全 文 ：西北植物学报 , 2010 , 30(5):0894-0900
Acta Bot.Boreal.-Occident.Sin.
　　文章编号:1000-4025(2010)05-0894-07 ①
薇甘菊几丁质酶基因的原核表达及活性分析
李冬梅1 , 2 ,彭少麟2＊
(1广东省农业科学院 花卉研究所,广州 510640;2 中山大学 生命科学学院 有害生物控制与资源利用国家重点实验室 , 广州
510275)
摘　要:将薇甘菊 Mmchi1 基因 cDNA 序列的编码区插入到原核表达载体 pE T-32a(+)中 , 构建融合表达质粒 , 并
在大肠杆菌中进行了融合蛋白 6×His-M mchi1 的诱导表达 、Western blo t 和酶活性分析.结果表明 , 0.1 mmo l/L
IPTG、25℃诱导 4 h , 在大肠杆菌 Roset ta-gami(DE3)中能获得可溶性的 6×His-Mmchi1;Western blo t证实表达的
6×His-Mmchi1 能与抗 6×His 的单抗发生特异性反应 , 分子量约为 55 kD ,与预测的融合蛋白分子量相符;纯化后
的 6×His-Mmchi1 最佳酶活性 pH 和温度分别为 5.5 ～ 6.5 和 35 ～ 40℃.为进一步研究融合蛋白 6×His-Mmchi1
的功能奠定了基础.
关键词:薇甘菊;几丁质酶基因;融合蛋白;原核表达
中图分类号:Q786 文献标识码:A
Expression and Activity Analysis of a Chitinase Gene from
Mikania micrantha in Escherichia coli
LI Dong-mei1 , 2 , PENG Shao-lin2＊
(1 Floricultural Research In sti tu te , Guangdong Academ y of Ag ricultural Science , Guangzhou 510640 , China;2 State Key Lab ora-
t ory of Biocont rol , S chool of Life Sciences , Sun Yat-Sen University , Guangzhou 510275 , C hina)
Abstract:The fused expression plasmid w as constructed by inserting the coding region of chit inase gene
(Mmchi1)f rom Mikania micrantha H .B.K.into the prokary otic expression vecto r pET-32a (+).Its in-
duced expression in Escherichia coli cells as fusion protein 6×His-Mmchi1 carried out Western blo t and
enzyme activi ty analy ses.The results show ed tha t the soluble fusion pro tein (6×His-Mmchi1)was pro-
duced at a high level in E .coli Roset ta-gami(DE3)cells w hen induced by 0.1 mmol/L IPTG at 25℃ fo r 4
h.Western blot analy sis revealed that the fusion protein(6×His-Mmchi1)could be recognized by anti-6×
His monoclonal antibody .The molecular mass of 6×His-Mmchi1 w as about 55 kD which w as ag reed w ith
the predicted mo lecula r mass.The optimal temperature and pH of purified 6×His-Mmchi1 w ere deter-
mined to be 5.5 ～ 6.5 and 35 ～ 40℃, respect ively.This study established the foundation for future resear-
ches on the funct ion of the fusion protein(6×His-Mmchi1).
Key words:Mikania micrantha ;chitinase gene;fusion protein;prokary ot ic expression
　　植物通常激活几种不同的应答机制来应对病原
菌入侵和环境胁迫.其中 ,最重要的一种机制就是累
积病程相关蛋白(pathogenesis-related proteins ,
PR).植物几丁质酶(EC 3.2.2.14)是 PR蛋白家族
的成员 ,其中一些植物几丁质酶被证实能降解病原
菌细胞壁中的角素或壳质 ,而在植物的防御反应中
①收稿日期:2009-12-08;修改稿收到日期:2010-03-29
基金项目:教育部重点基金项目(704037)资助
作者简介:李冬梅(1980-),女(汉族),博士 ,主要从事植物分子生态学研究.E-mail:biology.li2008@163.com
＊通讯作者:彭少麟 ,博士 ,教授 ,主要从事生态学研究.E-mai l:lss psl@mail.sy su.edu.cn
起着重要的作用[ 1 , 2] .在高等植物中 ,几丁质酶参与
抵抗病原物的入侵而保护植物.研究表明 ,几丁质酶
既能在离体条件下抑制病原物的生长[ 3] ,也能在生
物活体内抑制病原物的生长[ 4-7] .除了上述抗菌活性
功能 ,一些植物的几丁质酶也在植物发育和生理活
动中起着重要作用 ,如诱导胚胎发生 、体细胞胚成熟
和豆荚的生节瘤块[ 8-12] ,促进豌豆豆荚和葡萄浆果
成熟[ 13-15] 和参与油菜籽叶片衰老等[ 16] ,但几丁质酶
在寄主植物和寄生植物的相互作用中鲜见报道.
在前面的研究中 ,从以田野菟丝子寄生的薇甘
菊顶芽为材料构建的抑制消减文库中 ,获得了一个
与几丁质酶基因有很高同源性的基因片段 S t95
(GenBank登录号 EY202328)[ 17] ,并克隆了其全长
几丁质酶基因 Mmchi1的 cDNA 序列(GenBank登
录号 EU716625)[ 18] .本研究将该基因在大肠杆菌
Roset ta-gami(DE3)细胞中进行了表达和纯化 ,并
分析了融合蛋白 6×His-Mmchi1的活性 ,为进一步
研究薇甘菊几丁质酶在薇甘菊与田野菟丝子之间的
相互作用奠定基础.
1　材料和方法
1.1　材　料
顶芽采自中山大学温棚中扦插栽培的 2 月龄
(高约 1.2 ～ 1.5 m)的薇甘菊.
1.2　方　法
1.2.1　薇甘菊几丁质酶基因克隆及重组质粒构建
　根据薇甘菊 Mmchi1 基因的 cDNA 序列 , 利用
Primer 5设计一对引物扩增 Mmchi1基因的编码区
(不含终止密码子):Mmchi1 F(5′-GAA TTCA TG-
GAGACAAAAAG TATG-3′,下划线为 EcoR Ⅰ酶
切位点)和 Mmchi1 R(5′-AAGCT TACTTGAATC-
CGAGTCT-3′,下划线为 HindⅢ酶切位点).
以未削减的 、寄生 2 d 的顶芽为材料 , 提取
RNA合成 SMART cDNA(Clontech)双链[ 17] ,以此
为模板来扩增 Mmchi1基因的编码区 ,然后将 PCR
产物电泳 、割胶回收(TIANGEN)连接到 pMD-18T
(TaKaRa)载体上 ,转化 E.col i DH5α菌株 ,挑取阳
性克隆经测序鉴定后 , 提取质粒获得 pMD-18T-
Mmchi1.
用 EcoR Ⅰ/Hind Ⅲ(TaKaRa)双酶切 pMD-
18T-Mmchi1后 ,将酶切产物在 1.0%的琼脂糖凝胶
上电泳 ,回收目标片段;同样用 EcoR Ⅰ/Hind Ⅲ双
酶切 pET-32a(+)(Novagen)后 ,于 65℃水浴 10
min后 ,加入碱性磷酸酶 CIP(TaKaRa)37℃放置
0.5 h ,65℃水浴 10 min ,酶切产物在 1.0%的琼脂
糖凝胶上电泳并回收;分别取回收的 Mmchi1 基因
的 ORF 片段和酶切处理回收的 pET-32a(+)于
4℃下连接.然后将连接产物转化 DH5α菌株 ,并涂
于含 100 μg/mL 氨苄青霉素的 LB 固体平板上 ,
37℃过夜培养 ,挑取单菌落于含有 100 μg/mL 氨苄
青霉素的 LB液体培养液中 37℃振荡培养 ,然后进
行菌液 PCR验证 ,选择阳性克隆提质粒并用 EcoR
Ⅰ/HindⅢ双酶切验证 ,进一步测序鉴定后 ,将其命
名为 pET-32a-Mmchi1.
1.2.2　pET-32a-Mmchi1转化大肠杆菌 　分别将
pET-32a-Mmchi1 和 pET-32a(+)转化 E.coli
BL21(DE3)和 E .coli Raso t ta-gam iTM(DE3)感受态
细胞 ,保存于-70℃备用.
1.2.3　诱导条件优化　从新鲜活化的平板上挑选
含转入质粒的 E.coli BL21(DE3)和 E.coli Raso t-
ta-gamiTM(DE3)单菌落分别接种于 3 mL 的 LB 液
体培养基(含 100 μg/mL 氨苄青霉素 , BL21菌株或
含 100 μg/mL 氨苄青霉素 , 34 μg/mL 氯霉素 , 15
μg/mL 卡那霉素 , 12.5 μg/mL 四环素 , Raso tta-
gamiTM菌株)中 , 37℃振荡培养过夜.然后以 1∶50
的比例接种 100 mL 新鲜的 、与上述对应的 LB液体
培养基.37℃振荡培养 2 ～ 3 h至 OD600在 0.4 ～ 0.6
左右加入 IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)(鼎国生物)
诱导表达 ,对照不加 IPTG.
IPTG 浓度选择:加入终浓度分别为 0.05 、0.1 、
0.5 、1.0和 2.0 mmol/L 的 IPTG 后 ,接着于 25℃
继续振荡培养分别于 20 h后取样.
诱导时间选择:加入优化浓度的 IPTG 后 ,接着
25℃继续振荡培养 2 、4 、8 、18 h后分别取样.
将上述样品于 4℃离心收集菌体.向菌体中加
入适量的 TE buf fe r(pH 8.0),混匀 ,于沸水浴中煮
沸 ,冰上冷却后 ,然后 4℃离心 ,取上清液加适量蛋
白电泳上样缓冲液进行 SDS-PAGE ,分析 IPTG 浓
度和不同诱导时间对目的蛋白表达量的影响.
1.2.4　重组融合蛋白的表达及纯化　从新鲜活化
平板上分别挑选含 pET-32a-Mmchi1 和 pET-32a
(+)的 E .coli BL21(DE3)和 Raso t ta-gamiTM
(DE3)单菌落分别接种于对应的 LB 液体培养基
(与上述同),37℃振荡培养过夜.然后以 1∶50的比
例接种新鲜的 LB液体培养基(与上述同).于 37℃
振荡培养 2 ～ 3 h 至 OD 600在 0.4 ～ 0.6左右 ,加入优
化浓度的 IPTG进行诱导表达 ,对照不加 IPTG.接
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着 25℃继续振荡培养 4 h 后取样.将诱导的培养液
于 4℃离心收集菌体.向菌体中加入适量的 TE
buf fe r(pH 8.0)悬浮后 ,置于冰浴中进行超声波破
碎.破碎后的样品于 4℃离心.上清液备用.沉淀溶
于含 1%SDS的 T E buffer(pH 8.0)中.上清与沉
淀部分分别于沸水浴中煮沸变性后 ,在浓缩胶和分
离胶浓度分别为 5%和 12%的 SDS-PAGE 上电泳 ,
以确定融合蛋白 6×His-Mmchi1 表达的形式和部
位.
将含融合蛋白 6×His-Mmchi1的超声上清液
按照 His-Bind Kit(Novagen)的说明进行纯化.
1.2.5　Western blot分析 　在浓缩胶和分离胶浓
度分别为 5%和 12%的 SDS-PAGE 胶上电泳后 ,将
凝胶湿转至 PVDF 膜(普博欣),以小鼠抗 6×His
单克隆抗体(TIANGEN)为一抗 ,以碱性磷酸酶标
记的山羊抗鼠 IgG(TIANGEN)为二抗 ,进行 West-
ern blot ,然后将转印膜放入溶解稀释好的 BCIP/
NBT(TIANGEN)底物溶液的平皿中 ,黑暗中静置
5 min ,观察蛋白条带呈紫蓝色时 ,立即将膜取出 ,用
蒸馏水漂洗终止反应.
1.2.6　几丁质酶活性测定　蛋白浓度的测定按照
Bradford[ 19]的方法 ,以 BSA为标准蛋白绘制标准曲
线.几丁质酶活力测定方法采用 Remazo l Bri lliant
Violet-labeled比色法[ 20] ,以羧基几丁质(CM-chi-
tin-RBV ,2 mg/mL)(Sigma , USA)作为底物进行几
丁质酶活力测定.
为确定纯化的 6 ×His-Mmchi1 最适酶活 pH
值范围 ,分别配制不同pH值(3.0 ～ 10.0)溶液 ,参
照 Fan等[ 21] 设置的方法:pH 3.0 ～ 5.5 ,0.1 mol/L
柠檬酸钠溶液;pH 6.0 ～ 8.0 , 0.1 mol/L 磷酸钠溶
液;pH 8.5 ,0.05 mo l/L T ris-HCl buf fer;pH 9.0 ～
10.0 , 0.05 mol/L 甘氨酸-氢氧化钠溶液.在 1.5
mL 的离心管里加入 100 μL CM-chi tin-RBV , 100
μL 的纯化的蛋白样品 , 200 μL 不同 pH 值的缓冲
液 ,37℃水浴 2.0 h后加入 100 μL 2 mol/L HCl以
沉淀未分解的 CM-chitin-RBV ,放在冰上 10 min 以
终止反应 , 4℃、12 000 g 离心 5 min后取 400 μL 上
清测定 A 550的值.对照为不加酶的反应液.酶活性单
位定义为A 550 h-1 mg -1 pro tein, 同 Romero
等[ 22]定义的方法.
为确定纯化的 6×His-Mmchi1 最适酶活的温
度范围 ,根据测得的最适酶活 pH 值范围 ,选用 0.1
mol/L 磷酸钠溶液(pH 6.4),在 1.5 mL 的离心管
里加入100μL CM-chitin-RBV , 100μL 的纯化的蛋
白样品 ,200μL 0.1 mol/L 磷酸钠溶液(pH 6.4),
在不同的温度 4 、15 、25 、35 、45 、55 、65℃分别水浴
2.0 h后加入100μL 2 mol/L HCl以沉淀未分解的
CM-chi tin-RBV , 放在冰上 10 m in 以终止反应 ,
4℃、12 000 g 离心 5 min后取 400 μL 上清液测定
A 550的值.
2　结果与分析
2.1　原核表达载体的构建
用一对特异引物 Mmchi1 F 和 Mmchi1 R扩增
Mmchi1基因 ,经 1%琼脂糖凝胶电泳检测 ,在 1 000
bp处可见扩增产物(图1 , A).用EcoRⅠ/Hind Ⅲ
图 1　电泳结果
M.DG L2000.A.1和 2为 Mmchi1基因编码区的PCR产物;B.1和 2为菌液 PCR产物;
C.1和 2为 EcoRⅠ和 HindⅢ双酶切 pET-32a-Mm chi1的产物
Fig.1　The results of electropho resis
M.DGL2000.A.1 and 2 PCR p rodu cts of the coding region of Mmchi1 gene;B.1 and 2 PCR produ cts f rom
bacteria liquid;C.1 and 2 pET-32a-M mchi1 digested by EcoRⅠ an d H indⅢ
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8975 期　　　　　　　　　　　　　李冬梅 , 等:薇甘菊几丁质酶基因的原核表达及活性分析
双酶切并电泳回收产物 ,将回收产物连接到用同样
双酶切的 pET-32a (+)载体上 ,转化 E.col i DH5α,
挑取单菌落过夜培养 ,菌液 PCR筛选阳性克隆(图
1 , B)、EcoRⅠ和 Hind Ⅲ双酶切(图 1 , C)和测序验
证结果正确后 ,提取重组质粒 pET-32a-Mmchi1 ,分
别转化 E.coli BL21(DE3)和 E.coli Rasot ta-gamiTM
(DE3)细胞.
2.2　融合蛋白在大肠杆菌中的表达及优化
SDS-PAGE分析表明 , 随 IPTG 终浓度的增
加 ,融合蛋白 6×His-Mmchi1 的表达量变化不明
显 ,故 IPTG 选用终浓度为 0.1 mmol/L.从不同诱
导时间对融合蛋白 6×His-Mmchi1在 E.coli BL21
(DE3)和 Raso tta-gami TM(DE3)细胞中表达量的影
响(图 2 ,A;图 3 ,A)可看出 ,这 2种细胞中都能表达
一条约 55 kD大小的目的蛋白.在 IPTG 诱导 4 h
时 ,目的蛋白的表达量都达到相当高的水平 ,故诱导
时间选 4 h.
2.3　融合蛋白的表达形式
SDS-PAGE分析表明 ,Mmchi1在 E.coli BL21
(DE3)细胞中表达的蛋白都在超声沉淀中(图 2 , B ,
泳道 4),即以不溶的包涵体形式存在 ,而以可溶的
形式在超声上清中几乎检测不到(图 2 ,B ,泳道 3).
改变诱导条件如 IPTG 浓度 、降低诱导温度(16℃)
和调节渗透压(如添加山梨醇)等方法 ,均发现目的
蛋白存在 E.coli BL21(DE3)细胞的超声沉淀中.换
用不同表达载体 ,如 pMAL-c2x 和 pGEX-4T-1 ,目
的基因表达的蛋白也仍然只在超声沉淀中.为此 ,回
收超声沉淀并用适量的变性液悬浮 ,再于冰浴中超
声波处理 ,然后离心取上清液按 His-Bind Kit的说
明对其纯化 ,然后再复性 ,但目的蛋白的复性效果很
差.
SDS-PAGE 分析也表明 , Mmchi1 在 E.coli
Rasot ta-gamiTM(DE3)细胞中表达的目的蛋白存在
超声上清(图 3 ,A ,泳道 8)和超声沉淀中(图 3 ,A ,
泳道 9),即分别以可溶的形式存在细胞质和不溶的
形式存在包涵体中.将该细胞的超声上清液按照
His-Bind Kit的说明进行纯化.
2.4　Western blot分析
将纯化的目的蛋白 、诱导前后的总蛋白 、超声上
清和超声沉淀蛋白样品同时进行 SDS-PAGE电泳.
电泳后转印进行 Western blo t.结果表明 ,纯化的蛋
白样品在 55 kD处出现一条特异性的杂交带(图 3 ,
B ,泳道 7), pET-32a(+)表达的 6×His 标签蛋白
在约 20 kD处出现一条特异性的杂交带(图 3 ,B ,泳
道 2),未诱导的含 pET-32a(+)和 pET-32a-Mm-
chi1的 E.col i Raso tta-gami TM(DE3)菌株的蛋白样
品均没有杂交带(图 3 , B ,泳道 1和 3),含 pET-32a-
Mmchi1 的 E.coli Rasot ta-gamiTM (DE3)菌株在
IPTG 诱导后的总蛋白 、超声上清和超声沉淀的蛋
白样品在 55 kD处均出现一条特异性的杂交带 ,此
外还有非特异性的杂交带(图 3 , B ,泳道 4 ～ 6).
2.5　几丁质酶活性的测定
从不同 pH 对纯化的几丁质酶活性的影响(图
4)可看出 ,在 37℃反应条件下 ,纯化的几丁质酶在
pH 5.5 ～ 6.5 内达到最大活性(2.355 A 550 h-1
mg-1 protein).在 pH 低于 3.5和高于 7.5时 ,纯化
的几丁质酶几乎失去 55%的活性(图 4).
不同温度对纯化的几丁质酶活性的影响显示
(图 4),最适酶反应温度在 35 ～ 40℃,在 35℃ 0.1
mol/L 磷酸钠缓冲液(pH 6.4)中 ,达到最大酶活
2.218 A 550 h-1 mg -1 pro tein.在温度高于 55℃时 ,
纯化的几丁质酶几乎失去 90%的活性(图 4).综上
所述 ,纯化的几丁质酶活性最佳 pH 和温度分别为
pH 5.5 ～ 6.5和 35 ～ 40℃.
图 4　不同 pH 和温度对 Mmchi1 纯化蛋白的酶活性影响
Fig.4　Effects of different pH and temperature
on the enzymatic activities of Mmchi1
3　讨　论
据报道 ,细菌 、真菌 、昆虫和植物中来源的几丁
质酶基因已成功地在大肠杆菌中表达[ 21 , 23-2 7] .这些
结果表明 ,大肠杆菌是几丁质酶基因的比较适合的
异源表达宿主.本实验将重组表达质粒 pET-32a-
Mmchi1转入 E.col i BL21(DE3),用 IPTG 诱导表
达 ,经 SDS-PAG E检测表明 ,目的基因表达的融合
蛋白以不溶的包涵体形式存在 ,大小约为 55 kD.随
后 ,采用透析法对回收的包涵体蛋白进行复性 ,但复
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性效果差.通过尝试换用不同的表达载体 、降低诱导
温度 、调节渗透压和改变宿主菌等方法 ,最后成功地
将 Mmchi1基因在 E.col i Raso t ta-gam iTM(DE3)中
表达了可溶性的融合蛋白.这可能是由于 E.coli
Roset ta-gamiTM菌株可增加含稀有密码子(AUA ,
CUA , CCC ,GGA)的基因的表达 ,并且促进表达的
蛋白在胞质中形成二硫键 ,从而使表达的蛋白可溶
性更好.从该菌株的超声上清液中纯化的融合蛋白
最佳活性 pH 和温度分别为 pH 5.5 ～ 6.5和 35 ～
40℃;在 pH 5.5 ～ 6.5内达到最大活性 2.355 A 550
h-1 mg-1 pro tein;在 35℃0.1 mol/L 磷酸钠缓冲
液(pH 6.4)中达到最大酶活 2.218 A 550 h-1 mg-1
pro tein.
在之前的研究中发现 ,在田野菟丝子寄生早期 ,
Mmchi1基因在顶芽中的表达量上升 ,但随着田野
菟丝子寄生时间的延长 ,尤其在晚期 ,Mmchi1基因
在顶芽中的表达量极显著地下降[ 18] .然而田野菟丝
子寄生调控 Mmchi1 基因表达的分子机理尚未
知[ 18] .所以 ,本研究为进一步通过功能互补试验证
实Mmchi1基因的功能 ,尤其是在田野菟丝子寄生
过程中该酶的特殊作用机理奠定了基础.
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