全 文 ：亮氨酰氨肽酶基因的阻断对刺糖多孢菌生长及次级代谢产物
合成的影响
杨燕，罗林根，徐妙，夏立秋*
湖南师范大学生命科学学院, 微生物分子生物学国家重点实验室培育基地，湖南 长沙 410081
摘要：【目的】构建亮氨酰氨肽酶基因(pepA)被阻断的刺糖多孢菌工程菌株，并鉴定该基因对刺糖多孢
菌菌丝形态、生物量、菌体全蛋白表达水平及产多杀菌素能力的影响，探究该基因调控多杀菌素合成的
可能机制。【方法】利用PCR扩增刺糖多孢菌中的pepA基因同源片段，经酶切连接技术构建敲除载体
pOJ260-pepA；通过接合转移和单交换同源重组将该载体整合至刺糖多孢菌染色体中，获得工程菌株S.
sp-△pepA；利用培养特征、形态学、高效液相色谱、SDS-PAGE等方法对菌株进行研究分析。【结果】
工程菌株S. sp-△pepA菌丝片段化程度加剧，生长态势被延缓且生物量降低，但有效促进了多杀菌素的
生物合成。阻断亮氨酰胺肽酶基因的表达使刺糖多孢菌菌体全蛋白表达情况发生明显改变，找到表达水
平显著上调的差异蛋白核糖体蛋白亚基和醛基脱氢酶，核糖体蛋白亚基通过影响蛋白质代谢对菌体生长
产生影响；醛基脱氢酶则可与乙醇脱氢酶、乙酰辅酶A的合成酶相互作用影响辅酶A合成，而辅酶A是合
成多杀菌素的重要底物。【结论】在刺糖多孢菌合成多杀菌素的次级代谢过程中，pepA基因作为负调控
因子发挥作用。
关键词：刺糖多孢菌, 亮氨酰氨肽酶基因, 阻断, 多杀菌素, 接合转移
亮氨酰氨肽酶(PepA; EC 3.4.11.1)是氨肽酶
M17超家族中的一员，该家族成员均具有从蛋白
质、多肽的N端将亮氨酸残基切割下来的作用[1]。
该家族氨肽酶在生物界普遍存在，其功能结构的
研究仅在牛、大肠杆菌、土豆中开展过[2–4]。已有
研究证明大肠杆菌的PepA具有DNA结合活性，能
与多种启动子序列结合[5]，对pepA蛋白六聚体X射
线三维结构分析发现其具有一个凹槽结构，该结
构被认为是DNA结合位点[3]。Song等在天蓝色链
霉菌中将亮氨酰氨肽酶基因(pepA)敲除发现缺失
突变株产孢子能力和抗生素合成能力明显提高，
双向电泳和RT-PCR检测发现ftsZ, ssgA和actII-
微生物学报
Acta Microbiologica Sinica
2016, 56(4): 629-642
http://journals.im.ac.cn/actamicrocn
DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20150279
Research Paper 研究报告


基金项目：国家“863”计划(2011AA10A203)；国家“973”计划(2012CB722301)；国家自然科学基金(31070006)；湖南省2011协同
创新中心项目(20134486)；湖南省教育厅项目(10CY013)
*通信作者。Tel：+86-731-88872905；E-mail：xialq@hunnu.edu.cn
收稿日期：2015-06-24；修回日期：2015-09-07；网络出版日期：2015-09-29
ORF4的蛋白表达和转录水平也有较大幅度提高，
这表明天蓝色链霉菌中的pepA在抗生素合成过程
中作为负调控因子发挥作用[6]。
由刺糖多孢菌合成的次级代谢产物多杀菌素
具有新颖独特的作用机理，能有效控制鳞翅目
Lepidoptera、双翅目Diptera和缨翅目Thysanoptera
等害虫，同时对鞘翅目C o l e o p t e r a、直翅目
Orthoptera、膜翅目Hymenoptera等某些特定种类
的害虫也有一定的毒杀作用[7]。多杀菌素主要靶
标是烟碱型乙酰胆碱受体(nAChRs)和γ-氨基丁酸
受体(GABARs)，但其烟碱受体作用机理不同于现
有烟碱类杀虫剂诸如吡虫啉等，与γ-氨基丁酸受
体的作用机理亦不同于现有的阿维菌素类、氟虫
腈类杀虫剂。它主要通过激活相关害虫中央神经
系统的神经细胞而引起非功能性的肌肉收缩和震
颤，使中央神经系统广泛超活化以致死亡[8]。多
杀菌素独特的杀虫机理表现出生物农药的安全性
和化学农药的快速性。野生型刺糖多孢菌的多杀
菌素生物合成含量较低、发酵周期很长、生产成
本较高是限制多杀菌素在作物生产应用上的主要
原因。本研究首次从刺糖多孢菌基因组中扩增了
pepA基因中间同源序列，亚克隆到载体pOJ260[9]
中，再通过单交换同源重组将其整合到刺糖多孢
菌的染色体上，以期通过阻断负调控基因的表
达，影响刺糖多孢菌中次级代谢产物的产生，从
而促进多杀菌素的生物合成。
1 材料和方法
1.1 菌株和质粒
本研究所用菌株、质粒与引物见表1。
1.2 培养基成分与菌体培养条件
大肠杆菌培养采用LB液体或固体培养基(含
Tryptone 1%，Yeast extract 0.5%，NaCl 1%，固体
培养基则加入1.5%琼脂粉)，培养温度为37 °C；
刺糖多孢菌种子活化培养基采用CSM培养基(含
TSB 3%，Yeast extract 0.3%，MgSO4·7H2O
0.2%，Glucose 0.5%，Maltose 0.4%)，转接采用胰
蛋白酶大豆肉汤培养基(含TSB 3%)[10]，刺糖多孢
菌形态观察采用BHI (BHI 3.7%，琼脂粉1.3%)、
R6 (含蔗糖 20%，Dextrin 1%，Casamino acids
0.1%，K2SO4 0 .01%，FeSO4 ·7H2O 0.01%，
MnCl2·4H2O 0.01‰，MgSO4·7H2O 0.05‰，
ZnSO4·7H2O 0.01‰，BHI 2.6%，MOPS 0.01
mol/L，CaCl2 0.048 mol/L，L-谷氨酸 0.065
mol/L，琼脂粉2%)和ISP-2 (含Glucose 0.04%，
Maltose 1%，Yeast extract 0.4%，琼脂粉2%)固体
培养基，培养温度为30 °C。
1.3 工具酶、试剂、抗生素及使用浓度
LA Taq DNA 聚合酶、Primer Star DNA聚合
酶、限制性内切酶、T4 DNA连接酶等购自大连宝
生物工程有限公司。细菌基因组DNA提取试剂
盒、DNA片段和PCR产物回收试剂盒、质粒小量
提取试剂盒购自北京Bioteke公司。PCR引物合成
及测序由生工公司完成。抗生素均购自Sigma公
司，工作浓度分别为：阿伯拉霉素(Apramycin)，
用于大肠杆菌的筛选浓度为20 mg/L，用于刺糖多
孢菌的筛选浓度为50 mg/L；氨苄青霉(ampicillin,
Amp)用于固体培养基的浓度为50 mg/L，用于液
体培养基的浓度为100 mg/L；萘啶酮酸(nalidixic
acid，NA) 25 mg/L；链霉素(streptomycin，Str)
100 mg/L；三甲氧苄氨嘧啶(trimethoprim，TMP)
100 mg/L。
1.4 pepA同源基因的确定
以天蓝色链霉菌中pepA基因核苷酸序列为标
准，利用BLAST在线搜索刺糖多孢菌中该基因同
源片段，而后利用Clustal X比对2个基因编码蛋白
pepA的相似性[11]。
1.5 敲除载体pOJ260-pepA的构建
1.5.1  pepA基因片段的扩增及回收测序：利用细
菌基因组DNA提取试剂盒按使用说明书操作提取
刺糖多孢菌基因组，以该基因组为模板，通过
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Primer Star DNA聚合酶扩增约1400 bp的pepA基因
片段。反应体系20 μL：DNA模板(313 ng/μL)
1 μL，Primer Star DNA酶(2.5 U/μL) 0.1 μL，2×GC
buffer 10 μL，dNTPs (10 mmol/L each) 2 μL，上、
下游引物(10 μmol/L，表1)各0.5 μL，最后加灭菌
ddH2O补足；PCR反应程序如下：94 °C 5 min；
94 °C 30 s，61 °C 30 s，72 °C 105 s，30个循环；
72 °C 10 min，20 °C终止PCR反应。该PCR产物经
DNA片段和PCR产物回收试剂盒按使用说明书操
作回收纯化pepA基因片段后，与pMD-18T载体连
接；热转化大肠杆菌[12]，用LB固体培养基过夜培
养后，挑取单克隆在LB液体培养中扩大培养后利
用质粒小量提取试剂盒提质粒；所得质粒经Hind
Ⅲ和EcoR Ⅴ酶切鉴定后送上海生工测序，测序结
果经NCBI BLAST Network进行比对分析。
1.5.2 pOJ260-pepA的构建：测序正确后的pMD-
pepA质粒经Hind Ⅲ和EcoR Ⅴ酶切后回收pepA基
因片段，而后用T4 DNA连接酶将该回收片段与经
过同样双酶切的pOJ260载体片段过夜连接[12]，得
到敲除载体pOJ260-pepA(图1)。
1.6 工程菌株S. sp-△pepA的构建及pOJ260-
pepA插入位点的鉴定
将重组质粒pOJ260-pepA电转[12]入供体菌E.
coli S17-1，经阿伯拉霉素、链霉素、三甲氧苄氨
表 1. 菌株、质粒和引物
Table 1. Strains, plasmids and primers used in this study
Strains/Plasmids/Primers Relative description Source
Strains
E. coli GB2005 Host for general cloning This lab
E. coli S17-1 Donor strain for conjugation This lab
S. spinosa Spinosad producing strain This lab
S. sp–△pepA S. spinosa harboring pOJ260-pepA This study
Plasmids
pMD-18T E. coli cloning vector，containing AmpR and LacZ TaKaRa
pMD-pepA pMD-18T harboring partial pepA This study
pOJ260 E. coli-Streptomyces shuttle expression vector This lab
pOJ260-pepA pOJ260 harboring partial pepA This study
Primers Sequence (5→3)
pepA -F CCAAGCTTGGCGCCGCGTACGACGGAGACC This study
pepA -R CCGATATCGG GCCGCCCTTCGGGGTGTAGC This study
AM-F ATCTACGTCTGTCGAGAAGT This study
AM-R ATGCCGCTGCCGGAGGAGCT This study
AN-F GCCGACCACGAAGTCCACCT This study
AN-R TCTTTATAGTCCTGTCGGGT This study
aac(3)IV-F GTCCAATACGAATGGCGAAAAGC This study
aac(3)IV-R ATAACATTCTTCGCATCCCGCC This study
Restriction enzyme sites were underlined.
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嘧啶三抗筛选阳性转化子，提取质粒并用Hind
Ⅲ和ClaⅠ进行酶切鉴定，获得转化子S17-1/
pOJ260-pepA。通过接合转移[13–14]将重组质粒导入
野生型刺糖多孢菌中，筛选具有阿伯拉霉素抗性
的菌落，并用引物对aac(3)IV-F/aac(3)IV-R(表1)进
行菌落PCR扩增阿伯拉霉素抗性基因片段以鉴定
正确转化子，利用LA Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)
20 μL体系(同上)扩增阿伯拉霉素抗性基因程序如
下：94 °C 5 min；94 °C 30 s，61 °C 30 s，72 °C
1 min，30个循环；72 °C 10 min，20 °C终止
PCR反应。将基因组上整合了pOJ260-pepA的工程
菌株命名为S. sp-△pepA。随后提取工程菌株基因
组，用引物AM-F/AM-R及AN-F/AN-R(表1)扩增
插入片段和刺糖多孢菌基因组上下游片段鉴定插
入位点。PCR反应程序如下：94 °C 5 min；94 °C
30 s，63 °C 30 s，72 °C 45 s，30个循环；72 °C
10 min，20 °C终止PCR反应。
1.7 pepA基因阻断表达对刺糖多孢菌生长及菌株
形态的影响
菌体活化：将200 μL菌种保藏液接种于装量
为20 mL CSM液体培养基的250 mL摇瓶中，30 °C、
160 r/min培养2 d。刺糖多孢菌液体培养基中生长
曲线的测定采用光密度法：按1%接种量接种活化
好的菌种于装量为20 mL TSB液体培养基的250 mL
摇瓶中，30 °C、160 r/min培养5 d，分别定期取样
测定光密度值OD600，试验重复3次，取平均值制
作生长曲线。将活化后的40 μL原始菌和工程菌菌
液分别涂布于BHI、R6和ISP-2固体培养基上[15]，
30 °C倒置培养72 h，观察不同平板上菌落生长情
况。接种等量的活化后的原始菌与工程菌菌液至
图 1. 敲除载体pOJ260-pepA的构建流程图
Figure 1. Construction of pOJ260-pepA.
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20 mL TSB培养基，165 r/min振荡培养2 d，利用
光学显微镜(Olympus BH-2型显微镜，日本Olympus
公司)观察其菌体形态[14]。
1.8 工程菌株S. sp-△pepA多杀菌素产量变化检
测分析
分别取相同发酵条件下工程菌株 S . s p -
△pepA和原始菌株S. spinosa的发酵液500 μL，与
等体积的丙酮混匀，室温振荡1–2 h，避光，9000
r/min离心10 min，吸取上清，经0.22 μm滤膜过
滤，滤液经安捷伦1290液相色谱仪检测分析多杀
菌素含量，色谱柱为SB-C18，4.6 mm×150 mm，
5-Micron，流动相：甲醇:乙腈:2%醋酸铵(V/V/V)=
45:45:10，流速0.5 mL/min，紫外检测波长250 nm，
进样体积5 μL，通过HPLC外标法计算发酵液中多
杀菌素的含量。
1.9 pepA基因阻断表达对刺糖多孢菌菌体全蛋白
的影响
刺糖多孢菌菌体全蛋白的提取采用超生破碎
细胞法：按1%接种量接种活化好的菌种于装量为
20 mL TSB液体培养基(含 TSB 3%)的250 mL摇瓶
中，30 °C、160 r/min培养3 d，分别取不同时期菌
体进行超生破碎(JY92-Ⅱ型超声波细胞粉碎机，
宁波新芝生物科技公司)，提取菌体全蛋白。得到
的菌体全蛋白利用Bradford法定量后进行SDS-
PAGE检测其蛋白表达差异[16–17]。
1.10 差异蛋白胶内酶解及1D-LC-MS/MS鉴定
挖取SDS-PAGE胶上的差异蛋白条带进行酶
解[17]，酶解后蛋白溶液利用Thermo Scientific LTQ
XL型号的二维液相色谱电喷雾串联质谱仪上进行
分离和鉴定，整个过程受Xaclbiur数据系统的控
制[17]。
1.11 工程菌株S. sp-△pepA遗传稳定性检测
将S. sp-△pepA菌株的菌种保藏液用不加抗生
素的CSM液体培养基活化48 h，梯度稀释后涂布
于无抗生素的BHI平板，30 °C培养5 d；挑取50个
单菌落转接于含阿伯拉霉素(50 mg/L)的BHI平板
上，30 °C培养3–4 d，计数抗性克隆数；并从中随
机挑取20个单菌落，于无抗的CSM活化48 h后做
菌液PCR扩增检测aac(3)IV片段。
2 结果和分析
2.1 pepA同源基因的确定
以天蓝色链霉菌中pepA基因(sco2179)核苷酸
序列为标准，利用BLAST在线搜索刺糖多孢菌中
该基因同源片段，而后利用Clustal X比对2个基因
编码蛋白pepA的相似性(图2)，通过比对可知，两
者核苷酸相似性达74%，蛋白同源性达50%。
2.2 敲除载体pOJ260-pepA的构建及鉴定
以刺糖多孢菌基因组为模板，利用引物pepA-
F和pepA-R，PCR扩增pepA基因中间片段。PCR产
物经Hind III/EcoR Ⅴ双酶切及回收后，与同样经
过双酶切及回收的pOJ260载体片段连接，转化大
肠杆菌，抽提转化子质粒，酶切鉴定，得到敲除
载体pOJ260-pepA(图3)。该载体带有大肠杆菌
pUC复制子，接合转移起始位点(oriT)，阿伯拉霉
素抗性基因(aac(3)IV，可以作为E. coli和S. spinosa
的筛选标记)。
2.3 接合转移构建工程菌株S. sp-△pepA及功能
质粒插入位点鉴定
将R6平板上长出的接合子转接至含阿伯拉霉
素(50 mg/L)的BHI平板上，转接2次，再挑取单菌
落至TSB液体培养基，提取基因组为模板进行
PCR鉴定。以工程菌S. sp-△pepA基因组为模板，
分别以aac(3)IV-F/aac(3)IV-R 引物对PCR 扩增773
bp阿伯拉霉素抗性基因片段，结果表明(图4-B)
pepA基因中间片段已成功的整合至刺糖多孢菌染
色体上。另外，以工程菌株S. sp-△pepA基因组为
模板，用AM-F/AM-R和AN-F/AN-R分别扩增上游
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片段AM(700 bp)、下游片段AN(920 bp)，结果表
明(图4-C)阻断质粒插入到刺糖多孢菌染色体上的
位置与预想一致。
2.4 pepA基因的阻断表达对刺糖多孢菌生长与
多杀菌素生物合成的影响
观察了工程菌株S. sp-△pepA及原始菌株S.
spinosa在不同培养基中的生长发育变化与形态差
异。在BHI培养基、ISP-2培养基和R6培养基上培
养72 h后，原始菌株已产生较多白色孢子，而工
程菌株只产生很少量的孢子，其孢子萌发及形成
速率较原始菌株均明显延迟(图5-A)；尤其是将等
量的工程菌与原始菌活化菌液涂布于无抗BHI板
培养，培养84 h时，原始菌可观察到大片白色孢
子，而工程菌仅有稀薄的一层孢子(图5-B)。TSB
图 2. pepA基因编码蛋白同源性比对
Figure 2. Homology analysis of amino acid residue sequence coded by pepA.
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图 3. pOJ260-pepA的构建
Figure 3. Constraction of pOJ260-pepA. A: PCR amplification of the partial pepA gene. M: DNA marker; 1: the
partial length of pepA gene. B: Endonuclease digestion assay of pOJ260-pepA. M: DNA marker; 1: digestion of Hind
Ⅲ; 2: digestion of Hind Ⅲ and Cla Ⅰ.
图 4. S. sp-△pepA的PCR鉴定
Figure 4. Identification of S. sp-△pepA. A: Diagram of the single-crosscover homologous recombination. B: PCR
amplification of partial aac(3)IV gene. M: DNA marker; lane 1: negative control, using the chromosome of S. spinosa
as template; lane 2: positive control, using pOJ260-pepA as template; lane 3, 4: experimental group, using the
chromosome of S. sp-△pepA as template. C: PCR confirmation of integration site. M: DNA marker; lane 1:
downstream segment AN; lane 2: upstream segment AM.
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液体培养基中培养48 h后，采用光学显微镜观察
2菌株的菌体形态，结果显示原始菌株菌丝细长且
分枝多，而工程菌株菌丝较粗短、分枝少且片段化
程度高，此外，原始菌结团较工程菌严重(图6)。
在TSB液体培养基中原始菌株S. spinosa培养
24 h后进入对数生长期，48–60 h间又有1个继续增
长期，生长过程中无明显稳定期存在。工程菌S.
sp-△pepA也是生长24 h进入对数生长期，但工程
菌第二生长期菌体生物量无明显增加，而在
64–72h菌体生长增强，生物量显著提高；然而工
程菌细胞密度一直低于原始菌株，尤其是两者最
高生物量相差较大(图7)。
HPLC检测结果显示，与原始菌株相比，发酵
培养基中工程菌株多杀菌素A+D的产量达137.4
mg/L，相较原始菌的112.5 mg/L提高到122.1%
(图8)，说明pepA基因的阻断在一定程度上促进了
刺糖多孢菌中多杀菌素的生物合成。
2.5 工程菌株菌体全蛋白分析
通过SDS-PAGE分析工程菌株与原始菌株菌
体全蛋白，发现工程菌株全蛋白条带减少在
97.2–200.0 kDa区域，推测该区域应该包含pepA基
因编码蛋白；另外，工程菌株中某些蛋白表达较
原始菌株弱且明显少了蛋白条带A,蛋白条带B、
C表达明显增强(图9)。
图 5. 工程菌株S. sp-△pepA与原始菌株S. spinosa的菌落形态比较
Figure 5. Phenotypes of S. sp-△pepA and S. spinosa. A: Phenotypes of S. sp-△pepA and S. spinosa (72 h) in
different media; B: Phenotypes of S. sp-△pepA and S. spinosa (84 h) in BHI media.
图 6. 光学显微镜观察工程菌株(A)与原始菌株(B)培养
48 h的菌丝形态
Figure 6. Mycelium observation of S. sp-△pepA (A)
and S. spinosa (B).
图 7. 工程菌株S. sp-△pepA与原始菌株S. spinosa的生
长曲线比较
Figure 7. Growth curve of S. sp-△pepA and S. spinosa.
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2.6 差异蛋白分析
将SDS-PAGE检测到的差异蛋白条带A、B、
C胶内酶解后通过1D-LC-MS/MS鉴定，发现它们
分别为30S核糖体蛋白亚基S11(RpsK)、醛基脱氢
酶(AldH)和30S核糖体蛋白亚基S4(RpsD)(图10，
表2)。利用在线蛋白分析软件Uniprot (www.
uniprot.org)和STRING(string.embl.de)对其功能进
行分析得到AldH具有NAD(醛脱氢酶)活性，可催
化醛基转化为羧基，还可与乙醛脱氢酶、乙酰辅
酶A合成酶相互作用，从而影响辅酶A的合成；辅
酶A是合成多杀菌素前体糖苷配基的重要底物。
工程菌株S. sp-△pepA多杀菌素产量较原始菌株有
一定提高(图8)可能与该酶过表达有关。RpsK、
RpsD两者均为30S核糖体蛋白亚基，它们作用于
核糖体蛋白组装，从而影响蛋白翻译，对菌体初
级代谢产生一定影响。工程菌株S.sp-△pepA中
RpsK表达被抑制，因而其生物量较原始菌株显著
下降，尤其是当两者生长状态达到最佳时蛋白表
达被抑制的影响也最显著(图7，图9)。
图 8. HPLC检测原始菌株S. spinosa (A)与工程菌株S. sp-△pepA (B)的多杀菌素产量
Figure 8. HPLC analysis of spinosyn production by S. spinosa (A) and S. sp-△pepA (B).
图 9. 工程菌株与原始菌株全蛋白SDS-PAGE检测
Figure 9. SDS-PAGE gel analysis of total proteins. M:
protein marker; lane 1, 3: samples from 60 h and 72 h S.
spinosa cells, respectively; lane 2, 4: samples from 60
and 72 h S. sp-△pepA cells, respectively.
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图 10. 差异蛋白的部分特异性肽段
Figure 10. Special peptides of identified proteins. A: RpsK; B: AldH; C: RpsD.
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3 讨论
刺糖多孢菌多杀菌素含量极低促使人们对其
进行菌种改良和发酵工艺优化以提高其产量。已
有对刺糖多孢菌利用传统的理化诱变结合高通量
筛选[18]，原生质体融合及再生[19]，多杀菌素生物
合成相关基因加倍等方法对其进行菌种改良的研
究报道。近年来，利用基因工程技术加倍与过量
表达放线菌中与次级代谢相关的正调控功能基
因，成为了提高相关抗生素产量的有效途径，但
对于阻断刺糖多孢菌负调控因子的表达以提高多
杀菌素产量的相关报道少见。
许多调控子全局掌控次级代谢，其调控机制
也慢慢被解析。与转录和翻译过程相关的基础元
件也能直接或间接影响次级代谢，但研究其具体
机制尚存在瓶颈，因而可以通过观察菌体抗生素
合成及孢子分化的变化来监测基础元件调控次级
代谢的流程。已有研究表明大肠杆菌的pepA具有
DNA结合活性，能与多种启动子序列结合[5]，但
天蓝色链霉菌的同种蛋白没有亮氨酰氨肽酶活性
却能影响其抗生素ACT、RED的合成[20]。本研究
利用生物信息学软件BLAST和Cluster X比对刺糖
多孢菌全基因组和天蓝色链霉菌的亮氨酰氨肽酶
基因(SCO2179)，发现刺糖多孢菌也有该蛋白且
序列高度同源(图2)；以此为基础将刺糖多孢菌中
pepA基因中间片段整合至刺糖多孢菌染色体上通
过单交换同源重组阻断其表达得到工程菌株S. sp-
△pepA，其生物量和产孢子能力明显低于原始菌
株S. spinosa(图5，图6)，且菌丝较粗短，结团现
象得到缓解(图7)；而且其多杀菌素的产量较原始
菌株有较大提高(图8)。pepA具有DNA结合活性，
能与多种启动子序列结合[5]，从而影响启动子下
的调控基因表达水平。pepA与氨甲酰磷酸合酶操
纵子(carAB)结合形成的复合体PepA-carAB能降低
胺甲酰磷酸合酶的磷酸化水平以减弱其转录翻译
水平[21]。阻断pepA还能显著提高细胞分裂激活因
子(SsgA)的转录水平[6]，SsgA只存在于形态复杂
的放线菌中 [ 2 2 ]，能直接激活产孢专一的细胞分
裂，并且过量表达能引起天蓝色链霉菌菌丝形态
发生较大改变，使营养菌丝的宽度显著增加，并
且形成大量被异常增厚膈膜分开的类孢子室[23]，
从而影响菌丝发育。放线菌发酵产生次生代谢的
产量与发酵成本受到其丝状菌丝形态的严重影
响，液体培养中链霉菌的菌丝形态主要由细胞分
裂激活因子ssgA的表达水平决定，SsgA表达量越
高，营养菌丝胞间膈膜的形成频率越高，菌丝的
片段化程度也越高[24]。
比对生长曲线发现工程菌株在整个生长周期
中的细胞密度均低于原始菌株，这可能是因为
pepA被阻断后某些受该调控子正调控的基因表达
受到阻遏，比对菌体全蛋白SDS-PAGE(图9)也能
发现工程菌株蛋白条带明显减少。在BHI和ISP-
2培养基上，与原始菌株相比，其工程菌株孢子萌
发及孢子形成延迟，但最终仍然能够正常产生孢
表 2. 差异蛋白LC-MS/MS分析
Table 2. Proteins identified from SDS-PAGE gel analysis
Band
numbers
ID Protein description Theoretical
MW/kDa
Possible function
A A4FPJ4 30S ribosomal protein S11 (RpsK) 14.3 Binding RNA Binding rRNA
B A4FGH6 Aldehyde dehydrogenase (AldH) 55.8 Aldehyde dehydrogenase (NAD) activity
an aldehyde + NAD+ + H2O = an acid + NADH + H
+
C A4FPJ3 30S ribosomal protein S4 (RpsD) 23.2 Binding RNA Binding rRNA
杨燕等 | 微生物学报, 2016, 56(4) 639
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子，这可能也与功能菌株功能不足有关；在营养
丰富的R6培养基上，两者生长速率及菌落形态无
明显差异，推测与培养基组分不同有关。另外，
经光学显微镜观察工程菌株菌丝较细短，分支
多，有利于菌株发酵时的溶氧，对多杀菌素的生
物合成起促进作用。
LC-MS/MS鉴定到的差异蛋白分别为30S核糖
体蛋白亚基S11(RpsK)、醛基脱氢酶(AldH)和30S
核糖体蛋白亚基S4(RpsD)。对其功能分析可知具
有醛脱氢酶活性可催化醛基转化为羧基，而
RpsK、RpsD两者均为30S核糖体蛋白亚基。AldH
与乙醛脱氢酶、乙酰辅酶A合成酶相互作用，从
而影响辅酶A的合成；辅酶A是合成多杀菌素前体
糖苷配基的重要底物。工程菌株S.sp-△pepA多杀
菌素产量较原始菌株有一定提高(图8)可能与该酶
过表达有关。RpsK、RpsD它们作用于核糖体蛋白
组装，从而影响蛋白翻译，对菌体初级代谢产生
一定影响。工程菌株S. sp-△pepA中RpsK表达被
抑制，因而其生物量较原始菌株显著下降，尤其
是当两者生长状态达到最佳时蛋白表达被抑制的
影响也最显著(图7，图9)。
参 考 文 献
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Disruption of leucyl aminopeptidase gene affects phenotypes and
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Yan Yang, Lingen Luo, Miao Xu, Liqiu Xia*
Hunan Provincial Key Laboratory of Microbial Molecular Biology-State Key Laboratory Breeding Base of Microbial Molecular
Biology, College of Life Science, Hunan Normal University, Changsha 410081, Hunan Province, China
Abstract: [Objective] In order to investigate effects of leucyl aminopeptidase on mycelia morphology, growth rate,
spinosad yield and protein expression in Saccharopolyspora spinosa by disrupting its encoding gene pepA and
analyzing the characteristics of engineered S. spinosa. [Methods] The pepA gene of S. spinosa was amplified based on
the conserved sequence and cloned into Escherichia coli-Streptomyces shuttle vector pOJ260 to generate pOJ260-
pepA, which was transformed into S. spinosa by conjugation. Mycelium observation, SDS-PAGE and HPLC were
used to analyze the engineered strain. [Results] Mycelia in S. sp-ΔpepA displayed a much higher degree of
fragmentation and fewer branches compared to that of parental strain. Meanwhile, the growth rate of S. sp-ΔpepA was
retarded and its biomass was reduced. Shake-flask fermentation demonstrated that spinosad yield increased by 122%
in S. sp-ΔpepA strain compared to that of parental strain. SDS-PAGE analysis showed that protein expression profile
of the engineered strain significantly changed. [Conclusion] The pepA gene negatively regulates the biosynthesis of
spinosad and disruption of pepA gene could affect the mycelial morphology and growth of S. spinosa.
Keywords: Saccharopolyspora spinosa, pepA gene, disruption, spinosad, conjugational transfer
(本文责编：李磊)
Supported by the National High-tech R&D Program (2011AA10A203), the National Basic Research Program of China
(2012CB722301), the National Natural Science Foundation of China (31070006), the Project of Hunan Provincial Collaborative
Innovation Center (20134486) and by the Key Project of Hunan Provincial Education Department (10CY013)
*Corresponding author. Tel: +86-731-88872905; E-mail: xialq@hunnu.edu.cn
Received: 24 June 2015; Revised: 7 September 2015; Published online: 29 September 2015
642 Yan Yang et al. | Acta Microbiologica Sinica, 2016, 56(4)
actamicro@im.ac.cn