全 文 ：第３１卷 第３期
２０１２年　６月
华　中　农　业　大　学　学　报
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｈｕａｚｈｏｎｇ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
Ｖｏｌ．３１　Ｎｏ．３
Ｊｕｎｅ　２０１２，２９８～３０２
收稿日期：２０１１－０５－２９
基金项目：国家自然科学基金项目（３０８７００７３）
郭　航，硕士研究生．研究方向：链霉菌分子生物学．Ｅ－ｍａｉｌ：ｂｏｂｏ－ｈｅａｏ＠１２６．ｃｏｍ
通讯作者：陶美凤，研究员．研究方向：链霉菌分子生物学．Ｅ－ｍａｉｌ：ｔａｏ＿ｍｅｉｆｅｎｇ＠ｓｊｔｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
刺糖多孢菌鼠李糖和福乐糖胺
合成基因的克隆和组装
郭　航１　白亭丽１　陶美凤１，２
１．华中农业大学农业微生物学国家重点实验室，武汉４３００７０；
２．上海交通大学生命科学技术学院微生物代谢国家重点实验室，上海２０００３０
摘要　鼠李糖和福乐糖胺是多杀菌素生物合成必需的２个脱氧糖结构单元，负责其合成的４种酶的基因
（ｇｔｔ、ｅｐｉ、ｇｄｈ、ｋｒｅ）与多杀菌素生物合成基因簇并不在一起，而是分散分布在染色体的３个位点上。为克隆到完
整的多杀菌素生物合成基因簇，采用构建基因组文库、ＰＣＲ扩增等手段从刺糖多孢菌 ＮＲＲＬ１８３９５染色体分别
克隆ｇｔｔ、ｅｐｉ、ｇｄｈ和ｋｒｅ基因，并将其克隆组装在同一整合型载体上，以便于构建用于表达多杀菌素糖单元合成
基因的表达载体。
关键词　刺糖多孢菌；多杀菌素；鼠李糖；福乐糖胺；ｃｏｓｍｉｄ文库；原位杂交
中图分类号　Ｑ　７８　　文献标识码　Ａ　　文章编号　１０００－２４２１（２０１２）０３－０２９８－０５
　　多杀菌素（ｓｐｉｎｏｓｙｎｓ）是由放线菌刺糖多孢菌
（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｓｐｉｎｏｓａ）ＮＲＲＬ１８３９５发酵产
生的无公害高效杀虫剂，属大环内酯类化合物，制剂
中主要成分为多杀菌素组份Ａ和Ｄ的混合物，因此
又称为ｓｐｉｎｏｓａｄ［１］。多杀菌素最早于１９９７年在美
国登记注册，开始应用于棉花和蔬菜；２００５年，多杀
菌素经批准被用于７３个国家的２５０多种农作物上，
在我国商品名为菜喜（２．５％悬浮剂）和催杀（４８％悬
浮剂）［２］。多杀菌素的母核是由１个５，６，５－顺－反－
顺三环和１个十二元的内酯环粘合而成，并通过糖
苷键连接着２个不同的脱氧糖，其中１个是氨基糖
二甲基福乐糖胺（ｄｉｍｅｔｈｙｌ－ｆｏｒｏｓａｍｉｎｅ），另１个是
中性糖α－Ｌ－鼠李糖（Ｌ－ｒｈａｍｎｏｓｅ）。多杀菌素生物
合成的必需基因已经克隆测序，大部分基因聚集形
成１个巨大的多杀菌素生物合成基因簇（ｓｐｎ基因
簇，８０ｋｂ）［３］。但是，２个脱氧糖单元合成所必需的
４个基因不在基因簇中，而是分散位于染色体的３
个不同位置，其中 ＮＤＰ葡萄糖脱水酶基因（ｇｄｈ）
和酮还原酶基因（ｋｒｅ）组成１个操纵子，ＮＤＰ葡萄
糖合酶基因（ｇｔｔ）和３′，５′－表异构酶基因（ｅｐｉ）分别
独立存在［４］。
鼠李糖和福乐糖胺合成过程中，ｇｔｔ（编码ＮＤＰ－
葡萄糖合成酶）、ｇｄｈ（编码葡萄糖脱氢酶）催化葡萄
糖－１－磷酸生成ＮＤＰ－４－酮－６－脱氧－Ｄ－葡萄糖，作为鼠
李糖和福乐糖胺合成的必需中间体，ｅｐｉ（编码３′，
５′－表异构酶）和ｋｒｅ（编码４′－酮还原酶），将ＮＤＰ－４－
酮－６－脱氧－Ｄ－葡萄糖转化为α－Ｌ－鼠李糖。ｅｐｉ、ｇｔｔ、
ｇｄｈ－ｋｒｅ的缺失突变体不产多杀菌素，同时突变体
生长情况也比野生型差［４］。多杀菌素产生菌刺糖多
孢菌菌株的遗传操作非常困难，使得旨在优化多杀
菌素结构以及高产育种的基因工程改造困难重
重［５］。将生物合成基因转到异源宿主进行表达，并
在异源表达宿主中开展组合生物合成和高产育种工
作中成为理性的替代策略［６－７］。本研究克隆了鼠李
糖和福乐糖胺合成相关的４个基因，并将这４个基
因组合到１个链霉菌整合型载体，构建得到合成２
个脱氧糖单元的表达载体，为在异源宿主中表达多
杀菌素及其基因工程改造奠定基础。
１　材料与方法
１．１　试验材料
１）菌株和质粒。所用菌株和质粒见表１。
２）克隆引物设计。引物序列见表２。
３）培养基。大肠杆菌培养用ＬＢ培养基［８］：胰
蛋白胨１０ｇ，酵母抽提物５ｇ，ＮａＣｌ　５ｇ，补加蒸馏水
至１Ｌ，ｐＨ　７．０；刺糖多孢菌产孢用ＹＤ培养基［１２］：
DOI:10.13300/j.cnki.hnlkxb.2012.03.003
　第３期 郭　航 等：刺糖多孢菌鼠李糖和福乐糖胺合成基因的克隆和组装 　
表１　菌株和质粒１）
Ｔａｂｌｅ　１　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｓｔｒａｉｎｓ　ａｎｄ　ｐｌａｓｍｉｄｓ
菌株或质粒Ｓｔｒａｉｎ　ｏｒ　ｐｌａｓｍｉｄ 特征Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ 来源或文献Ｓｏｕｒｃｅ　ｏｒ　ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ
刺糖多孢菌Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ 多杀菌素产生菌Ｐｒｏｄｕｃｅｒ　ｏｆ　ｓｐｉｎｏｓａｄ　 ＮＲＲＬ
大肠杆菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ
ＤＨ５α 基因克隆宿主菌Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｈｏｓｔ　ｓｔｒａｉｎ，Ｆ－ｅｎｄＡ１　ｒｅｃＡ１　ｄｅｏＲ　ｇｙｒＡ９６　ｒｅｌＡ ［８］
ＸＬ１－Ｂｌｕｅ　ＭＲ
Ｃｏｓｍｉｄ文库构建宿主菌 Ｃｏｓｍｉｄ　ｌｉｂｒａｒｙ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｈｏｓｔ　ｂａｃｔｅｒｉａ，Δ（ｍｃｒＡ）
１８３Δ（ｍｃｒＣＢ－ｈｓｄＳＭＲ－ｍｒｒ）１７３ｅｎｄＡ１ｓｕｐＥ４４　ｔｈｉ－１　ｒｅｃＡ１　ｇｙｒＡ９６　ｒｅｌＡ１　ｌａｃ
Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ
质粒Ｐｌａｓｍｉｄ
ｐＯＪ４４６
Ｃｏｓｍｉｄ文库构建载体Ｃｏｓｍｉｄ　ｌｉｂｒａｒｙ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ，１０．４ｋｂ，ａａｃ（３）Ⅳ，
ｃｏｓ　ｓｉｔｅｓ
［９］
ｐＭＳ８２
大肠杆菌链霉菌穿梭载体 Ｓｈｕｔｔｌｅ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｖｅｃｔｏｒ　ｏｆ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｎｄ
Ｅ．ｃｏｌｉ，６．７ｋｂ，ｈｙｇ，ｉｎｔ／ａｔｔｐ（φＢＴ１），ｏｒｉＴ
［１０］
ｐＩＪ２９２５ 大肠杆菌载体Ｅ．ｃｏｌｉ　ｖｅｃｔｏｒ，２．７ｋｂ，ｂｌａ，ｌａｃＺα ［１１］
ｐＳＥＴ１５２
大肠杆菌链霉菌穿梭载体 Ｓｈｕｔｔｌｅ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｖｅｃｔｏｒ　ｏｆ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｎｄ
Ｅ．ｃｏｌｉ，５．５ｋｂ，ｉｎｔ／ａｔｔｐ（!Ｃ３１），ｏｒｉＴ（ＲＫ２），ｏｒｉ（ｐＵＣ１８），ａａｃ（３）Ⅳ
［９］
ｐＨＬ８０１　 ｇｔｔ克隆在ｐＧＥＭ－Ｔ　Ｅａｓｙ载体ｐＧＥＭ－Ｔ　Ｅａｓｙ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｇｔｔ　ｇｅｎｅ 本研究 Ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ
ｐＨＬ８０２　 ｅｐｉ克隆在ｐＧＥＭ－Ｔ　Ｅａｓｙ载体ｐＧＥＭ－Ｔ　Ｅａｓｙ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｅｐｉ　ｇｅｎｅ 本研究 Ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ
ｐＨＬ８０３
含ｇｄｈ－ｋｒｅ的～８ｋｂ的ＳｐｈⅠ片段连接在ｐＩＪ２９２５的ＳｐｈⅠ位点ｐＩＪ２９２５
ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ａ　８－ｋｂ　ＳｐｈⅠｆｒａｇｍｅｎｔ　ｏｆ　ｇｄｈ－ｋｒｅ
本研究 Ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ
ｐＨＬ８０４
ｐＨＬ８０１中含ｇｔｔ的片段连接在ｐＭＳ８２的ＳｐｅⅠ位点ｐＭＳ８２ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ
ＳｐｅⅠｆｒａｇｍｅｎｔ　ｏｆ　ｇｔｔ　ｆｒｏｍ　ｐＨＬ８０１
本研究 Ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ
ｐＨＬ８０５
ｐＨＬ８０２中含ｅｐｉ的片段连接在ｐＨＬ８０４的ＳｐｅⅠ位点ｐＨＬ８０４ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ
ＳｐｅⅠｆｒａｇｍｅｎｔ　ｏｆ　ｅｐｉ　ｆｒｏｍ　ｐＨＬ８０２
本研究 Ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ
ｐＨＬ８０８
ｐＨＬ８０３中含ｇｄｈ－ｋｒｅ 的 ＮｈｅＩ－ＨｉｎｄⅢ片段连接在 ｐＳＥＴ１５２的 ＮｈｅＩ－
ＨｉｎｄⅢ位点ｐＳＥＴ１５２ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ＮｈｅⅠ－ＨｉｎｄⅢｆｒａｇｍｅｎｔ　ｏｆ　ｇｄｈ－ｋｒｅ　ｆｒｏｍ
ｐＨＬ８０３
本研究 Ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ
ｐＨＬ８０９
ｐＨＬ８０８中含ｇｄｈ－ｋｒｅ的ＮｈｅⅠ－ＸｂａⅠ片段连接在ｐＨＬ８０５　ＳｐｅⅠ位点
ｐＨＬ８０５ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ＮｈｅⅠ－ＸｂａⅠｆｒａｇｍｅｎｔ　ｏｆ　ｇｄｈ－ｋｒｅ　ｆｒｏｍ　ｐＨＬ８０８
本研究 Ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ
　１）ＮＲＲＬ：美国农业研究菌种保藏中心 Ｕ．Ｓ．Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｓｅｒｖｉｃｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｅｃｔｉｏｎ．
表２　引物及其特征
Ｔａｂｌｅ　２　Ｐｒｉｍｅｒｓ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄ　ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ
引物Ｐｒｉｍｅｒ 序列Ｓｅｑｕｅｎｃｅ 用途 Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ
ｐＥｐｉｆ１　 ５′－ＧＡＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＴＴＣＡＣＣＡＧＣＡ－３′ 克隆ｅｐｉ基因
Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　ｅｐｉ　ｇｅｎｅｐＥｐｉｒ１　 ５′－ＧＡＡＣＴＡＧＴＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＴＧＴＧＡＡＡＴＣＣＣＴＣＧＧ－３′
ｐＧｔｔｆ１　 ５′－ＧＡＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＡＡＧＧＣＣＡＣＣＧＧＣＡＡＧＧＴＣＧＴＧＣＡＧＧ－３′ 克隆ｇｔｔ基因
Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　ｇｔｔ　ｇｅｎｅｐＧｔｔｒ１　 ５′－ＧＡＡＣＴＡＧＴＧＣＡＣＣＣＧＣＣＧＡＴＧＧＣＣＧＡＣＣＧＣＡＴＴ－３′
ｐＧＫ１ｆ ５′－ＧＧＡＴＣＣＴＧＣＴＴＣＧＴＡＧＣＴＣＧ－３′ 验证ｋｒｅ－ｇｄｈ
基因和制备探针
Ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ
ｋｒｅ－ｇｄｈ　ｇｅｎｅ
ａｎｄ　ｐｒｏｂｅ　ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ
ｐＧＫ１ｒ ５′－ＧＧＡＴＣＣＧＣＴＴＣＣＣＣＣＡＣＧＧ－３′
ｐＧＫ２ｆ ５′－ＴＣＣＴＧＣＴＴＣＧＴＡＧＣＴＣＧＧＴＧ－３′
ｐＧＫ２ｒ ５′－ＴＣＡＡＣＧＡＡＧＣＣＣＴＧＣＡＣＣＡＡ－３′
酵母抽提物４ｇ，麦芽糖１０ｇ，葡萄糖４ｇ，ＭｇＣｌ２
２ｇ，ＣａＣｌ２１．５ｇ，青岛琼脂１５ｇ，补加蒸镏水至１Ｌ，
ｐＨ　７．２。
４）抗生素与生化试剂。大肠杆菌培养中抗生素
使用质量浓度为：氨苄青霉素１００ｍｇ／Ｌ、阿泊拉霉
素５０ｍｇ／Ｌ、潮霉素Ｂ　５０ｍｇ／Ｌ。各种限制性内切
酶、ＤＮＡ连接酶和碱性磷酸酶为Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司产
品。ＤＮＡ聚合酶、ｄＮＴＰｓ、ＤＮＡ分子质量 Ｍａｒｋｅｒ
为 ＴａＫａＲａ公司产品。ＫＯＤ 高保真聚合酶为
ＴＯＹＯＢＯ公司产品。
１．２　试验方法
１）大肠杆菌ＤＨ５α化学法感受态制备、质粒转
化、ＤＮＡ操作等参考文献［８］进行。
２）链霉菌的培养与总ＤＮＡ 的提取。链霉菌菌
丝体培养、总ＤＮＡ提取参考文献［１１］。
３）基因组文库构建及Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交筛选文库。
基因组ｃｏｓｍｉｄ文库构建使用载体为ｐＯＪ４４６［９］，建
库方法参考ＳｕｐｅｒＣｏｓ１科斯质粒试剂盒（Ｓｔｒａｔａ－
９９２
　　 华 中 农 业 大 学 学 报 第３１卷　
ｇｅｎｅ）和ＣｏｐｙＣｏｎｔｒｏｌ　ＴＭＦｏｓｍｉｄ文库构建试剂盒说
明书（Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ）。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔ按照ＤＩＧ杂交试
剂盒说明书（Ｒｏｃｈｅ）。
４）Ｃｏｓｍｉｄ文库基因组覆盖率计算［８］。Ｎ＝ｌｎ
（１－Ｐ ）／ｌｎ（１－ｆ ），Ｐ，文库覆盖率，分数表示；ｆ，
插入片段大小占基因组的比例；Ｎ，所需要的克隆子
个数。
２　结果与分析
２．１　ｇｔ、ｅｐｉ的ＰＣＲ扩增及克隆
多杀菌素属大环内酯类化合物，根据多杀菌素
的化合物类型、合成途径以及宿主自身遗传背景，克
隆基因时选择保留其天然启动子；根据异源表达的
情况考虑是否使用其他链霉菌启动子。ＧｅｎＢａｎｋ
中，ｇｔｔ、ｅｐｉ包括天然启动子在内的完整序列已知，
因此根据ＧｅｎＢａｎｋ中的ｇｔｔ基因及其上下游序列
（ＡＦ３５５４６７）设计引物，一端引物设置ＸｂａⅠ酶切位
点，另一端设置ＳｐｅⅠ酶切位点，以便于后续的基因
克隆组装。以Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ　ＮＲＲＬ１８３９５总 ＤＮＡ 为
模板，ＰＣＲ扩增ｇｔｔ基因及其上游的天然启动子区。
将ＰＣＲ产物ＴＡ克隆到ｐＧＥＭ－Ｔ　Ｅａｓｙ载体，得到
ｐＨＬ８０１。同样，根据ｅｐｉ序列（ＡＦ３５５４６６）设计引
物，ＰＣＲ扩增并ＴＡ克隆得到ｐＨＬ８０２。测序验证
ｐＨＬ８０１和ｐＨＬ８０２中的ｇｔｔ、ｅｐｉ及上游启动子区
序列正确。
２．２　刺糖多孢菌ＮＲＲＬ１８３９５基因组文库构建及
ｇｄｈ－ｋｒｅ的克隆
　　刺糖多孢菌总ＤＮＡ用 ＭｂｏⅠ进行部分酶切，
跑胶回收４０ｋｂ以上的部分酶切总ＤＮＡ，ＣＩＡＰ去
磷酸化处理；载体 ｐＯＪ４４６用 ＨｐａⅠ完全酶切、
ＣＩＡＰ去磷酸化，纯化回收后再用ＢａｍＨⅠ完全酶
切，回收８．６ｋｂ片段。将总ＤＮＡ和载体连接、包
装、感染ＸＬ１－Ｂｌｕｅ　ＭＲ感受态细胞，挑取阿泊拉霉素
抗性的克隆２　４００个，得到刺糖多孢菌ＮＲＲＬ１８３９５
的基因组科斯质粒文库。随机挑选２０个克隆酶切
检查文库质量，插入片段平均３０ｋｂ。
根据ｇｄｈ－ｋｒｅ 序列（ＡＦ３５５４６８）设计引物，以
ＰＣＲ扩增产物作为分子探针进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交筛
选基因组文库，得到１０个科斯质粒克隆子７Ｇ１０、
８Ｅ９、８Ｅ１２、１１Ａ８、１３Ｃ８、１５Ｃ７、１８Ｃ５、１８Ｅ８、１８Ｇ９和
２４Ｇ６，用ＢａｍＨⅠ酶切制作酶谱，发现这些阳性克
隆互相重叠，形成一个重叠连锁群（Ｃｏｎｔｉｇ），如图１
和图２所示。用ＳｐｈⅠ酶切７Ｇ１０，回收包含ｇｄｈ－
ｋｒｅ的８．５ｋｂ片段，克隆到ｐＩＪ２９２５的ＳｐｈⅠ位点，
得到ｐＨＬ８０３，ＰＣＲ扩增验证含有ｇｄｈ－ｋｒｅ完整基
因。分别对两侧未知序列进行测序，ｐＨＬ８０３上插
入的总ＤＮＡ片段中ｇｄｈ基因上游ＤＮＡ＞１ｋｂ，显
然包含天然启动子区。
　Ｍ１：１ｋｂ　ｌａｄｄｅｒ；Ｍ２：λ／ＨｉｎｄⅢ；１～１０：阳性克隆ＢａｍＨⅠｄｉｇｅｓｔｅｄ
ｐｏｓｉｔｉｖｅｓ　ｃｌｏｎｅｓ，１：７Ｇ１０；２：８Ｅ９；３：８Ｅ１２；４：１１Ａ８；５：１３Ｃ８；
６：１５Ｃ７；７：１８Ｃ５；８：１８Ｅ８；９：１８Ｇ９；１０；２４Ｇ６．
图１　Ｃｏｓｍｉｄ文库ｇｄｈ－ｋｒｅ基因
阳性克隆的ＢａｍＨⅠ酶切图谱
Ｆｉｇ．１　ＢａｍＨⅠｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｍａｐ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｇｄｈ－ｋｒｅ
ｇｅｎｅ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｌｏｎｅｓ　ｆｒｏｍ　ｃｏｓｍｉｄ　ｂａｎｋ
图２　根据ｇｄｈ－ｋｒｅ基因阳性克隆的
ＢａｍＨⅠ酶切图谱排列得到的重叠连锁群
Ｆｉｇ．２　Ｃｏｎｔｉｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｌｏｎｅｓ　ｆｒｏｍ
ｔｈｅ　ＢａｍＨⅠｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｍａｐ
２．３　鼠李糖和福乐糖胺合成基因的组装
利用ＸｂａⅠ、ＮｈｅⅠ和ＳｐｅⅠ等３个限制酶产
生相同粘性末端的特点，依次将含有ｇｔｔ、ｅｐｉ和
ｇｄｈ－ｋｒｅ完整基因及启动子区的ＤＮＡ片段插入到
链霉菌整合性载体ｐＭＳ８２上，得到ｐＨＬ８０９。即将
ｐＨＬ８０１中含 ｇｔｔ的 ＸｂａⅠ－ＳｐｅⅠ 片段连接在
ｐＭＳ８２的ＳｐｅⅠ位点，得到ｐＨＬ８０４；将ｐＨＬ８０２中
含ｅｐｉ的 ＸｂａⅠ－ＳｐｅⅠ片段连接在 ｐＨＬ８０４的
ＳｐｅⅠ位点，得到ｐＨＬ８０５；由文库ｃｏｓｍｉｄ７Ｇ１０亚
克隆得到含ｇｄｈ－ｋｒｅ的～８ｋｂ的ＳｐｈⅠ片段连接在
ｐＩＪ２９２５的相应位点得到ｐＨＬ８０３，测序分析完整的
ｇｄｈ－ｋｒｅ包含在ＮｈｅⅠ－ＨｉｎｄⅢ片段（～３．５ｋｂ）中，
连接在ｐＳＥＴ１５２的相应位点，得到ｐＨＬ８０８；最后
００３
　第３期 郭　航 等：刺糖多孢菌鼠李糖和福乐糖胺合成基因的克隆和组装 　
将ｐＨＬ８０８中含ｇｄｈ－ｋｒｅ基因的ＮｈｅⅠ－ＸｂａⅠ片段
连接 在 ｐＨＬ８０５ 的 ＳｐｅⅠ 位 点，得 到 ｐＨＬ８０９
（图３）。ｐＨＬ８０９经酶切、ＰＣＲ及部分测序验证正
确。
图３　鼠李糖和福乐糖胺合成基因表达载体ｐＨＬ８０９
Ｆｉｇ．３　ｐＨＬ８０９，ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｆｏｒｏｓａｍｉｎｅ
ａｎｄ　ｒｈａｍｎｏｓｅ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｐａｔｈｗａｙ
３　讨　论
自首次从刺糖多孢菌发酵液中分离出来至今，
多杀菌素及其类似物由于杀虫效果好、环境友好、对
非靶标昆虫无毒等特点，在医疗卫生、农业生产、畜
牧业等方面得到广泛应用，效果显著［１３－１４］。多杀菌
素兼具生物农药安全性和化学合成农药速效性特
点，使其作为环保、高效的新型杀虫剂具有广阔的应
用前景，相关产品在美国分别于１９９９年和２００８年
２次获得美国“总统绿色化学品挑战奖”。多杀菌素
专利已过期，在我国多杀菌素的研发及产业化生产
将带来巨大的经济效益和社会效益［２］。因此，我国
相关科研和产业界也对多杀菌素开发一直有着浓厚
的兴趣，但由于菌种低产及遗传操作困难等原因，对
多杀菌素的研究仍处于实验室阶段，尚不具备工业
化生产的条件［２］。
考虑到刺糖多孢菌的遗传学操作存在巨大困
难，尝试在异源宿主内表达多杀菌素，通过对异源宿
主的代谢工程和遗传操作以实现高产多杀菌素，乃
至通过组合生物合成技术优化结构、合成新的结构
类似物，将是一个合理有效的策略。但是，由于多杀
菌素生物合成的部分必需基因与ｓｐｎ基因簇不在一
起，这些基因也必须克隆、组装并引入到异源宿主，
才能保障异源表达的成功。
根据基因序列特点，本研究分别采用构建基因
组文库和ＰＣＲ手段克隆鼠李糖和福乐糖胺合成的
４个基因。分别克隆到４个基因后，利用ＳｐｅⅠ、
ＮｈｅⅠ和ＸｂａⅠ酶切后产生相同粘性末端的特点依
次组装得到表达２个糖单元合成基因的表达载体
ｐＨＬ８０９。在ＧｅｎＢａｎｋ给出的ｋｒｅ－ｇｄｈ 序列中，结
构基因上游只有８８ｂｐ非编码序列［４］，因而不能肯
定是否包含基因转录和翻译及其调控所必需的功能
序列，因此采用建库的方法克隆包括上游必需功能
区的完整基因，以确保目的基因能够采用自身的天
然启动子进行表达。ｐＨＬ８０９还含有噬菌体ＢＴ１
的整合位点ａｔｔＰ和整合酶基因ｉｎｔ、潮霉素抗性基
因ｈｙｇ和广宿主接合质粒ＲＫ２的接合转移起始区
ｏｒｉＴ，从而可以方便地接合转移到各种候选的放线
菌异源表达宿主，并将组装后的２个糖单元合成基
因一起稳定整合到宿主染色体中的ａｔｔＢ整合位点
上，为多杀菌素的异源表达奠定基础。
要实现多杀菌素的异源表达，还需要将多杀菌
素合成基因簇ｓｐｎ导入表达宿主中。ｓｐｎ基因簇较
大，共有８０ｋｂ，至少２～３个科斯质粒才能囊括完整
的基因簇，在我们的基因组文库中也筛选到多个分
别包含部分ｓｐｎ基因簇的阳性克隆，进一步工作需
要采用ＲＥＤ／ＥＴ重组技术［１５－１６］将位于不同科斯质
粒的部分基因簇拼接起来。同时，我们也在尝试采
用细菌人工染色体（ＢＡＣ）载体将该ｓｐｎ基因簇克隆
下来。最后，分别将糖合成基因表达载体和完整
ｓｐｎ基因簇一起转到异源宿主，可望得到多杀菌素
的异源表达。在异源宿主的选择方面，模式菌株在
遗传背景、抗生素合成及其调控以及遗传操作等方
面研究得清楚［１７］，有较多成功经验可以借鉴。
参 考 文 献
［１］　ＴＨＯＭＰＳＯＮ　Ｇ　Ｄ，ＤＵＴＴＯＮ　Ｒ，ＳＰＡＲＫＳ　Ｔ　Ｃ．Ｓｐｉｎｏｓａｄ－ａ
ｃａｓｅ　ｓｔｕｄｙ：ａｎ　ｅｘａｍｐｌｅ　ｆｒｏｍ　ａ　ｎａｔｕｒａｌ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ　ｐｒｏ－
ｇｒａｍｍｅ［Ｊ］．Ｐｅｓｔ　Ｍａｎａｇ　Ｓｃｉ，２０００，５６（８）：６９６－７０２．
［２］　蔡恒，王燕，万红贵，等．刺糖多孢菌生产多杀菌素的研究进展
［Ｊ］．中国生物工程杂志，２０１１，３１（２）：１２４－１２９．
［３］　ＷＡＬＤＲＯＮ　Ｃ，ＭＡＴＳＵＳＨＩＭＡ　Ｐ，ＲＯＳＴＥＣＫ　Ｐ　Ｒ　Ｊ，ｅｔ　ａｌ．
Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｐｉｎｏｓａｄ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｇｅｎｅ　ｃｌｕｓｔｅｒ
ｏｆ　Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｓｐｉｎｏｓａ［Ｊ］．Ｃｈｅｍ　Ｂｉｏｌ，２００１，８：４８７－
４９９．
［４］　ＭＡＤＤＵＲＩ　Ｋ，ＷＡＬＤＲＯＮ　Ｃ，ＭＡＴＳＵＳＨＩＭＡ　Ｐ，ｅｔ　ａｌ．Ｇｅｎｅｓ
ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　ｓｐｉｎｏｓｙｎｓ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　ｙｉｅｌｄ　ｉｍ－
ｐｒｏｖｅｍｅｎｔ　ｉｎ　Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｓｐｉｎｏｓａ［Ｊ］．Ｊ　Ｉｎｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００１，２７：３９９－４０２．
［５］　ＭＡＴＳＵＳＨＩＭＡ　Ｐ，ＢＡＬＴＺ　Ｒ　Ｈ．Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｓａｃｃｈａｒ－
ｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｓｐｉｎｏｓａ　ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ　ｗｉｔｈ　ｐｌａｓｍｉｄ　ＤＮＡ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ｉｎ
１０３
　　 华 中 农 业 大 学 学 报 第３１卷　
ｖｉｔｒｏ　ｔｏ　ａｖｏｉｄ　ｈｏｓｔ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９４，１４０：１３９－
１４３．
［６］　ＢＡＬＴＺ　Ｒ　Ｈ．Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｎｄ　Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｈｏｓｔｓ　ｆｏｒ
ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆ　ｓｅｃｏｎｄａｒｙ　ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ　ｇｅｎｅ　ｃｌｕｓｔｅｒｓ
［Ｊ］．Ｊ　Ｉｎｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１０，３７：７５９－７７２．
［７］　ＮＧＵＹＥＮ　Ｋ　Ｔ，ＲＩＴＺ　Ｄ，ＧＵ　Ｊ　Ｑ，ｅｔ　ａｌ．Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎａｌ　ｂｉｏｓｙｎ－
ｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　ｎｏｖｅｌ　ａｎｔｉｂｏｔｉｃｓ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｔｏ　ｄａｐｔｏｍｙｃｉｎ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ
Ａｃｉｄ　Ｓｃｉ，２００６，１０３：１７４６２－１７４６７．
［８］　ＳＡＭＢＲＯＯＫ　Ｊ，ＲＵＳＳＥＬＬ　Ｄ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
ｍａｎｕａｌ［Ｍ］．３ｒｄ．Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ：Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，
２００１．
［９］　ＢＩＥＲＭＡＮ　Ｍ，ＬＯＧＡＮ　Ｒ，Ｏ′ＢＲＩＥＮ　Ｋ，ｅｔ　ａｌ．Ｐｌａｓｍｉｄ　ｃｌｏｎｉｎｇ
ｖｅｃｔｏｒｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｃｏｎｊｕｇａｌ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｆｒｏｍＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ
ｔｏ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐｐ．［Ｊ］．Ｇｅｎｅ，１９９２，１１６：４３－４９．
［１０］ＧＲＥＧＯＲＹ　Ｍ　Ａ，ＴＩＬＬ　Ｒ，ＳＭＩＴＨ　Ｍ　Ｃ．Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ　ｓｉｔｅ　ｆｏｒ
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｈａｇｅ　ｐｈｉＢＴ１ａｎｄ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ
ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ　ｖｅｃｔｏｒｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，２００３，１８５（１７）：５３２０－５３２３．
［１１］ＫＩＥＳＥＲ　Ｔ，ＢＩＢＢ　Ｍ　Ｊ，ＢＵＴＴＮＥＲ　Ｍ　Ｊ，ｅｔ　ａｌ．Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ｓｔｒｅｐｔｏ－
ｍｙｃｅｓ　ｇｅｎｅｔｉｃｓ［Ｍ］．Ｎｏｒｗｉｃｈ：Ｊｏｈｎ　Ｉｎｎｅｓ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，２０００．
［１２］ＦＯＯＲ　Ｆ，ＲＯＢＥＲＴＳ　Ｇ，ＭＯＲＩＮ　Ｎ，ｅｔ　ａｌ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃ－
ｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃａｔｔｌｅｙａｔｅｍｐｅｒａｔｅ　ｐｈａｇｅ　ＴＧ１
［Ｊ］．Ｇｅｎｅ，１９８５，３９：１１－１６．
［１３］ＨＵＡＮＧ　Ｋ，ＸＩＡ　Ｌ，ＺＨＡＮＧ　Ｙ，ｅｔ　ａｌ．Ｒｅｃｅｎｔ　ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ
ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　ｓｐｉｎｏｓｙｎｓ［Ｊ］．Ａｐｐｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，
２００９，８２：１３－２３．
［１４］ＫＩＲＳＴ　Ｈ　Ａ．Ｔｈｅ　ｓｐｉｎｏｓｙｎ　ｆａｍｉｌｙ　ｏｆ　ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄｅｓ：ｒｅａｌｉｚｉｎｇ　ｔｈｅ
ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｏｆ　ｎａｔｕｒａｌ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｒｅｓｅａｒｃｈ［Ｊ］．Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｎｔｉ－
ｂｉｏｔｉｃｓ，２０１０，６３：１０１－１１１．
［１５］ＷＥＮＺＥＬ　Ｓ　Ｃ，ＧＲＯＳＳ　Ｆ，ＺＨＡＮＧ　Ｙ，ｅｔ　ａｌ．Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ　ｅｘ－
ｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｍｙｘｏｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｎａｔｕｒａｌ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ａｓｓｅｍｂｌｙ　ｌｉｎｅ　ｉｎ
ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄｓ　ｖｉａ　ｒｅｄ／ＥＴ　ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ［Ｊ］．Ｃｈｅｍ　Ｂｉｏｌ，
２００５，１２（３）：３４９－３５６．
［１６］季思思，朱义广，彭东海，等．苏云金芽胞杆菌质粒ｐ２６复制功
能区的克隆［Ｊ］．华中农业大学学报，２０１１，３０（５）：５５８－５６２．
［１７］ＢＥＮＴＬＥＹ　Ｓ　Ｄ，ＣＨＡＴＥＲ　Ｋ　Ｆ，ＣＥＲＤＥＮＯ－ＴＡＲＲＡＧＡ　Ａ
Ｍ，ｅｔ　ａｌ．Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ｇｅｎｏｍｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍｏｄｅｌ　ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅ
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ　Ａ３（２）［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，２００２，４１７：１４１－
１４７．
Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｈａｍｏｓｅ　ａｎｄ　ｆｏｒｏｓａｍｉｎｅ
ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｇｅｎｅ　ｏｆ　Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｓｐｉｎｏｓａ　ＮＲＲＬ１８３９５
ＧＵＯ　Ｈａｎｇ１　ＢＡＩ　Ｔｉｎｇ－ｌｉ　１　ＴＡＯ　Ｍｅｉ－ｆｅｎｇ１
，２
１．Ｓｔａｔｅ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，
Ｈｕａｚｈｏｎｇ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｈａｎ　４３００７０，Ｃｈｉｎａ；
２．Ｓｔａｔｅ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ　ａｎｄ　Ｓｃｈｏｏｌ
ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，
Ｓｈａｎｇｈａｉ　Ｊｉａｏｔｏｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　２０００３０，Ｃｈｉｎａ
Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｒｈａｍｎｏｓｅ　ａｎｄ　ｆｏｒｏｓａｍｉｎｅ　ａｒｅ　ｔｗｏ　ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ｄｅｏｘｙｓｕｇａｒｓ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ　ｏｆ　ｓｐｉｎｏｓａｄ．Ｆｏｕｒ
ｇｅｎｅｓ　ｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　ｒｈａｍｎｏｓｅ　ａｎｄ　ｆｏｒｏｓａｍｉｎｅ，ｉ．ｅ．ｇｔｔ（ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ＮＤＰ－ｇｌｕｃｏｓｅ　ｓｙｎ－
ｔｈａｓｅ），ｇｄｈ（ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ＮＤＰ－ｇｌｕｃｏｓｅ　ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ），ｅｐｉ（ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ｅｐｉｍｅｒａｓｅ）ａｎｄ　ｋｒｅ（ｅｎｃｏｄｉｎｇ　４′－ｋｅ－
ｔｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ），ａｒｅ　ｎｏｔ　ｌｏｃａｔｅｄ　ｔｏｇｅｔｈｅｒ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｓｐｉｎｏｓａｄ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｇｅｎｅ　ｃｌｕｓｔｅｒ，ｂｕｔ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ　ｉｎ　３
ｓｃａｔｔｅｒｅｄ　ｌｏｃｉ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　ｏｆ　Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｓｐｉｎｏｓａ　ＮＲＲＬ１８３９５．Ｔｏ　ｇｅｔ　ａｎ　ｉｎｔｅｇｒａｌ　ｓｐｉｎｏｓａｄ
ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｐａｔｈｗａｙ，ｔｈｅ　ｆｏｕｒ　ｇｅｎｅｓ　ｗｅｒｅ　ｃｌｏｎｅｄ　ｂｙ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ　ａｇｅｎｏｍｉｃ　ｌｉｂｒａｒｙ　ａｎｄ　ＰＣＲ　ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ
ｆｒｏｍＳ．ｓｐｉｎｏｓａ　ＮＲＲＬ１８３９５．Ｔｈｅ　４ｇｅｎｅｓ　ｗｅｒｅ　ｓｕｃｃｅｓｓｉｖｅｌｙ　ａｓｓｅｍｂｌｅｄ　ｉｎｔｏ　ａｎ　ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ　ｖｅｃｔｏｒ　ｔｏ　ｃｏｎ－
ｓｔｒｕｃｔ　ａｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　ｆｏｒ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　ｒｈａｍｎｏｓｅ　ａｎｄ　ｆｏｒｏｓａｍｉｎｅ　ｉｎ　ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ　ｈｏｓｔｓ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ　Ｓａｃｃｈｒａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｓｐｉｎｏｓａ；ｓｐｉｎｏｓａｄ；ｒｈａｍｎｏｓｅ；ｆｏｒｏｓａｍｉｎｅ；ｃｏｓｍｉｄ　ｌｉｂｒａｒｙ；ｉｎ　ｓｉｔｕ
ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ
（责任编辑：陆文昌）
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