physiol Mol Plant Pathol，1999，55:85 －97．
［10］BEINTEMA J J． Structure feature of plant chitinase and chitin-binding
proteins［J］． Federation of European Biochemical Societies Lett，1994，350
(2 /3):159 －162．
［11］BＲAMELD K A，GODDAＲD W A． The role of enzyme distortion in the
single displacement mechanism of family 19 chintinase［J］． Proc Natl
Acad USA，1998，95(8):4276 －4281．
［12］徐恩静，闫小燕，王志学，等．低温处理对小麦几丁质酶活性的影响
［J］．安徽农业科学，2011，39(22):13324 －13325．
［13］阎瑞香，李宁．重组几丁质酶对采后葡萄贮藏过程中抗病效果的研究
［J］．华北农学报，2012(6):158 －162．
［14］唐勇军，彭丽莎，邹俊，等．几丁质酶产生菌的抗真菌活性及对水稻的
保护作用［J］．湖南农业科学，2011(5):23 －25．
［15］SUN Z X，ZHOU Y． Effect of Chitinase － Producing Strain V －8 on Con-
trolling Cotton Fusarium Wilt［J］． Agricultural Science ＆ Technology，
2012，13(11):2306 －2310．
89301 安徽农业科学 2013 年